1、生 物 工 程 實 驗（發酵工藝部分）生物工程教研室賈月梅目錄實驗一生物反應器操作技術- 2實驗二酸奶制作-11實驗三亞硫酸鹽氧化法測定溶氧系數KLa值-12實驗四酒精發酵培養基的制備-15實驗五酒精發酵-16實驗六酒精蒸餾及指標測定-18實驗一生物反應器操作技術實驗目的1.了解生物反應器的結構2.學會使用生物反應器(包括啟動、滅菌、裝料、取樣、清洗、關機)反應器的操作方法1、基本操作技術1.1結構 發酵罐由罐體系統、恒溫座、管閥系統及輔助設備組成.罐體系統 罐體系統包括：罐身、罐蓋、密封件罐身：由玻璃及不銹鋼組成罐蓋布局 1.排氣接口 2.溫度電極插口 3.PH電極插口 4.空氣接口 5.取

2、樣管接口 6取樣平衡口 7.接種口 8補料口 9備用口 10 傳感器接口 11 泡沫電極接口 控溫座罐閥系統 冷卻水電磁閥、溢流水閥、排氣排水閥、進蒸汽調節閥、氣路調節閥、膠管、接頭組成1.1. 4輔助設備 空氣壓縮機、蒸汽發生器等1.2安裝發酵罐應安裝在通風良好、空氣清潔的房間。將罐體與控制電箱放在平整的桌面上，調節水平垂直度連接進水、排水、空氣進氣管，固定。將攪拌電機、PH電極、DO電極消泡、測溫電極等與控制箱相連。安裝好地線，保證良好的接地。1.3開機與關機開機順序：先開電源總開關，再打開電腦控制系統電源開關關機順序：先關電腦控制系統電源開關，再關斷電源總開關。1.4裝料、裝料 將培養基

3、倒入發酵罐中，蓋好罐蓋。滅菌。2.參數設定與控制2.1電極的標定與維護PH電極的標定主菜單按F3進入標定， 按F1進入PH電極標定 畫面如下按F1溫度設為環境溫度，電極插入中性緩沖溶液如PH6.86緩沖液中，按F2輸入零點標定值6.86 Ctrl+F2PH零點標定開始，顯示“確認？”后按Enter鍵，PH標定開始待PH顯示值穩定后，按Enter鍵結束PH零點標定。然后擦凈電極。插入酸性或堿性溶液中如PH=4.00按F3 輸入斜率4.00Ctrl+F3PH斜率標定，同上。再標定零點，反復直至更換緩沖液時PH未經標定已達標準值（附近）即可。DO電極的標定按F2進入DO標定 畫面如下將DO電極拔出，

4、浸沒于飽和的亞硫酸鈉溶液中， 按F2輸入零點標定值1%Ctrl+F2 DO零點標定開始，顯示“確認？”后按Enter鍵，DO標定開始待PH顯示值穩定后，待電極顯示值穩定后標零點（一般用1%）按Enter鍵結束零點標定。按F3 輸入斜率100%Ctrl+F3DO斜率標定，顯示“確認？”后按Enter鍵，DO標定開始（以空氣為100%標定）待DO顯示值穩定后，按Enter鍵結束斜率標定。再標定零點，反復重復上述步驟12次。加酸泵的標定（可以隨時進行）先取一定液體，安裝好酸管按F3進入加酸泵標定 畫面如下按F1可以直接輸入加酸速率（ml/m）， 按F2輸入標定用標準容量100ml，將自動開關調為手動

5、位置，使泵運轉，等到管內空氣排出并已開始滴液，將出口的液體滴入標準容器100ml容量瓶中同時按F3 標定開始，顯示“確認？”后按Enter鍵，標定正式開始，此時以秒為單位計數，待輸出液到達設定的標準容量時，按F4鍵標定結束，此時，加酸速率便由控制器顯示出來，如計數時間為1200秒，加料速率自動顯示為5ml/m。也可不經標定直接輸入或修正。加堿泵、消泡泵、補料泵的標定同上。2.2參數設置與運行 本系統開機狀態直接進入過程參數畫面，按ESC鍵進入主菜單。畫面如下按F1進入過程參數模塊畫面如下按鍵進入第二副過程參數畫面，如下按鍵切到第一副過程參數畫面。2.2.1溫度參數 按F1進入溫度設置功能模塊畫

6、面如下按F1輸入或修改設定值按F2控制狀態切換，按手動、自動、順控次序顯示，在你選擇的方式出現“？”按Enter鍵方式轉換，按ESC鍵取消控制狀態切換，按原狀態控制。 按F3直接輸入手動輸出的百分比，不帶小數點。2.2.2 PH參數 除單位為PH外數據格式為××.××PH，（0100%）加堿，（-1000）加酸外，其他與2.2.1溫度參數相同。轉速參數 單位為rpm，手動輸出（0100%）其他與溫度相同溶氧參數 畫面如下按F1輸入或修正設定值F2控制方式切換F3溶氧串級參數切換：轉速或空氣（默認轉速）無須確認F4溶氧報警極限設定F5串級轉速輸出極限設定F

7、6串級空氣輸出極限設定空氣參數 單位為%，數據格式%××.××%，手動輸出為0100%，其他與溫度一樣。壓力參數 控制只有手動自動外，其他與溫度參數一樣。2.2.7消泡參數 畫面如下按F1輸入或修改消泡的控制周期，單位為秒，不能為0；F2輸入或修改消泡的脈沖，單位為秒，脈沖是指控制周期內動作的時間，不大于周期。F3控制方式切換，按手動、自動次序，在你要選擇的控制方式出現“?”后按Enter執行控制方式切換，如按ESC則取消控制方式切換即按原控制方式。“手動”表示不加泡沫。注意：泡沫狀態1表示有泡沫，此時自動狀態才起作用，0表示無泡沫，此時自動狀態不起作用

8、；補料參數 畫面如下：按F1：輸入或修改補料控制周期，單位為秒，不能為0； F2：輸入或修改補料控制脈沖，單位為秒，不大于周期： F3：補料控制方式切換，按手動一自動一順控，當顯示你要選擇的控制方式(顯示“?”)時，按Enter鍵確認，如按ESC取消控制方式切換，按原控制方式：F4：液位控制周期設置，單位為秒，秒，不能為0：F5：液位控制脈沖設置，單位為秒，秒，不大于周期：F6：液位控制方式切換，按手動 一白動，方式同上，手動表示不加料；以上參數按工藝要求調節，達到發酵溫度后對PH、DO電極校正。2.3初始化 畫面如下 按F1：輸入發酵批號，最多8個數子，不少于一個數字字符。如果不輸入批號，直

9、接按Enter鍵，則按日期自動生成批號。如080809表示8月8日上午9時。注意1此時再按F1進入批號查詢功能。2本罐如果在發酵或滅菌狀態時，按F1不起作用。2.4.發酵工作的開始與結束切換 如果本批號是新批號，則表示開始發酵，顯示“開始確認?”后，按Enter鍵確認，本批號正式開始發酵，此時如按 ESC則取消發酵開始： 如果本批號正在發酵，按F2則結束，顯示“結束確認?” 后，按Enter鍵確認發酵結束，此時如按ESC則取消發酵結束， 繼續發酵。滅菌工作的開始與結束切換，確認方法同F2：注意F2與F3鍵是互鎖的，即發酵時不能滅菌，滅菌時不能發酵。3.滅菌與發酵3.1滅菌前的準備工作校正pH電

10、極的零點(pH6.86)和斜率標定溶氧電極的零點將培養基倒入發酵罐中，蓋好罐蓋。將電極分別插入罐蓋上的對應的孔中并旋緊壓蓋。排氣管用紗布和牛皮紙包好。注意不得將排氣口堵死。卸下電極的插頭并蓋好插口或用牛皮紙包好。卸下空氣過濾器頂端的進氣膠管，且用夾子夾死過濾器與罐蓋空氣進口間的硅膠管，以防消毒時培養基倒流。夾緊取樣器出口的子，并放松連通取樣器頂端口與平衡口間硅膠管中的夾子。將控制pH用的酸堿液、消泡劑及其它的物料分便放入鹽水瓶中(裝量不得大于總容積的80)并連接好補液管和微孔過濾器(參見圖：補液管路裝配圖)，用紗布包好針頭。3.2滅菌鍋滅菌將發酵罐、鹽水瓶等放入滅菌鍋中，蓋好牛皮紙。注意：在滅

11、菌過程中，升溫和降溫速度不宜過快。3.3滅菌后擦干罐底，將發酵罐裝在基座上。取下各電極上的遮蓋物并連接好電纜。連接夾套冷卻水管道、冷凝器冷卻水管道。連接空氣管道(空氣過濾器進口與空氣進罐口)，放開過濾器下部的夾子，通過流量計上的針型閥調節流量，當空氣進入發酵罐內。駁去排氣管末端的牛皮紙(紗布可以保留)，調節空氣流量23升分鐘。將補液硅膠管裝在相應的蠕動泵上。開總電源開關，設定溫度、攪拌轉速，并將其切入自動控制狀態開攪拌馬達電源開關，開注水開關直至排水口無氣泡排出，關注水當溫度穩定在培養溫度，正常的空氣流量，標定溶氧電極的斜率為100%3.4接種、發酵接種 先準備好酒精、鑷子、棉手套等工具。調節

12、進氣量為5L/h旋松接種口,將酒精倒入接種口外的槽內，在火焰保護下，用專用手柄打開接種口，倒入種子，然后旋緊接種蓋。在主菜單畫面“初始化”中設定發酵批數并確認發酵開始，否則不記錄發酵數據。取樣 用夾子夾住取樣平衡管，用夾子夾住排氣管（允許有氣排出），打開取樣管上的夾子，由于罐內正壓發酵液從取樣管流出。取樣結束后，關閉取樣管夾子，放開排氣管和平衡管上的夾子。取樣前后要對取料口消毒。發酵過程中根據工藝要求可以對控制參數進行調整。3.5發酵結束在控制器上確認發酵結束，如有必要可將數據存盤，然后退出主菜單，按Ctrl+F6關閉控制程序。關閉攪拌馬達電源開關、主電源、關閉水源、氣源和總電源收集發酵液，清

13、洗發酵罐并在罐內放一定的水。實驗二 酸奶制作一、實驗目的 1熟悉酸奶發酵工藝過程。 2了解酸奶發酵過程中物質的變化。 3了解現行乳酸菌的使用方法，發酵工藝技術控制。 二、實驗材料純牛乳 活性乳酸菌 發酵杯 1000ml燒杯 PH計，砂糖 精密試紙4.06.6 10ml吸管 恒溫培養箱250ml三角瓶，堿式滴定管 鐵架臺，酚酞指示劑 0.1000N氫氧化鈉標準溶液 三、實驗原理 乳酸菌對牛乳中的某些組分進行一系列的代謝過程，產生乳酸等各種風味物質，使牛乳PH下降，形成具有酸奶獨特風味的凝固酸牛乳。 酸牛乳中的乳酸來源于乳酸菌對牛乳中乳糖的發酵。屬于同型乳酸發酵，它是通過EMP途徑代謝生成丙酮酸后

14、，由于大多數乳酸不具有脫羧酶，因此，丙酮酸不能脫羧生成乙醛，而在乳酸脫氫酶催化下（需要還原型輔酶），丙酮酸為受氫體被還原為乳酸。另外，乳酸菌中的酶系利用牛乳中乳糖、蛋白、脂肪等組分形成乳酸、少量的揮發性的脂肪酸和羥基化合物等構成啤酒特有的香味和口味。（主要香氣成分為乙醛、丁二酮和3-羥2-丁酮、丙酮及少量的乙醇和揮發性脂肪酸）。乳酸菌的品種，發酵工藝條件的控制會影響發酵副產物的數量差異，正是這種不同造成了酸牛乳之間風味的差異：因此選育優良的產香乳酸菌種，嚴格控制工藝條件是生產優質酸牛乳的關鍵。 四、實驗步驟 1菌種： 凍干粉 2測定鮮牛乳的滴定酸度和pH值，記錄。3牛乳加入6%砂糖，過濾，均質

15、，于85殺菌5min，冷卻到45接入乳酸菌種，于42發酵至凝乳PH4.7，冷卻至0后熟1224h，測定酸度，要求滴定酸度在70T以上。4. 接種后每1h測定一次PH（用試紙）記錄。 五成品檢測1. 感官檢測：合格產品 色澤，應呈均勻的乳白色或微黃色；滋味和氣味：具有酸牛乳固有的滋味和氣味；組織狀態，組織細膩均勻，允許有少量乳清析出。2. 用吸管準確吸取10ml酸牛乳，加入250ml三角瓶中，加入50100ml蒸餾水，加23滴酚酞指示劑0.1000N氫氧化鈉標準溶液滴定至終點，記錄消耗的ml數V1。牛乳酸度指每100ml酸奶消耗0.1000N氫氧化鈉標準溶液的ml數。牛乳酸度T=NV1÷

16、;0.1×100÷10 式中N氫氧化鈉標準溶液當量數 實驗中應注意事項1 殺菌時間不易太長，否則會影響產品顏色2 白糖應加水煮沸成糖水再使用。若有雜質，需經過過濾后再用。思考題：牛乳為什么會凝固? 酸度高后為什么有乳清析出？參考資料：1.中華人民共和國標準 酸牛乳GB2746-1999實驗三亞硫酸鹽氧化法測定溶氧系數KLa值一、實驗目的 通過實驗掌握亞硫酸鹽氧化法測定溶氧系數KLa值的測定方法。二、實驗材料 試劑與儀器1 試劑0.1M Na2S2O3標準溶液1000mL：稱取25g Na2S2O3·于500 mL燒杯中，加入300 mL新煮沸過的蒸餾水，待完全溶解

17、后，加入0.2g Na2CO3，然后用新煮沸過的蒸餾水稀釋至1000mL，保存于棕色瓶中，在暗處放置，10天左右后標定。0.05 MI2標準溶液1000mL：稱取13gI2和25gKI于200mL燒杯中，加少許蒸餾水，攪拌至碘全部溶解后，轉入棕色瓶中，加水稀釋至1000mL，塞緊，搖勻后放置過夜。0.2淀粉指示劑100mL：稱取0.2g可溶性淀粉，用少量水調成糊狀，溶于100mL沸水（蒸餾水）中，繼續煮沸至溶液透明。冷卻，貯于玻璃瓶中備用。（新配制）2 玻璃儀器吸管：2mL吸管9支，25mL吸管1支，洗凈、烘干；比色管：25mL，9支；碘量瓶：250mL，6支；酸式滴定管：50mL，3根；50

18、0 mL燒杯1個。3 碘量法測定Na2SO3濃度吸取一定的Na2SO3反應液與過量的碘作用生成Na2SO4，然后用標準Na2SO3溶液滴定剩余的碘，根據Na2SO3消耗的體積數，即可求得Na2SO3的濃度。Na2SO3 + I2 Na2SO4 + 2 HI （2）2 Na2S2O3 + I2 Na2S4O6 + 2NaI （3）三、.溶氧系數KLa值的測定原理 溶氧系數的測定方法有許多種，概括起來可分為三大類，即亞硫酸鹽氧化法、動態法和穩態氧平衡法。本實驗采用亞硫酸鹽氧化法。 以Cu2+作為催化劑，溶解在水中的氧能立即氧化其中的亞硫酸根離子，使之成為硫酸根離子： 2SO3 2- + O2 2S

19、O42- （1）若反應器中裝入亞硫酸鹽和少量催化劑銅離子（0.5M Na2SO3）水溶液，另加10-3M 的CuSO4），同時進行通風攪拌，則反應器中氧的傳遞和反應過程可表示為： 氣相O2 液相O2 2SO42- 2SO3 2-在常溫下，亞硫酸根離子的氧化反應是很快的，其反應速度遠大于氧的溶解速度，所以氧一經溶于氣相就立即被氧化（反映液中的氧濃度CO）。這樣溶氧速度就成了控制氧化反映的決定因素。通過測定反映液中亞硫酸根離子濃度的變化即可測定出溶氧速度。進一步即可計算出溶氧系數。四、實驗步驟 1.開機：7升自控機械攪拌反應器，裝入0.5 MNa2SO3溶液5升左右（無水Na2SO3315克），調

20、溫至25，加入10-3M的CuSO4（1.25克CuSO4 5H2O，配成30mL溶液），開攪拌攪勻（轉速300rpm左右），通氣，待風量穩定后（通風量10L/min），即可取樣測定。 2.取樣：用比色管取樣，取樣前，先用燒杯接反應液20mL左右棄去，然后正式取樣（取滿），并計時：15分鐘左右取第二次樣，再過15分鐘左右取第三次樣，準確記錄取樣時間。3 .試樣分析：用干凈移液管于取樣試管中吸取2mL反應液于裝有25mL標準0.05 MI2溶液的碘量瓶中，加水50mL，然后用標準Na2S2O3溶液滴定至淡黃色，加0.2淀粉指示劑5mL，此時溶液呈深蘭色，繼續用硫代硫酸鈉溶液滴定，至蘭色剛好消失。

21、每個樣品分析兩次取平均值，誤差不超過0.1mL。4.計算溶氧速率 （4） 式中：Na體積溶氧速率（Kmol/m3.h）V兩次取樣滴定硫代硫酸鈉溶液的體積差（mL）V0取樣分析液體積，V0=2 mLM標準硫代硫酸鈉溶液的濃度（Kmol/m3） t兩次取樣間隔時間，即氧化時間（s） 4換算系數，1molO2相當于4molNa2S2O3，由式（1）（3）有：1mol O22mol Na2SO3，1mol Na2SO31molI2，1molI22mol Na2S2O3，所以，1mol O24mol Na2S2O3溶氧系數 （5） （6） 式中：kLa體積溶氧系數（1/h） c* 氧在液相中的飽和溶氧濃

22、度，在該反應條件下，c*=0.21*10-3 KmolO2/m3 c反應液中的實際溶氧濃度，在亞硫酸鹽氧化法條件下，由于反應很快，而氧的溶解較慢，所以氧一經進入液相即被反應，實際上液相氧濃度c=0。 則： （7） 5.實驗結果 表1 溶氧實驗結果計算表 試驗日期反應液組成0.5M Na2SO3水溶液，另加10-3M的CuSO4試驗基本條件反應液體積： L反應溫度： 通風量： L/min攪拌轉速： r/min兩次取樣時間間隔（s）兩次滴定Na2S2O3體積差V（mL）Na2S2O3的溶液濃度（mol/L）體積溶氧速率Na（Kmol/m3.h）體積溶氧系數kLa（1/h）kLa平均值（1/h） 附

23、：0.1M硫代硫酸鈉標準溶液的標定 1.試劑固體K2Cr2O7基準物：取5克左右分析純固體K2Cr2O7于稱量瓶中，130140烘干2小時后，移入干燥器中備用。6MHCI，100mL。固體KI。0.2%可溶性淀粉，100mL。0.1M硫代硫酸鈉溶液，1000 mL（待標定）2.標定準確稱取K2Cr2O7基準物0.15克左右于250mL碘量瓶中，加水25mL，使之溶解后，加固體KI 2克，及6NHCI5mL，立即蓋好瓶塞，搖勻后用水封。在暗處放置5分鐘后，拔掉瓶塞，使瓶口水入瓶內，加水50mL，并用洗瓶吹洗碘量瓶內壁，用Na2S2O3溶液滴定至溶液呈淺黃色（或黃綠色）。加入5mL0.2%淀粉指示

24、劑，此時溶液呈深蘭色，繼續滴定至蘭色消失而變為Cr3-的綠色為止。3.計算MNa2S2O3溶液的摩爾濃度（mol/L）V滴定時所用Na2S2O3溶液的體積（mL）W基準物K2Cr2O7的重量（g）EK2Cr2O7的克當量，E=49.034.結果整理表2 硫代硫酸鈉溶液的標定結果 標定日期序號123K2Cr2O7的重量W（g）Na2S2O3的體積（mL）M=20.40 W/VM平均值（mol/L）實驗四酒精發酵培養基的制備一、 實驗目的學習并掌握淀粉水解糖的制備原理及其制備工藝，了解雙酶法制糖的操作工藝過程。掌握酒精培養基的配置方法二、 實驗原理工業生產上將淀粉水解為葡萄糖的過程稱為淀粉的“糖化

25、”，所制備的溶液稱為淀粉水解糖。淀粉水解糖液中，主要的糖類為葡萄糖。此外，根據水解條件的不同，尚有數量不等的麥芽糖、低聚糖等。淀粉水解糖液質量的高低直接關系到酒精的積累。常用的水解淀粉的方法有酸解法、酶解法、酸酶結合法。雙酶水解法是用專一性很強的淀粉酶及糖化酶將淀粉水解為葡萄糖的工藝。同時在整個水解過程中一部分葡萄糖發生復合反應和分解反應，影響葡萄糖的產率和生產成本。淀粉的水解反應式：(C6H10O5)n (C6H10O5)x C12H22O11 C6H12O6淀粉各種湖精麥芽糖葡萄糖三、 實驗材料與設備（玉米淀粉制糖）玉米淀粉，CaCI2, a-淀粉酶，碘溶液，糖化酶，尿素，純堿（Na2CO

26、3）,硫酸，玻璃攪拌棒，燒杯1000ml1個、500ml、250ml2個，恒溫水浴鍋，高壓滅菌鍋、溫度計、糖化計、量筒。四、 實驗步驟（一）淀粉水解糖的制備1、 加水拌料：采用12.53的加水比調漿，水溫6070拌料。如：稱取240g玉米淀粉，加水600mL2、液化：采用中溫蒸煮糊化工藝，并加入相當于淀粉含量0.3%的CaCI2作為淀粉酶的保護劑，中溫淀粉酶用量淀粉含量的0.2%，溫度8590，液化120分鐘。檢驗：（1）碘液變為棕紅色（2）糖度1020Be3、 糖化：降溫至60并調pH至4.6，按照150u/g淀粉的量加入糖化酶，糖化30分鐘。（二）培養基配置（自己設計培養基的配比）1、 取

27、淀粉水解糖液1000 mL燒杯中。2、 加入氮源尿素、硫酸銨、磷酸銨。一般C/N=100/0.22.03、 調pH4.75.0純堿（Na2CO3）,硫酸4、4、滅菌121，20分鐘。五：思考題1、 酶解法有何優缺點？六、實驗中應注意的問題1、加水拌料時用的水 溫水（6070）2、淀粉水解時水浴鍋的溫度設置，應以料液容器中的溫度為準。實驗五 酒精發酵實驗一、 實驗目的學習并掌握酒精發酵的操作工藝過程，了解酒精發酵過程中合成途徑。二、 實驗原理酒精發酵作用，是酵母菌把可發酵性的糖，經過細胞內酒化酶的作用，生成了酒精與CO2，然后通過細胞膜將這些產物排出體外。因為酒精發酵是在水溶液中進行，酒精是可以任何比例與水混合的，所以由酵母體內排出的酒精便溶于周圍的醪液中。酒精發酵葡萄糖酵母菌的酒化酶作用下生成酒精。三、 實驗材料與設備活性干酵母、蔗糖、天平、發酵培養基、調pH4.75.0純堿（Na2CO3）,硫酸，恒溫培養箱、電磁爐、鍋四、 實驗步驟 1 干酵母的活化： 取2克蔗糖放入100ml水中，燒開晾涼至25，稱取4克活性干酵母放入以上糖水