1、細胞與組織培養技術細胞與組織培養技術 動物細胞部分動物細胞部分實驗安排實驗安排：第九周 實驗一 動物細胞培養實驗的器材準備 實驗二 培養用液的配制及過濾除菌 第十周 實驗三 培養細胞的形態觀察 實驗四 動物細胞的傳代培養 實驗五 培養細胞的超低溫凍存第十一周 實驗六 凍存細胞的復蘇 實驗七 培養細胞的細胞計數與活性測定第十二周 實驗八 動物細胞的原代培養（大鼠骨髓間充質干細胞的培養）細胞培養細胞培養 是在體外模擬體內生理環境（溫度、pH值、營養條件等）使從體內取出的細胞生存、生長繁殖的技術方法。原代培養原代培養 又叫初代培養，是指從動物或人體內取出細胞，經過一定的處理和分離，置于適當的器皿或培

2、養基等條件下，培養至第1次傳代之前的細胞培養階段。P17傳代培養傳代培養 是指原代培養細胞在適應體外條件下后持續生長增殖，達到一定細胞密度后，需要將細胞從一個培養器皿以一定的比例轉移到另一個裝有新鮮培養基的器皿中的這樣一個過程稱為傳代培養。細胞培養的優點及不足之處原代細胞培養的生命歸宿 1.原代培養期原代培養期：有細胞分裂，不旺盛；原代培養細胞與體內原組織在形態結構和動能活動上相似性大；細胞群呈異質性 2. .傳代期傳代期：持續時間最長，細胞增殖旺盛 3.3.衰退期衰退期：細胞增殖緩慢或不增殖；細胞輪廓增強，最后衰退死亡培養細胞的生長方式 1.貼壁依賴型貼壁依賴型：必須貼附于支持物表面才能生長

3、，大多數培養細胞都屬于貼附生長型。 2.懸浮生長型懸浮生長型：見于少數造血系統腫瘤細胞，胞體呈圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長，這類細胞容易大量繁殖。培養過程中需定期搖勻，使細胞與培養基充分接觸。每代貼壁細胞的生長過程1.游離期游離期 細胞接種后在培養基中呈懸浮狀態，胞體呈圓形，持續時間約為10分鐘-4小時2.貼壁期貼壁期 細胞附著于培養介質上，游離期結束，細胞株一般在10分鐘-4小時貼壁，初代培養細胞貼壁慢，可長達24小時或者更多。3.潛伏期潛伏期 此期細胞有生長活動，少有細胞分裂，基本無增殖。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養基性質有關。細胞株潛伏期一般為6-24小時。4.對數生長期

4、對數生長期 細胞增殖最旺盛時刻，細胞數隨時間變化成倍增長，細胞活力最佳，是進行各種實驗的最佳時期。5.停滯期停滯期 細胞數量達飽和狀態，細胞雖有活力但不再分裂，細胞數量不再增加，應盡早傳代。發生機制：接觸抑制，密度依賴。培養細胞的生長條件1.營養需要：基礎培養基、血清、促生長及促粘附因子2.生存條件：溫度 370.5 氣體條件 5%CO2 pH值條件 7.2-7.4 滲透壓：等滲3.無污染4.無毒 實驗一 動物細胞培養實驗的器材準備實驗目的：實驗目的：1.了解動物細胞培養的潔凈要求，建立無菌操作的概念。2.掌握細胞培養實驗的材料準備過程。3.掌握動物細胞培養用液的配制和酸堿度調節方法。實驗原理

5、實驗原理：準備內容：1.實驗用品的洗滌、包裝和滅菌 2.準備酒精棉球，整理超凈臺 3.配制PBS KH2PO4 0.24g Nacl 8.0g KCl 0.2g NaHPO4 1.44g 加適量純水溶解，調節pH值至7.4，定容至1000ml實驗二 動物培養用液的配制及過濾除菌培養用液包括：培養基（需要添加血清） 消化液 平衡鹽溶液一、培養基 現在多采用合成培養基，其成分包括氨基酸、葡萄糖、維生素、無機鹽及一些促生長因子、促貼壁因子等。常用的有RPMI1640、DMEM等。二、血清 多使用胎牛血清或優質小牛血清三、消化液 常用的消化液有胰蛋白酶、EDTA以及膠原酶溶液，以胰蛋白酶使用最多。酶液

6、用于解離細胞間的蛋白質、膠原等，使細胞離散。EDTA是二價螯合劑，能結合鈣離子、鎂離子，使以來鈣離子的的鈣粘著蛋白失活而使細胞解離。四、平衡鹽溶液 如PBS、Hanks液等酚紅對pH值的指示： pH值6.5 黃色 pH值7.0 橘紅色 pH值7.4 紅色 pH值7.8 紫紅色細胞生長的最適pH值范圍：7.2-7.4實驗內容：1.濾器的安裝和消毒2.0.25%胰酶：0.25g胰蛋白酶溶于適量PBS中，調節pH值至7.6，定容至100ml，過濾除菌。3.1640基礎培養基的配制：1包（10.4g）溶于適量純水中，調節pH值至7.2-7.4，完全溶解后定容至1000ml，過濾除菌。4.1640完全培

7、養基的配制: 1640基礎培養基 85ml 血清 15ml 雙抗(青霉素和鏈霉素) 0.5ml實驗三 動物細胞的原代培養一（胰酶消化法） 實驗目的實驗目的1、了解動物細胞原代培養的基本方法和操作過程。2、了解原代培養細胞觀察的方法。實驗原理實驗原理 將動物機體的各種組織從機體中取出，經各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養。原代培養可分為組織塊培養法和消化法。 實驗步驟：實驗步驟：1.將大鼠頸椎脫臼處死，置醫用酒精中泡23分鐘，取大鼠帶入超凈臺內，置平皿中，解剖取肝臟，置于一新的平皿中。2

8、.用 Hanks液 洗滌三次，并剔除脂肪、結締組織血液等雜物。3.用一新的手術剪將肝臟剪成小塊，再用Hanks液 洗三次，轉移至50ml離心管中。4.視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37消化20-40分鐘，每隔5分鐘震蕩一次。5.加入3-5ml培養基以終止胰酶消化作用。6.靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到10ml離心管中。7.1000rpm離心10分鐘，棄上清液。8.加入Hanks液 5ml，重懸細胞，再離心一次，棄上清液。9.加入適量培養基，重懸細胞，轉移至培養皿中培養。注意事項注意事項 1、自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。 2、在超凈臺中，組織細胞、

9、培養液等不能暴露過久，以免溶液蒸發。 3、凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。 無菌操作的幾個注意事項無菌操作的幾個注意事項 1、操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。 2、點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。 3、操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。 4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。 5、瓶子開口后要盡量保持45斜位。 6、吸溶液的吸

10、管等不能混用。 實驗四 動物細胞的原代培養二（大鼠骨髓間充質干細胞的培養） 骨髓間充質干細胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)是存在于骨髓內的一種多能干結締組織前體細胞，具有多向分化潛能，在不同的誘導條件下能分化為軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、肝細胞、血管內皮細胞等。在胚胎發育過程中，軟骨、骨、肌肉、肌腱、脂肪、神經和髓基質等多種間充質組織由中胚層細胞分化而來，這些前體細胞具有干細胞特性而被定義為間充質干細胞(Mesenchymai stem ceiis，MSC)。骨髓間充質干細胞是骨髓中的非造血干細胞。 實驗步驟：實驗步驟：1.將大鼠頸椎脫臼處死，置醫

11、用酒精中泡23分鐘，取大鼠帶入超凈臺內，置平皿中，無菌條件下完整取出雙側股骨 。2.在另一平皿中倒入適量PBS，將股骨浸泡于PBS中，無菌條件下剔除肌肉和脂肪組織。 3.暴露股骨骨骺端，經PBS沖洗干凈后剪去兩端干骺端，暴露骨髓腔。4.用注射器吸取2ml 1640完全培養液沖洗骨髓腔，沖洗液收集在小燒杯中收集細胞，反復沖洗，直至沖出的液體發白為止。5.加入適量新鮮培養液，用吸管輕輕吹打制成細胞懸液，接種于培養皿內，置5% CO、37飽和濕度培養箱內培養。 實驗六 動物細胞的傳代培養實驗目的實驗目的掌握貼壁細胞傳代的方法。實驗原理實驗原理 細胞在培養瓶增殖到一定密度后，細胞的生長和分裂的速度就會

12、減慢甚至停止，如不及時分離、傳代，細胞將逐漸衰老死亡。為使細胞能繼續生長，同時也將細胞數量擴大，就必須進行傳代（再培養）。 傳代培養也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養細胞進行各種實驗的必經過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。 實驗步驟：實驗步驟： 1、在超凈臺內的酒精燈旁，將長滿細胞的培養瓶中原來的培養液棄去，加入37預溫的PBS，輕輕振蕩漂洗1-2次。 2、加入適量 0.25胰酶溶液，使瓶底細胞都浸入溶液中。蓋上瓶蓋，在37消化2-3min。 3、倒置鏡下觀察細胞。隨著時間的推移，原貼壁的細胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時將胰酶棄去，加入5ml培養液終止消

13、化。 觀察消化也可以用肉眼，當見到瓶底發白并出現細針孔空隙時終止消化。一般室溫消化時間約為13分鐘。 4、用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，分到另1瓶中，蓋上瓶蓋，在培養瓶上做好標記，（細胞種類、日期等）置37下繼續培養。 實驗七 培養細胞的超低溫凍存與復蘇實驗目的實驗目的掌握細胞凍存和復蘇的方法。實驗原理實驗原理細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。細胞在培養過程中，為防止細胞株不斷傳代引起的細胞老化、支原體污染、染色體和基因的變異等現象的發生，可以通過凍存技術保存細胞。在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變

14、、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞，減少冰晶的形成。目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的50，細胞仍能生長，活力受損不大。實驗步驟：實驗步驟：（一）細胞凍存1、超凈臺中消化細胞，將細胞懸液收集至離心管中。2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。3、沉淀加含保護液的培養基。4、將懸液分至凍存管中，每管0.8 ml。旋緊凍存管管蓋。5、在凍存管上標明細胞種類，凍存日期。6、按下列順序降溫：室溫4（20分鐘冰箱冷

15、凍室（30分鐘）低溫冰箱（30 1小時）氣態氮（30分鐘）液氮。（二）細胞復蘇1、準備一個茶缸或1000ml的燒壞，內裝2/3杯37的溫水。2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內融化。3、在超凈臺中用75%乙醇擦拭凍存管外壁并打開，用吸管將細胞懸液吸到離心管中。4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。5、沉淀加入適量培養液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。6、加適當培養基后將細胞轉移至培養瓶中，37培養。實驗八 培養細胞的細胞計數與活性測定實驗目的實驗目的1、掌握細胞計數的方法2、掌握細胞細胞活力測定的方法實驗原理實驗原理培養的細胞在一般條件下

16、要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數。計數結果以每毫升細胞數表示。細胞計數的原理和方法與血細胞計數相同。在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。用臺盼蘭染細胞，死細胞著色，活細胞不著色，從而可以區分死細胞與活細胞。細胞活性測定方法：1.染料排斥法：如臺盼蘭法，活細胞不著色，死細胞著色。2.FDA-PI雙色熒光鏡檢法：活細胞呈現黃綠色熒光，熒光越強，細胞活性越高；死細胞呈橘紅色熒光。3.MTT法：活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使四甲基偶氮唑鹽（MTT）分解產生蘭色結晶狀甲贊顆粒積于細胞內和細胞周圍。其量與細胞數呈正比，也與細胞活力呈正比。 4.Cell blue法：活細胞可將氧化還原染料刃天青轉化為紅色