1、畢業論文文獻綜述 多環芳燒降解菌的研究 摘要:多環芳煌(PolycyclicAromaticHydrocarbonsPAHs)是廣泛存在于環境中的一類持久性有機污染物，具有致癌、致突變特征，是由 2 個或 2 個以上苯環以線狀、角狀或簇狀排列組成的芳香族化合物。PAHs 水溶性差、辛醇鄴水分配系數 高，穩定性強，容易吸附在土壤表面，對人類健康和生態環境具有極大的危害，已經引起了各國環境學家的重視。生物修復技術(bioremediation)是目前最具有潛力的 PAHs 污染土壤修復技術， 其中微生物降解是去除環境中多環芳爛最主要的途徑， 迄今已分離到多種PAHs 降解菌，目前該領域研究存在的主

2、要問題是 PAHs 降解優良菌的篩選、鑒定以及降解特性的深化研究。 關鍵詞：多環芳姓:；有機污染物；微生物降解；降解菌篩選 多環芳(PolycyclicAromaticHydrocarbons,PAHs)是指由兩個或兩個以上苯環，以直鏈狀、角狀或用狀排列組成的化合物，是環境中普遍存在的持久性有毒有機污染物1。大量研究證實，多環芳姓:具有慢性毒性和致癌、致畸、致突變的 “三致”作用，引起各國環境科學工作者的廣泛關注2。美國環境署在 1979 年 將 16 種 PAHs 列入環境污染物優先監測的黑名單，中國政府列出的環境監測優先污染物中也包括了 7 種 PAHs,所以找到能有效降解 PAHs 的方

3、法是重要的環保課題，而微生物降解是當前學術界普遍認為去除 PAHs 的最主要途徑網。 目前，治理 PAHs 污染土壤的方法主要有物理修復、化學修復和生物修復4。物理化學修復具有成本昂貴、容易造成生態環境破壞的缺點，不適合大規模應用；生物修復技術(包括微生物修復和植物修復)因具有成本低、 無二次污染、 可大面積應用等獨特優點而越來越受到人們的重視；微生物-植物聯合修復，將微生 物修復與植物修復的優點相結合， 利用自然環境中植物根系對微生物生長的促進作用， 有效地提高 PAHs 微生物降解率， 所以植物與微生物二者的聯合作用對的降解研究已成為近年來新的研究熱點之一。 本文根據國際上最新的研究報道，

4、就多環芳姓:污染、多環芳姓:污染的微生物修復、多環芳姓:降解菌篩選、多環芳姓:降解菌鑒定等方面作一簡要綜述。 1、土壤多環芳燒污染 土壤是一個十分復雜的多相體系和動態的開放體系，其固相中所含的大量粘土礦物、有機質和金屬氧化物等能吸持進入其內部的各種污染物。當進入土壤的 超過它們的降解能力時， 產生顯著積累， 當累積量超過土壤自身的承受能力和允許容量時，就會造成土壤污染50 因此， 土壤多環芳爛污染是指由于人類活動將多環芳爛加入到土壤中，致使土壤中多環芳爛含量明顯高于其自然背景含量、并 造成生態破壞和環境質量惡化的現象。 1.1 土壤多環芳炫污染的來源 多環芳姓:大多是石油、煤等化石燃料以及木材

5、、天然氣、汽油、重油、有機高分子化合物、紙張、作物秸稈、煙草等含碳氫化合物的物質經不完全燃燒或在還原性氣氛中經熱分解而生成的，其來源可分為天然和人為兩種。 環境中多環芳爛的天然來源主要是陸地和水生生物的合成、森林和草原火 災、火山爆發等，在這些過程中均會產生 PAHSo 環境中多環芳爛的主要來源是人為源，人為源包括化學工業污染源、交通運輸污染源、生活污染源和其他人為源,其中化石燃料的燃燒是環境 PAHs 的主要來源6-7。在工業發達國家，人為地燃料燃燒是土壤 PAHs 的主要來源網。因此，近 100150 年來土壤 PAHs 的濃度在不斷增加，尤其是城市地區。嚴重污染區 PAHs 的存在與下列

6、工業行為有關： 化石燃料的汽化和液化； 利用化石燃料生產熱和電；焦炭生產；催化裂解；碳黑的生產和應用；煤焦油的生產和應用；原油及其衍生物的精練和分儲；木材的保護性處理和防腐劑生產；石油貯存、轉運、處理與應用；廢物傾倒和垃圾填埋；露天燃燒（垃圾、輪胎、塑料等）和焚化過程等9。 1.2 土壤多環芳炫污染的危害 PAHs 污染土壤、對環境具有危害性，是由于 PAHs 辛-醇水分配系數高，屬于脂溶性物質，對生物有致癌、致畸、致突變作用，且在環境中穩定存在。16 種 PAHs 優先監測物的一半以上都有致癌作用，其中苯并a在的毒性最高，PAHs 的生物毒性除苯并a在的致癌性外，其它 PAHs 貢獻了相當于

7、苯并a在等效致癌濃度毒性的 103%741%,PAHs 本身沒有毒，但當其通過食物鏈進入動物體內后會損傷生物血細胞 DNA,引起血細胞 DNA 鏈斷裂，改變遺傳物質的編碼信息； 還會上調線粒體編碼基因表達轉錄水平， 提高相應的抗氧化酶活性表達， 使得細胞活性氧分子量增加及細胞氧化損傷。隨著經濟的發展，我國幾個主要經濟區出 現了不同程度的 PAHs 污染， 有的區域污染已經很嚴重， 如長江三角洲江蘇無錫某鄉鎮土壤中 PAHs 總量為 10589500 仙 g/kg 主要為 4-6 環 PAHs,三環以上占 PAHs 總量的87.0%94.5%,其中四環就占到 PAHs 總量的 47.9%53.0

8、%10,按照王國慶11等對土壤中苯并 a 昆的致癌臨界濃度研究計算出農業用地臨界濃度為 282 仙 g/kg 和 28gg/kg,可以得出無錫地區土壤中 PAHs 對人體有更大的致癌性。 2、土壤PAHs污染的微生物修復 微生物具有氧化、還原、分離以及轉移和變換元素周期表中的大部分元素的能力。所謂的微生物修復就是利用微生物的上述能力去除和解毒土壤、底泥沉積 物和地下水中的污染物，從而使污染的土壤部分或完全恢復到原始狀態。 微生物降解多環芳炫的機理 多環芳爛的微生物降解難易度取決于化學結構的復雜性和降解酶的適應程度。不同的微生物對各類多環芳姓:有不同的降解能力（降解速率、降解程度），所以降解多環

9、芳姓:的途徑就有較大的差別。研究表明，微生物降解多環芳姓:一般有兩種方式12：一種是以多環芳爛為唯一碳源和能源； 另一種是將多環芳爛與其他有機質進行共代謝。 對于土壤中低分子量的三環和三環以下的多環芳爛類化合物，微生物一般采用第一種代謝方式；而大多數細菌對四環或四環以上的多環芳燒的礦化作用一般以共代謝方式開始， 真菌對三環以上的多環芳爛的代謝也多屬共代謝。 微生物降解 PAHs 的基本過程是： PAHs 通過兩種途徑進入微生物 （包括真菌和細菌）細胞中，一種是真菌氧化，真菌在其胞內酶細胞色素酶 CytP-450 作用下先將一個氧原子加到 PAHs 的 C-C 鍵上形成 C-O 鍵，然后再以同樣

10、的方式加入另外一個氧原子，從而生成芳爛氧化物， 芳爛氧化物在非酶促結構重組中失去一個氧原子變成酚類， 并在環氧化物水解酶作用下還原形成反-二醇；另一種是氧 分子在細菌雙加氧酶作用下同時將兩個氧原子加到 PAHs 上，將 PAHs 氧化成芳 姓:過氧化物，在芳姓:過氧化物上加 H 得到順-二醇，兩種過程產生的二羥基化合 物-順反二醇都代謝生成重要的中間產物鄰苯二酚，接著經過脫水等作用而使 C-C 鍵斷裂、苯環斷開，進一步代謝為檸檬酸循環的中間產物醛或酸，如琥珀酸、乙酸、丙酮酸和乙醛13。有氧氧化是 PAHs 降解的主要方式14,這些中間產物最終會在微生物細胞中被氧化分解為 H2O 和 CO2(圖

11、 2-1)。 圖 2-1 微生物氧化降解 PAHs 的過程15 Fig.2-1ProposedpathwayforthedegradationofPAHsbymicroorganism 土壤中能高效降解 PAHs 的微生物 許多細菌、真菌及藻類都具有降解以 PAHs 的能力。近年來分離到的 PAHs 降解菌主 要 包 括 芽 袍 桿 菌 屬(Bacillus) 、 分 枝 桿 菌 屬(Mycobacetirum) 、 諾 卡 氏 菌 屬(Nocardia)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)產堿/f 菌屬(Alcaligenes)、假單胞菌屬(Pseudomona4)6和黃桿菌屬(Fl

12、avobaterium)等細菌；真菌氧化芳香燒的能力是普遍的，在真菌中研究較多的是白腐真菌(Whiterotfungi)；盡管有些藻類能夠降解 PAHs,但由于其光能自養特性，降解能力較差，很難見到有關能夠利用 PAHs 或耐 PAHs 藻類的研究報告。 一般來說，隨著 PAHs 苯環數量的增加，其生物降解速率越來越低。許多微生物能以低分子量的 PAHs(四環以內)作為唯一的碳源和能源，并將其完全礦化。然而，對于高分子量的 PAHs,由于其化學結構的復雜性以及在水環境中的低溶解度，難以被微生物直接降解。研究表明，大多數細菌對四環以上的高分子量 PAHs 的降解是以共代謝(Cometabolis

13、m)的方式進行的；真菌對三環以上的以 PAHs 的代謝也屬于共代謝170 真菌+O2 彳、(非酶促結構重組O-葡萄糖甘 上I|AO-葡萄糖甘酸 OH 芳燒氧化物 H2O 環氧化物氧化酶 HO 反-二醇 OH OH 雙加氧酶 R 輔酶NADH+ 脫氫酶 R輔酶NADH+H OH OH 酚 胞色素酶4 CytP-450 單加氧酶 細菌+O2 R 多環芳燒 OH 順-二醇 鄰苯 R 3.PAHs降解菌的篩選與鑒定 PAHsPAHs 降解菌的篩選 微生物對有機污染物適應性的遺傳機制研究表明，微生物為了在污染地區環境中生存， 微生物之間可以發生水平基因轉移或在微生物的染色體內進行基因重排、 突變、 復制

14、，以形成能夠降解有機污染物的優勢菌，從而充分利用污染物作為其生長基質或形成共代謝。從長期受石油污染的土壤中分離、篩選出高效多環芳爛降解菌，是生物修復多環芳爛污染土壤的第一步，也是關鍵的一步，了解 其生物學特勝及降解能力， 是利用降解性微生物進行原位生物修復的必要理論基礎。 能夠降解多環芳姓:微生物包括真菌、細菌和放線菌。但許多真菌都是條件致病菌，許多絲狀真菌會產生大量抱子，引起人、牲畜和其他植物的病害，造成二次污染，而放線菌生長緩慢，土壤中數量、總生物量遠小于細菌。因此，分離篩選高效多環芳姓:降解細菌并研究其生物學特性，是本研究的基礎和條件。 傳統的方法是利用平板技術直接分離 PAHs 降解菌

15、18,這一方法由于其便于菌種分離的優點目前仍被廣一泛使用。Bas 讓 aen 等19利用皓-聚研復合膜這一可吸附 PAHs的載體來篩選具有 PAHs 粘著性的降解菌株，以期提高環境中那些被土壤或淤泥吸附的PAHs 的降解效率。伍鳳姬20以昆(pyrene)為多環芳姓:生物降解研究的模型物，從農田土壤中篩選出能以在為唯一碳源的降解菌株，并從中挑選 出降解效果最好的菌株 CP13,探究不同培養條件對該菌株降解在的影響； 采用蛋白質組學技術分析降解菌 CP13 在在誘導下的蛋白表達差異； 結合 GC-MS 對在降解中間產物的檢測結果，初步推導出 CP13 降解在的途徑。高闖等21從柴油污染土壤中篩選

16、分離出一株蔡降解菌 N-3,進行菌種鑒定及蔡雙加氧酶基因 (nah)驗證，并考察該菌對不同種類多環芳姓：(PAHs)的降解能力及降解過程中脫氫酶活性的變化。發現銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosaj)含有 nah 基因；對液體培養基中質量濃度為 50mg/L 的蔡、菲、慈、在、方降解 84h,計算出菌株N-3 對蔡、菲、慈、在、方的降解率。該菌不僅能有效降解蔡，且對其他種類 PAHs 也有一定降解作用。 隨著分子生物學的迅猛發展，基于特定 DNA 片段或核糖體 RNA 的檢測篩選技術已經逐漸成為一種選擇22-23,其關鍵在于 PAHs 降解途徑中重要降解酶的基因序列的測定，

17、這些基因片段有可能成為環境中以 PAHs 降解菌的篩選探針。 PAHsPAHs 降解菌的鑒定 PAHs 降解菌的鑒定方法包括結合形態學、 生理生化和分子生物學 3 方面對該菌株進行鑒定。通過電子顯微鏡觀察菌體形態。分子生物學鑒定采用 16SrDNA 全長基因序列分析和構建系統發生樹：平板劃線得到降解菌單菌落，挑取單菌落進行 PCR 擴增。引物：上游引物27F(5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3和下游引物1492R(5-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3 。 )PCR 反 應 條 件 為 ： 94C5min；94C1min,55C1min,72C2min,35 個循環

18、；72C10min。根據常見細菌系統鑒定手冊24對該菌株做進一步的生理生化鑒定。 唐婷婷25采用測定液體培養基中 Abs 法來確定微生物對三種多環芳姓的降解作用，所選用的微生物是從汽車尾氣污染較嚴重的路邊土壤中采集分離而來。 通過以上將降解菌株的生理生化反應特性分析， 并與伯杰氏細菌鑒定手冊菌株特征比較之后， 將所研究兩種菌歸為假單胞菌屬中的熒光假單胞菌(Pseudomonas sp.),且其中與熒光假單胞菌的生物 I,生物 II 較為接近。降解菌株的生理生化特性見表 3.1 所不 表 3.1 降解菌株的生理生化特性 Table3.1Thephysiologicalandbiologicalc

19、haracterizationsoftheshtrains 菌株 項目 白色菌黃色菌 甲基紅 + +過氧化氫活性 + +蔗糖 + +葡萄糖 + +乳糖 - - wr + +檸檬酸鹽 + +后糕牛奶 - - 淀粉水解 - - 明膠液化 + +油脂水解 + +V.P 試驗 - +硫化氫實驗 + +鑒定結果假單胞菌屬 Pseudomonassp.假單胞菌屬 Pseudomonassp. 注：一+為陽性反應，防陰性反應 宋立超等26采用富集培養的方法，從 PAHs 污染鹽堿化土壤中分離出一株能以菲、在為唯一碳源和能源的優勢菌 TJB5。經形態觀察和 16SrDNA 序列分析結果表明該菌株為成團泛菌(P

20、antoeaagglomerans)采用液體培養的方法研究 pH、鹽度、 菲昆的初始濃度對 TJB5 菌株降解菲正效果的影響，確定最佳降解條件。結果表明：該菌對菲、昆的降解具有較廣泛的 pH、鹽度范圍和良好的降解效果。在菲、在濃度分別為 50mg/L、pH6.8-9.5、鹽度 2%-3%、溫度 30C 條件下，接種 15d 后菲降解率在 93.3%以上，陽$解率在 20%以上。 通常污染土壤中并不是一種微生物在降解 PAHs,因微生物種類不同，微生物細胞內所含酶系統有很多差別， 而 PAHs 的降解過程涉及多種芳姓的降解， 不同的階段所需要的細菌種類可能有差別， 所以 PAHs 的降解是不同微

21、生物間的一種協同作用共同來完成這一工程270 參考文獻 1陶雪琴，黨志，盧桂寧，等.污染土壤中多環芳爛的微生物降解及其機理研究進展.礦巖石地球化學通報，2003,22(4):134-139. 2TakuroKisa,TakeruOhkuma.BioremediationtechnologiesfortreatmentofPAH-contaminatedsoilandstrategiestoenhanceprocesssfficiency.RevEnvironSciBiotechnol,2006,5(4):347-374. 3王道瑋.沉積物中多環芳姓和多氯聯苯分析方法的建立及其應用研究D. 昆明

22、理工大學，2013. 4WangJ,ZhangZ,SuY,etal.PhytoremediationofpetroleumpollutedsoilJ.PetroleumScience,2008,5(2):167-171. 5黃春長，龐獎勵，陳寶群，等.扶風黃土臺堀全新世多周期土壤研究J.西北大學學報：自然科學版，2001,31(6):509-513. DongTTT,LeeBK.Characteristics,toxicity,andsourceapportionmentofpolycylicaromatichydrocarbons(PAHs)inroaddustofUlsanKorea.Ch

23、emosphere,2009,74(9):1245-1253. KhanA,IshaqM,KhanMA.Effectofvehicleexhaustonthequantityofpolycyclicaromatichydrocarbons(PAHs)insoil.EnvironMonitAssess,2008, 137(1-3):363-369. 8王桂山，仲兆慶，王福濤.PAHs(多環芳姓:)的危害及產生的途徑J.山東環境，2001(2):41-41. CottaJAO,RezendeMOO,LandgrafMD.Evaluationofsolventextractionbyultrasou

24、ndbyusinghighperformanceliquidchromatographyforthedeterminationofpolycyclicaromatichydrocarbonsincontaminatedsoilsJ.QumicaNova,2016,32(8):2026-2033. 10倪進治，駱永明，魏然，等.長江三角洲地區土壤環境質量與修復研究一一 V. 典型地區農業土壤中多環芳姓的污染狀況及其源解析J.土壤學報，2008, 45(2):234-239. 11王國慶，駱永明，宋靜，等.土壤環境質量指導值與標準研究 IV.保護人體健康的土壤苯并a在的臨界濃度.土壤學報，2007

25、,44(4):603-611. 12王慧，周海燕，黃勇，等.一株高環多環芳始降解嗜鹽菌 Thalassospirasp.的 分離及降解特性J.清華大學學報：自然科學版，2015(1):87-92. 丁克強，駱永明.多環芳爛污染土壤的生物修復.土壤，2001,33(4):169-178. Said1OB,UrrizaMSG,BourMEM.,DellaliM,AissaPandDuranR.Charac-terizationofaerobicpolycyclicaromatichydrocarbondegradingbacteriafromBizertelagoonsediments,Tunis

26、ia.JApplMicrobiol,2008,104(4):987997. J.V.Macias-Zamora,A.L.Melendez-Snchez,N.Ramirez-alvarezetal.OntheeffectsofthedispersantCorexit9500?duringthedegradationprocessofn-alkanesandPAHsinmarinesediments.J.EnvironmentalMonitoring&Assessment,2014,186(2):1051-1061. IsaacP,MartnezFL,BourguignonN,etal.I

27、mprovedPAHsremovalperformancebyadefinedbacterialconsortiumofindigenousPseudomonasandactinobacteriafromPatagonia,ArgentinaJ.InternationalBiodeterioration&Biodegradation,2015,101(3):23-31. YaoL,TengY,LuoY,etal.BiodegradationofPolycyclicAromaticHydrocarbons(PAHs)byTrichodermareeseiFS10-CandEffectofBioaugmentationonanAgedPAH-ContaminatedSoilJ.BioremediationJournal,2015,62(s3-4):207-212. KiyoharaH.,NagaoK.,YanaK.Rapidscreenforbacteriadegradingwater-insoluble,solidhydrocarbonsonagarplates.J.Applied&EnvironmentalMicrob