1、動物細胞培養的方法之 細胞冷凍保存技術細胞的低溫保存細胞的低溫保存o細胞低溫冷凍貯存是細胞培養的常規工作。細胞凍存與細胞低溫冷凍貯存是細胞培養的常規工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少人力、經費，減少污染，減細胞傳代保存相比可以減少人力、經費，減少污染，減少細胞遺傳性狀的改變和延緩衰老。少細胞遺傳性狀的改變和延緩衰老。o目前，動物細胞一般保存于液氮中目前，動物細胞一般保存于液氮中 （-196）。）。 一般在原代或傳代一般在原代或傳代210次內即次內即大量凍存，作為原種大量凍存，作為原種（stock cells），取一支細胞進行傳代繁殖，用畢再凍取一支細胞進行傳代繁殖，用畢再凍存，這樣可保證

2、長期使用和延緩衰存，這樣可保證長期使用和延緩衰老老 。 根據細胞冷凍液在在凍結后是否形成冰晶，低溫根據細胞冷凍液在在凍結后是否形成冰晶，低溫冷凍保存細胞可分為：冷凍保存細胞可分為： 1非玻璃化冷凍非玻璃化冷凍 細胞在冷凍過程中，細胞內和細胞外的水形成冰晶。細胞在冷凍過程中，細胞內和細胞外的水形成冰晶。 2玻璃化冷凍玻璃化冷凍 細胞在冷凍過程中，細胞內和細胞外的水不形成冰細胞在冷凍過程中，細胞內和細胞外的水不形成冰 晶，而是形成玻璃態。晶，而是形成玻璃態。非玻璃化冷凍非玻璃化冷凍原則：緩慢冷凍原則：緩慢冷凍原因原因：當溫度降低到冰點以下時，細胞內外的水分就會：當溫度降低到冰點以下時，細胞內外的水

3、分就會 形成冰晶。細胞內形成的冰晶會造成細胞膜和細形成冰晶。細胞內形成的冰晶會造成細胞膜和細 胞器的損傷。這種損傷稱為細胞內胞器的損傷。這種損傷稱為細胞內冰晶損傷冰晶損傷。 細胞外的水形成冰晶后，使得未結冰的溶液中的細胞外的水形成冰晶后，使得未結冰的溶液中的 電解質的濃度升高，細胞在這種高濃度的溶質中電解質的濃度升高，細胞在這種高濃度的溶質中 時間過長，會使細胞膜上的脂質受到損害，細胞時間過長，會使細胞膜上的脂質受到損害，細胞 膜破裂，這種損害稱之為膜破裂，這種損害稱之為溶質損傷溶質損傷。 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶，從而減少細胞內冰晶對細胞的損傷；相反，結晶很大，

4、大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。 在細胞凍存時加入冷凍保護劑，可以保護細胞免受冷凍損傷。 原理：1.常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，降低細胞的冰點 2.提高胞膜對水的通透性，促進細胞內水滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少冰晶對細胞的損傷；解凍時，促進細胞外水進入細胞內，緩解滲透性腫脹。 3.稀釋細胞內外未結冰溶液中的電解質，減少溶質損傷。解決辦法：解決辦法：冷凍保護劑的應用保護劑的應用在培養液中添加的保護劑：在培養液中添加的保護劑： 二甲亞砜二甲亞砜（Dimeethylsulfoide,DMSODimeethylsulfoide,DMSO），）

5、， 甘油甘油, ,可使細胞免受低溫冰晶形成、及滲透壓可使細胞免受低溫冰晶形成、及滲透壓改變而導致的物理損傷。改變而導致的物理損傷。 預先配制凍存預先配制凍存保護保護液：液： 含含20%血清培養基，血清培養基，10%DMSO，DMSO液用培養液用培養液配好，避免因臨時配制產熱而傷害細胞；液配好，避免因臨時配制產熱而傷害細胞；凍存和復蘇的原則：慢凍快融凍存和復蘇的原則：慢凍快融當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水

6、，細胞內不致產如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反，結晶很大，大結晶會造成細胞膜、生大的冰晶；相反，結晶很大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小細胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。凍存培養細胞凍存培養細胞 (1)(1)預保留細胞經消化分散后，用將其預冷卻，預保留細胞經消化分散后，用將其預冷卻，4 4度度 取對數生長期細胞，經胰酶消化后，加入適量凍存取對數生長期細胞，經胰酶消化后，加入適量凍存液液, ,用吸管吹打制成細胞懸液（用吸管吹打制成細胞懸液（1- 5 10

7、6細胞細胞/ /ml) )； 冷凍保護劑降溫時減少細胞內冰晶分子的形成，以冷凍保護劑降溫時減少細胞內冰晶分子的形成，以免對細胞造成傷害。免對細胞造成傷害。 (2)(2)加入加入1ml細胞懸液于凍存管中，在火細胞懸液于凍存管中，在火焰下封口。密封后標記冷凍細胞名稱和焰下封口。密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。冷凍日期。 可用帶有可用帶有18G針頭注射器進行分裝，針頭注射器進行分裝，如劑量過大，如劑量過大，保護劑對細胞滲透作用不勻，冷凍效果不好。保護劑對細胞滲透作用不勻，冷凍效果不好。 (3)(3)加保護劑的細胞懸液經緩慢冷凍，加保護劑的細胞懸液經緩慢冷凍，結冰產生在細胞外結冰產生在細胞外( (對

8、細胞沒有損傷對細胞沒有損傷) )。如果要長期保存，可以使用液氮罐，如果要長期保存，可以使用液氮罐， (4)(4)凍結好的凍存管放入液氮罐中。溫度達凍結好的凍存管放入液氮罐中。溫度達- -150-190 150-190 ，細胞幾乎處在停止狀態。，細胞幾乎處在停止狀態。 冷凍時帶手套操作，以免凍傷。冷凍時帶手套操作，以免凍傷。慢凍程序慢凍程序 標準程序： 當溫度在-25以上時， 12/min 當溫度達-25以下時， 510/min 當溫度達-100時，可迅速放入液氮中緩慢冷凍的簡化程序緩慢冷凍的簡化程序配置冷凍保護液配置冷凍保護液血清（一般血清（一般20%） 將冷凍液加入離心管，使將冷凍液加入離心

9、管，使 細胞濃度為細胞濃度為 26106cell/ml將冷凍液分裝到冷凍管中將冷凍液分裝到冷凍管中44冰箱放置冰箱放置30-60min-30-60min-20 -20 冰箱放置冰箱放置2小時小時（冷凍管放入凍存盒）（冷凍管放入凍存盒）-70-70冰箱放置冰箱放置1-21-2天天投入液氮罐投入液氮罐取旺盛生長的細胞取旺盛生長的細胞,消化后消化后用離心管離心回收細胞用離心管離心回收細胞在沒有程序控制凍存器設備的條件下在沒有程序控制凍存器設備的條件下, 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12的速 度，在40分鐘內降至液氮表面，停30

10、分鐘后，直接投人液氮中。-196-196液氮罐液氮罐普通冰箱普通冰箱低溫冰箱低溫冰箱解凍程序解凍程序原則：原則：快速解凍快速解凍原因原因：解凍緩慢時，原有冰晶溶化后，又會以新的晶核為解凍緩慢時，原有冰晶溶化后，又會以新的晶核為 中中 心形成更大的冰晶，稱為水的重結晶現象。但采心形成更大的冰晶，稱為水的重結晶現象。但采 用快速解凍可避免水分的重結晶減少冰晶損傷用快速解凍可避免水分的重結晶減少冰晶損傷。解凍程序解凍程序：從液氮中取出冷凍管，快速放入從液氮中取出冷凍管，快速放入37- 40水浴水浴 中，輕輕震搖，使凍存細胞盡快解凍（中，輕輕震搖，使凍存細胞盡快解凍（40-60s). 步驟步驟 從液氮取出凍存細胞，立即投入盛有從液氮取出凍存細胞，立即投入盛有38攝攝氏度溫水的容器內，搖