1、第一章 簡介凝膠電泳是每個做分子生物學的研究者天天都要打交道的基本技術。電泳之后的信息處理與電泳本身同樣重要。目前有大量軟件可以用于分析電泳結果，要向大家介紹的是Bio-Rad公司的1D凝膠分析軟件Quantity One（Bio-Rad還有一個做2D凝膠分析的軟件PDQuest）。Quantity One軟件是常用1D凝膠分析軟件中功能最強大，自動化程度最高的軟件。這個軟件的最新版本可以在Bio-Rad的網（http:/www.bio-）免費下載，以供試用或用戶升級之用。Quantity One軟件的主要功能包括定量分析(Volumes Quick Guide)，電泳條帶分析(Band An

2、alysis)，差顯分析(Differential Display Analysis)，克隆計數(Colony Counting Analysis)等，此外，還可以直接控制Bio-Rad公司的各類圖像儀和ExQuest自動切膠儀，使您的凝膠分析工作變得極為輕松。Quantity One軟件擁有與windows操作系統下絕大多數應用軟件相同的友好界面。插入密碼狗，打開Quantity One軟件，可以看到最上緣藍色橫條幅是標題欄，往下依次是菜單欄和工具欄。File圖像打開、保存、引入、打印等操作Match分子量估算、條帶匹配分析Edit圖像普通編輯操作Volumn定量分析View圖像縮放、三維視

3、圖、看光密度值等操作Analysis濃度估算、克隆計數等分析Image圖像旋轉、翻轉、裁切等操作Reports分析結果輸出Lane泳道分析Window窗口分析Band條帶分析Help幫助、快捷菜單、軟件注冊等          每個菜單的主要功能如下：往下一行是工具欄，上面每個按鈕的功能見下表：Quantity One軟件HelpàQuick Guide快捷指南提示如何實現一個功能，如定量分析(Volumes Quick Guide)，電泳條帶分析(Band Analysis)，差顯分析(Dif

4、ferential Display Analysis)，克隆計數(Colony Counting Analysis)等。快捷指南下有1，2，3步驟，根據提示完成。使用Quantity One軟件進行電泳結果分析，通常包括圖像獲取、圖像預處理、分析、結果輸出四部分。圖像獲取就是通過軟件控制掃描儀（GS-800、PharosFX等）或凝膠成像系統（GelDoc、ChemiDoc、VersaDoc等），圖像預處理就是將掃描或拍照獲得的原始圖像進行初步處理，以便更好地進行后續分析。接下來是分析過程，根據分析的方法和目的不同，又可以分為定量分析、條帶分析、克隆計數、差異（聚類）分析等等。不管如何分析，最

5、終我們都必須通過軟件的輸出功能，得到我們想要的結果。Quantity One軟件提供了多種結果輸出方式。在接下來的幾章里，我們將按照這個思路，一步步引導您使用這一軟件。第二章 圖像獲取Quantity One 4.44.6版本可以控制Bio-Rad目前幾乎所有的圖像儀，如GelDoc XR、ChemiDoc XRS等。這些圖像儀采集到的圖像，可以直接保存成軟件可直接分析的圖像，即擴展名1sc的原始圖像文件。下面將具體介紹如何通過Quantity One軟件從GelDoc XR獲取圖像。GelDoc XR是Bio-Rad凝膠成像系統中最常用，操作最簡便的儀器，它可以用來拍攝EB、SYBR Gre

6、en等染料染的核酸電泳凝膠；Sypro Ruby、銀染、考馬斯亮藍等方法染的蛋白電泳凝膠；以及化學顯色的印記膜等。使用GelDoc XR之前，先接通電源，打開位于儀器背面右下角的電源開關；然后根據具體的應用選擇合適的照明和濾光片位置。原則如下：表格形式模式1. 如果樣品是通過EB、SYBR Green、Sypro Ruby等染料通過紫外激發來顯色，就先將樣品置于紫外透射平臺(UV Transilluminator)的中間，關上暗箱門，然后按下面板上的“Trans UV”按鈕，并將濾光片選擇桿置于位置“I”處。模式2. 如果樣品是通過金屬銀、考馬斯亮藍等染料染色，就先將白光轉換屏 (White

7、Light Conversion Screen)取下，打開下部的開關，放在紫外透射平臺上，樣品置于白光轉換屏中間。關上暗箱門，然后按下面板上的“Trans White”按鈕，并將濾光片選擇桿置于位置“I”處。模式3. 如果是化學顯色等非透明可見樣品，則用模式2中所示方法，將樣品置于白光轉換屏中間。關上暗箱門，然后按下面板上的“Epi White按鈕”，并將濾光片選擇桿置于位置“O”處。 接下來打開Quantity One軟件，選擇FileGelDoc XR，按以下順序操作：  按下Live/Focus，成像儀進入實時成像； 選擇照明模式，一般核酸膠用UV,蛋白膠用White

8、模式； 注意，選擇完成后，要按下成像儀面板上相應的光源按鈕 此功能有三個上下鍵按鈕：IRIS（光圈），ZOOM（縮放），FOCUS（聚焦），您可在軟件上直接調節或在儀器面板上手工調節調節步驟：a 調大IRIS，以看到圖像 b 點ZOOM,將膠適當放大   c 調節IRIS至合適大小（一般情況下盡量選擇小光圈，因為小光圈景深大，圖像更清晰) d 調節FOCUS，至圖像最清晰按 按“Auto Expose”；如是，單擊Auto Expose,系統將自動選擇曝光時間成像，如不滿意，單擊Manual Expose，并輸入曝光時間（秒），圖像滿意后保存,在自動曝光期間，圖象

9、會持續的輸入到CCD中，直到達到一定比例的飽和象素值， 此比例在Options dialog box 中設定 (默認值 = 0.15)。 一旦圖象質量達到要求，點擊Freeze button 來終止曝光。 如是蛋白凝膠，接第6步直接將清晰的圖像保存即可 按下“Analyze”；這將會打開一個新的窗口來顯示捕獲的圖象，該圖象具有默認名稱，具有日期、時間及用戶名（如果已知的話）等信息。 按下“Save”鍵，保存圖像。第三章 圖像分析Quantity One的圖像分析功能相當強大，根據不同的需要，可以分為定量分析、條帶分析、相似性分析以及克隆計數(用于藍白斑篩選)等等，而且每種分析法都有獨

10、特的優點和輸出方式。本章重點介紹常用的定量分析和條帶分析方法，其余更細更深的功能請參考軟件自帶的用戶手冊。一定量分析（Volumn Analysis）定量分析是計算選定區域內信號強度的總和，是Quantity One最方便的定量工具。這種分析方式考慮選定區域的真實形狀，可用于電泳條帶、斑點、大型芯片等圖像的定量。這種定量的方法可以扣除背景，可以按照用戶的標準曲線計算出條帶或斑點的濃度，但它不能計算分子量，也不能進行條帶匹配和相似性分析。Quantity One軟件稱這類定量的結果為Volume。        Volume選

11、定區域內所有像素信號強度的總和×像素面積        Volume的單位：int×mm2快捷指南Volumes Quick Guide，能夠指導您對任意所選區域進行定量分析,此分析可以報告多種結果，常用的結果是相對濃度和絕對濃度（須提供標準品）。具體的操作方法如下：1選擇成像系統或打開已保存的文件(軟件可以控制Bio-Rad所有的成像系統如GelDoc,ChemiDoc,VersaDoc,GS-800,FX,如不是Bio-Rad成像系統所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff 1文件格式，軟件也可進行分析處理

12、)2Zoom Box，縮放，對圖象進行放大觀察3Transform轉化，調節圖象的對比度黑白4選擇待分析區域：Volumn Contour Tool等高線勾勒區域，自動連接濃度相同的點，如U1 Volume Free hand Tool自由畫筆選擇區域，可以勾勒出無規則形狀,如U2Volume Rect Tool 矩形區域選擇，如U3Volumn Circle Tool圓形選擇區域，如U4按上面4種方法選擇需要定量的區域。5雙擊所選區域，出現如下窗口，定義樣品類型，如未知樣品Unkonwn(U1,U2即待計算樣品)，背景Background(B1,B2，軟件在算濃度時會將此區域的濃度自動扣除)

13、 或標準樣品Standard（Std1,Std2, 如果該樣品是濃度標準樣品，即定量標準，需在濃度concentration一欄輸入該樣品的濃度）。6Select Tool選擇不同區域7Print Image打印圖像8Volume Analysis Report 定量報告結果，打開出現如下窗口，選擇要報告的參數，主要有2個參數Volume、adj. Vol. (即adjusted volume) 和Concentration。Volume為定量值，adj. Vol. 為扣除背景后的定量值，如有濃度標準樣品（Std），軟件可報告Concentration絕對濃度。參數選好后，按下按鈕“done”

14、。9軟件報告如下圖所示：按右側輸出按鈕，可將表格保存成txt文件，按左側打印按鈕，可將報告打印出來。二條帶分析（Band Analysis）條帶分析是Quantity One最基本的分析工具，它可以自動識別電泳泳道和識別條帶，依據泳道的平均光密度和條帶寬度對每個條帶進行模式化定量。這種分析方式雖然不如定量分析來得方便，但這樣可以實現非常復雜的電泳分析，滿足各種不同的結果需要。這種方式的最大優點在于它可以完全拋棄人為主觀因素而進行全自動定量。用條帶分析的方法進行定量的結果叫Trace Quantity（Trace Qty），計算方法是：首先軟件自動計算條帶上每一橫排像素的平均光密度和平均光密度分

15、布曲線，然后每個具體條帶的定量值是平均光密度曲線的線下面積的積分，即：Trace Quantity平均光密度×條帶上下邊界的距離Trace Quantity的單位：OD*mm下面介紹用此功能對泳道內的所有條帶進行分子量確定，相對濃度分析    1打開已保存的文件(如不是Bio-Rad成像系統所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff 1文件格式，軟件也可進行分析處理)2Zoom Box，縮放，對圖象進行放大觀察3Transform轉化，調節圖象的對比度黑白4確定泳道(lane),并對泳道進行各種調整（實際實驗中泳道往往不是垂直的而出現各種變形）。按下圖所示在軟件

16、的工具欄中有一Lane Tool圖標，包含有更多泳道編輯工具。5選擇Frame Lanes，輸入圖像實際泳道(lane)數并確認。此時圖像上泳道的位置上會出現一條條紅線，每條紅線就代表一根泳道。6選擇Add/Adjust Anchors，此時泳道紅線上會出現一些小圓圈。這些小圓圈稱為錨定點(anchor)，錨定點規定了泳道走向。當泳道不直時，點擊出現彎曲的泳道部位，就可以增加錨定點。鼠標按住錨定點，可以拖動錨定點，讓每根紅線始終位于泳道的中間線上。7Lane Background去除泳道背景。點擊該按鈕，選擇一條適當的泳道點擊之，然后在彈出的對話框中選“All Lane On”，在“Rolli

17、ng Disk Size”中填入適當的數值1。 8Detect Band，檢測泳道內的條帶，打開出現如下窗口。通過調節sensitivity靈敏度可調節檢測出的條帶數，調節Lane Width使代表表帶的紅色橫線與條帶寬度差不多寬。中間一行人工編輯按鈕可以用來增加/減少條帶、調節條帶的上、下邊界等。打開工具欄中Band Tool條帶編輯工具包可看到更多編輯工具（如上圖）9. Standard輸入分子量標準，軟件自帶有許多Bio-Rad的分子量標準，如你用的是自己的標準，進入New Standard建立新的分子量標準，軟件可以選擇標準單位是MW（蛋白質）還是BP（核酸）等（左下圖）。在

18、Protein-Standard對話框中輸入分子量數值，完成后單擊賦值圖標（右下圖），回到圖象文件上單擊標準樣品的泳道，軟件自動將所輸的分子量數值和泳道內的條帶一一對應。10. Band Attribute條帶屬性，在完成第9步以后，軟件已自動計算出了其他未知條帶的分子量,打開band attribute選擇要報告的參數，這里我們選擇Molecular Weight，圖象上可以看到所有條帶的分子量（紅顏色標記），標準分子量為藍色標記。11. Print Image打印圖象12. All Lane Report所有泳道條帶結果報告。打開窗口，選擇要報告的參數，如Mo

19、l.Wt.（分子量，如左下圖），軟件將報告結果（右下圖），在報告的右下腳有一報告輸出工具，點擊可將報告結果輸出成.txt文本格式或輸出至剪貼板，可粘貼到EXCEL，WORD等文件下。常見問題及處理：1 問：為什么我新買的Quantity One軟件幾天前還能用，現在只能使用最基本的功能了？答：可能是密碼未正確安裝，而試用期已過。2 問：為什么我重新安裝Quantity One軟件后就不能使用了？答：可能是安裝了超過版本限制的高版本Quantity One。3問：我的密碼狗還在，可密碼找不到了，我該如何填寫密碼？答：可以暫時將電腦連到Internet上，打開Quantity One軟件，選擇HelpRegisterChec