1、.超高效液相色譜法測(cè)定生長(zhǎng)抑素原料藥的含量摘 要： 建立快速，準(zhǔn)確，靈敏的測(cè)定生長(zhǎng)抑素原料藥的方法。方法 采用沃特世ACQUITY UPLC超高液相色譜系統(tǒng)，以磷酸（取磷酸11Ml，加水900 mL，用三乙胺調(diào)PH至2.3，用水稀釋至刻度1000）為流動(dòng)相，（A）乙腈 （B）梯度洗脫，流速：0.3ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm; 柱溫45；進(jìn)樣體積2L。結(jié)果 生長(zhǎng)抑素在0.0051492mg/ml0.12873mg /ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系（R2 = 0.9993），平均回收率（n=9）為99.1%。該檢測(cè)快速，準(zhǔn)確，靈敏度高，重復(fù)性好，為生長(zhǎng)抑素原料藥的質(zhì)量控制提供了一種快速準(zhǔn)確的方

2、法。關(guān)鍵詞：超高效液相色譜 生長(zhǎng)抑素原料藥 生長(zhǎng)抑素（Somatostatin）主要用于嚴(yán)重急性食道靜脈曲張出血、急性胃或十二指腸潰瘍出血、并發(fā)性急性糜爛性胃炎或出血性胃炎、胰、膽和腸瘺的輔助治療，胰腺手術(shù)后并發(fā)癥的預(yù)防和治療，糖尿病酮癥酸中毒的輔助治療1-3。超高效液相色譜法是一個(gè)新興的領(lǐng)域，Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng)也出現(xiàn)不久，目前已發(fā)表的應(yīng)用資料還很不足。與傳統(tǒng)的HPLC相比，超高效液相色譜法的速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍及1.7倍4。目前，UPLC多應(yīng)用于代謝組學(xué)分析及其他一些生化領(lǐng)域，在天然產(chǎn)物的分析方面運(yùn)用也逐漸興起，因?yàn)樵谶@些領(lǐng)域深入研究需要更高

3、的分析精度。使用超高效液相色譜法對(duì)天然產(chǎn)物分析，特別是藥物分析研究領(lǐng)域的發(fā)展將是一個(gè)極大的促進(jìn)5。本實(shí)驗(yàn)選擇采用超高效液相色譜法（UPLC）進(jìn)行生長(zhǎng)抑素原料藥含量的測(cè)定，為提升生長(zhǎng)抑素原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供方法依據(jù)。2 材料與方法2.1材料2.1.1儀器沃特世ACQUITY UPLC超高液相色譜系統(tǒng)，配置ACQUITY PDA檢測(cè)器及Empower2色譜管理軟件（Mitford，Boston，MA,USA），十萬(wàn)分之一電子天平（型號(hào)： XP 205），超純水制備儀（型號(hào)：arium 611UV），pH計(jì)（型號(hào)：PHS-3C）2.1.2 試劑 乙腈為色譜純（上海星可生化有限公司，批號(hào)：200912

4、112），磷酸為分析純（廣東光華化學(xué)廠有限公司，批號(hào)：20070123），三乙胺為分析純（東光華化學(xué)廠有限公司，批號(hào)：220081010），生長(zhǎng)抑素原料藥對(duì)照品（深圳市翰宇藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):20090101 含量:8.3% ），生長(zhǎng)抑素原料藥樣品（深圳市翰宇藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20090801）。2.2 方法色譜條件，美國(guó)沃特世ACQUITY 超高效液相色譜法系統(tǒng)，配置ACQUITY PDA檢測(cè)器，色譜柱：ACQUITY BEN C18(2.1mm×50mm.1.7m)流動(dòng)相A：磷酸（取磷酸11mL，加水900 mL，用三乙胺調(diào)PH至2.3，用水稀釋至刻度1000），流動(dòng)相

5、B:乙腈，進(jìn)樣體積：2L，流速：0.35mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm，柱溫：45。 洗脫程序：見(jiàn)表1表1 梯度洗脫程序時(shí)間（Min）流動(dòng)相A()流動(dòng)相B()07.68.48.9796060792140402111.07921圖1 生長(zhǎng)抑素的UPLC色譜圖3結(jié)果3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線3 結(jié)果3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線取生長(zhǎng)抑素原料藥對(duì)照品12.873mg(精密稱定，含量88.3%)，置50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密吸取0.2、 0.4、 1.0、 2.0、 3.0、 5.0mL 轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，分別制成濃度為0.0051492 0.0102984 0.02574

6、6 0.051492 0.077238 0.12873mg/mL的對(duì)照品溶液。用上述超高效液相色譜法色譜條件進(jìn)行測(cè)定，考察線性關(guān)系。結(jié)果顯示，UPLC的回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為y = 2E+07x-36684, R2 = 0.9993，線性良好。見(jiàn)表2表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果y = 2E+07x - 36684R2 = 0.99930500000100000015000002000000250000000.050.10.15系列1線性 (系列1)3.1 系統(tǒng)精密度試驗(yàn)取生長(zhǎng)抑素原料藥對(duì)照品12.815mg(精密稱定，含量88.3%)，置250mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。制成濃度為0.05

7、126 mg/mL生長(zhǎng)抑素原料藥溶液。用上述UPLC超高效液相色譜法色譜條件 ,在一天內(nèi)連續(xù)測(cè)定六次.結(jié)果顯示,生長(zhǎng)抑素的峰面積的RSD為0.24，系統(tǒng)精密度良好，結(jié)果見(jiàn)表3表3 系統(tǒng)精密度考察結(jié)果（n=6）編號(hào)峰面積平均峰面積RSD(%)18587108571520.24285605838576704860163585509768552143.2 回收率試驗(yàn)取生長(zhǎng)抑素原料藥樣品三組，每組三份，第一組：8mg；第二組：10mg；第三組：12mg。具體為第一組：8.56mg、8.58mg、8.61mg。第二組：10.01mg、 11.2mg、10.98mg。第三組：14.42mg、13.66mg

8、、15.23mg。分別置入200 mL容量瓶，定容至刻度，搖勻。用上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,得出超高效液相色譜法平均回收率為99.1%，SD為1.7%。說(shuō)明準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見(jiàn)表4表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）稱樣量(mg) 含有量（mg） 測(cè)得量（mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD(%)8.56 7.71 7.69 99.88.58 7.72 7.67 99.3 8.61 7.75 7.51 96.910.01 9.09 9.06 99.711.12 10.01 9.96 99.510.98 9.88 9.83 99.514.42 12.98 13.01 100.213.66 12.2

9、9 12.32 100.315.23 13.71 13.57 99.299.1 1.73.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取生長(zhǎng)抑素原料藥樣品11.365mg (精密稱定，含量88.3%)，置250mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。制成濃度為0.05126 mg/mL生長(zhǎng)抑素原料藥溶液。用上述超高效液相色譜法色譜條件,在0h、4h、8h 、12h 、24h 、48h進(jìn)行測(cè)定，以生長(zhǎng)抑素的峰面積進(jìn)行考察，進(jìn)樣6次，測(cè)得RSD為0.5。表明，至少在48小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果如表5 表5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）編號(hào) 時(shí)間（h） 峰面積 平均峰面積 RSD（%）1 0 857403 2 4 8497163 8 85213

10、6 855584 0.54 12 8553715 24 8589136 48 8599673.4 重復(fù)性試驗(yàn)取生長(zhǎng)抑素原料藥樣品6份(分別為12.123g, 12.562g, 12.697g, 11.985g, 12.437g, 12.218g)置于250mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻。分別配成濃度為0.048492mg/mL，0.050248 mg/mL，0.050716 mg/mL，0.04794 mg/mL，0.049748 mg/mL，0.048872 mg/mL的生長(zhǎng)抑素原料藥溶液，在上述超高效液相色譜法的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，生長(zhǎng)抑素的平均含量為89.8%，RSD為0.7%

11、，重現(xiàn)性良好。結(jié)果如表6表6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）編號(hào) 含量（%） 平均含量（%） RSD（%）1 89.312 88.923 90.13 89.8 0.74 89.825 90.516 90.323.5 樣品測(cè)定3.5.1 取三批生長(zhǎng)抑素原料藥，分別為11.983g,12.685g,13.217g.溶于250mL的容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，制備成生長(zhǎng)抑素原料藥的溶液。用上述的超高效液相色譜法的方法，每個(gè)批次進(jìn)樣兩針，根據(jù)色譜圖的積分結(jié)果，得出生長(zhǎng)抑素的含量，結(jié)果見(jiàn)表7表7 UPLC法測(cè)定生長(zhǎng)抑素原料藥的含量樣品批號(hào) 峰面積 含量（%） 平均含量（%） RSD（%）20090801 85

12、1469 89.21849159 89.1320090902 948697 90.52 90.14 0.8956872 90.6620091101 986544 91.11 981309 90.213.5.2 取與上述相同批號(hào)的三批生長(zhǎng)抑素原料藥，按照中國(guó)藥典2010版第二部中的方法,用HPLC進(jìn)行測(cè)定。條件如下：色譜條件，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑：以磷酸溶液（取磷酸11mL，加水900mL，用三乙胺調(diào)PH至2.3，用水稀釋至刻度1000）-乙腈（色譜純）為流動(dòng)相，HPLC：Waters 2695 配置Waters 2489 UV/visible Detector，色譜柱：Welch M

13、aterials XB-C18 5um, 4.6*250mm (100A) 流動(dòng)相A：磷酸（取磷酸11mL，加水900mL，用三乙胺調(diào)PH至2.3，用水稀釋至刻度1000搖勻）,流動(dòng)相B:乙腈，進(jìn)樣體積：10L，流速：1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm，柱溫：45 。洗脫條件（見(jiàn)表8）表8時(shí)間（Min）流動(dòng)相A()流動(dòng)相B()01820217960607921404021267921 圖2 生長(zhǎng)抑素的HPLC色譜圖測(cè)定結(jié)果（見(jiàn)表9、圖2）表9 HPLC法測(cè)定生長(zhǎng)抑素原料藥的含量樣品批號(hào) 峰面積 含量（%） 平均含量（%） RSD（%）20090801 3143407 90.6431798

14、32 90.7120090902 3201739 90.93 90.5 0.43098451 89.9220091101 3157923 90.623102573 90.32上述為UPLC和HPLC分別對(duì)三批生長(zhǎng)抑素原料藥的含量的測(cè)定結(jié)果，其中HPLC測(cè)定生長(zhǎng)抑素原料藥的含量的方法已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證6。用HPLC測(cè)定的生長(zhǎng)抑素原料藥的含量為90.5%，RSD為0.4%。用UPLC測(cè)得的含量為90.14%，RSD為0.8%，與HPLC測(cè)得的含量很接近，且RSD為0.8%，重復(fù)性較好。4討論本文建立ACQUITY UPLC-PDA系統(tǒng)檢測(cè)生長(zhǎng)抑素原料藥的方法，該方法的出峰時(shí)間僅為4分鐘，與HPLC的10分

15、鐘的出峰時(shí)間相比7，時(shí)間減少了60%，能夠快速的檢測(cè)生長(zhǎng)抑素原料藥的含量。本文所使用的UPLC方法中洗脫條件是從HPLC方法直接轉(zhuǎn)換過(guò)來(lái)，并嘗試過(guò)不同的流速，發(fā)現(xiàn)0.3ml/min的流速能達(dá)到要求,分離度、柱壓等均能符合實(shí)驗(yàn)要求，所以選用此流速作為本實(shí)驗(yàn)的流速。本文使用UPLC對(duì)生長(zhǎng)抑素原料藥通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，系統(tǒng)精密度、回收率試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、以及不同批號(hào)的樣品的測(cè)定。在系統(tǒng)精密度實(shí)驗(yàn)中得出生長(zhǎng)抑素的峰面積的RSD為0.24，表明系統(tǒng)精密度良好；在回收率試驗(yàn)中得出平均回收率為 99.1%，RSD為1.7%，表明系統(tǒng)的準(zhǔn)確度良好；在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)抑素原料藥樣品在0h4h

16、8h 12h 24h 48h的測(cè)定，以生長(zhǎng)抑素的峰面積進(jìn)行考察，進(jìn)樣6次，得出RSD為0.5，表明，至少在48小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定；在重復(fù)性試驗(yàn)中，用生長(zhǎng)抑素的含量測(cè)定考察，得出生長(zhǎng)抑素的平均含量為89.8%，RSD為0.7%，表明重現(xiàn)性良好；在不同批號(hào)的樣品的測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，分別用HPLC和UPLC對(duì)三批生長(zhǎng)抑素原料藥進(jìn)行測(cè)定，用UPLC測(cè)得的含量為90.14%，RSD為0.8%，與HPLC測(cè)得的含量很接近，且RSD為0.8%，重復(fù)性較好。與傳統(tǒng)的HPLC方法相比，在速度，準(zhǔn)確率，靈敏度方面具有明顯的提高8。另外，由于UPLC在出峰時(shí)間方面的縮短不僅節(jié)約了時(shí)間，提高了檢測(cè)的效率，還在很大的程度上節(jié)省了流動(dòng)

17、相的消耗，為使用單位在經(jīng)濟(jì)方面節(jié)約了不少。綜上所述,基于UPLC方法快速，準(zhǔn)確，靈敏以及低消耗的特點(diǎn)，它必將作為一個(gè)更好的方法而在含量檢測(cè)方面成為大眾的選擇。參考文獻(xiàn)1 中國(guó)藥典2010.第二部，生長(zhǎng)抑素,p166-167.2 陳建忠，孫慶龍. UPLC法測(cè)定烏藥中去甲異波爾定的含量J. 液相色譜質(zhì)譜通訊，2009,53：10-13.3 超高效液相色譜（UPLC）在中藥成分分析中的應(yīng)用及評(píng)價(jià)J. 液相色譜質(zhì)譜通訊，2009,53：5-6.4 Want EJ, Wilson ID, Gika H et al. Global metabolic profiling procedures for u

18、rine using UPLC-MSJ, Nature protocols, 2010, 5(6):1005-1018.5 Sterz K, Scherer G, Ecker J. A simple and robust UPLC-SRM/MS method to quantify urinary eicosanoidsJ, Journal of lipid research, 2012(Epub ahead of print).6 Wang C, Wang YG, Liang QD, Rang WQ, Gao Y. Analysis of chemical composition in the combination of monkshood and pinellia by UPLC/Q-TOFMS with multivariate statistical analysisJ, Yao Xue Xue Bao, 2010, 45(10):1301-1306.7 Zhang CY, Dong L, Chen SL, Xie CX, Chang DL. UPLC fingerprint for qual