1、藥物分析綜述題目：液相核磁共振聯用技術在中藥分析中的應用組員姓名：黃志華、竇文淵、彭啟柏所在學院： 藥科學院專業班級： 藥學05（5）班學號： 、日期：2008-6-2液相核磁共振聯用技術在中藥分析中的應用摘要: HPLC一NMR聯用技術是一種高效、快速獲得混合物中未知化合物結構信息的術，近年來，它在藥物研究中的應用日益廣泛。本文介紹了HPLC一NMR聯用技術及其在中藥分析中分離、結構鑒定、構型分析等方面的一些研究應用。關鍵詞:液相核磁共振聯用技術(LCNMR) 中藥分析中藥是中華民族的瑰寶，數千年來，中藥對中國人民的醫療保健發揮了巨大的作用特別是隨著我國加入世界貿易組織后，以仿制為主的西藥研

2、制將遇到嚴重挑戰，中藥己成為我國最有優勢的研究與開發領域。充分利用現代科學技術的方法和手段，按照國際認可的醫藥標準規范，研究開發能夠正式進入國際醫藥市場的中藥產品，推動中藥的現代化，不僅具有經濟效益也具有巨大的社會效益。在這其中，中藥及其復方的藥效物質基礎研究是中藥現代化研究的重點與突破口，它關系到藥材、飲片，中藥制劑和中成藥產品等的質量控制等。中藥的真偽鑒別和品質評價是臨床應用、成藥制備、中藥科研不可缺少的前提條件。我國藥材品種繁多，存在南北差異、同名異物、同物異名等情況，混淆品極多，療效也各不相同。而且中藥的有效成分和環境、產地、采收季節等因素也有很大關系。加之近年來，假冒偽劣中藥充斥市場

3、，為控制中藥質量、保證臨床用藥安全和有效，需要對中藥進行嚴格鑒定。隨著科技不斷發展，從最原始的眼觀、鼻聞、口嘗、手摸到顯微鑒別和理化鑒別，再到光譜、色譜等現代技術的應用，中藥鑒定技術越來越多元化。但每一種分析技術均有其適用范圍和局限性，將單一的分析技術聯合起來，不僅能獲得更多的信息，而且可能產生單一分析技術所無法得到的新的信息。因此，聯用技術已成為中藥鑒定發展的一個重要方向。HPLC雖然是復雜成分的分離中最有力的工具，微處理機的應用，簡化了儀器操作，并能夠實現全自動化，應用極為廣，通過UV可變波長檢測器，可獲得一些化合物的附加信息，但信息量非常有限，對活性成分的結構鑒定幫助不大。NMR能夠提供

4、大量的結構信息，包括立體化學信息(在某些情況下，它不需其他光譜的信息，就能解析未知物的結構)。因此NMR對中藥中活性成分的結構鑒定有很大的幫助。毫無疑問，HPLCNMR聯用技術對中藥的分析研究中活性成分的分離和結構鑒定的速度將大大提高。以下對HPLCNMR聯用技術操作及在中藥中的分析應用作簡單的介紹。1. HPLCNMR聯用技術HPLCNMR聯用技術的研究開始于20 世紀70 年代,早期發展十分緩慢，主要是因為當時NMR儀的靈敏度還較低，溶劑峰抑制問題也尚未解決。近年來HPLC-NMR聯用技術的迅速發展得益于NMR波譜儀磁場強度的提高、HPLCNMR專用探頭的設計及溶劑峰抑制技術的發展，從而解

5、決了動態變化、靈敏度及溶劑抑制(尤其是梯度系統)的問題。當時該儀器可采用停止流動模式,隨后不久連續流動模式打通,從此以后,隨著儀器設計、磁場強度、流動探頭等方面研制水平的提高與改進,以及有效的壓制溶劑峰的脈沖序列的建立,使得這項技術現在已廣泛應用到實際工作中。1.1基本操作模式LCNMR聯用技術主要有三種操作模式:連續流動操作模式、停流操作模式和峰存貯操作模式。1.1.1 連續流動（on-flow）操作模式:樣品由HPLC常規檢測器（UV等）出口，用毛細管直接連接到專用NMR探頭的液槽，毛細管的長度為2m。隨著分離連續獲得NMR圖譜，一次分析可得到所有組分的NMR信息，然而由于樣品溶液濃度低，

6、NMR采樣時間短（通常掃描16次），很難得到分辨率良好的NMR圖譜。1.1.2 停流(stop-flow)操作模式：當樣品色譜峰最高點到達NMR液槽的中心位置時，停止流動，進行一維或二維NMR采樣，直至獲得良好的NMR圖譜。然后再啟動輸液，恢復正常HPLC條件，繼續下一色譜峰的NMR測定。在出峰時停泵，可以獲得較好的NMR圖譜。1.1.3 峰存貯操作模式：當欲分析組分較多而各組分的含量較低時，為避免由于多次暫停LC分離而帶來峰擴散現象，可采用峰存貯操作模式。正常色譜分離時當UV檢測到色譜峰時將流出物收集并暫時貯存到不同的毛細管回路內，由NMR譜儀逐一離線測定各流分。該模式下的樣品需要量低于停流

7、操作。這樣既不中斷HPLC過程，又能獲得全部成分的良好的NMR圖譜。除用毛細管回路貯存色譜成分外，還有小柱截留法。1.2溶劑峰抑制方法大多數HPLC體系采用反相柱,使用2種或3種溶劑的混合物作洗脫液,除D2O外,其它氘代溶劑作為常規洗脫液太昂貴。因此,在線反相HPLC - NMR實驗中常采用含質子的溶劑,如CH3 CN 和CH3 OH 等。常用的MeOH - H2 O 和MeCN - H2O體系在NMR中有很強的響應值,可能掩蓋分析對象。為了消除NMR波譜儀接收器的動態范圍問題,溶劑質子信號必須加以抑制,常用的方法有:(1)采用氘代溶劑,但價格昂貴,適合于HPLC。(2)通過不同頻率通道進行多

8、重溶劑峰預飽和。(3)脈沖梯度場的相位離散而消除溶劑干擾。近年來由于毛細管HPLC的發展,溶劑的消耗量大為減少,在實驗中有可能完全使用氘代試劑作洗脫液,不必使用溶劑抑制。1.3靈敏度的提高提高HPLC - NMR靈敏度的方法有:(1) 利用SPE等方法濃縮樣品。要得到高分辯的譜圖,溶液中不能有懸浮的灰塵和纖維。一般情況下用棉花和濾紙把樣品直接過濾到樣品管中。測試微量樣品時,要帶手套處理樣品,以防手指上的微量物質溶在溶液中,否則1H譜中1. 4會出現一個7 Hz裂分的雙峰,4還有一個四重峰,可能來自丙氨酸或乳酸。(2) 提高磁場強度(900 MHz NMR已經商品化)。核磁譜儀場強的不斷升高,從

9、某種程度上增加了NMR的靈敏度和分辯力.從1987年第一臺600MHz的NMR儀,到現在已經發展到900MHz了。(3)降低探頭溫度(商品化的低溫探頭) 。利用高溫超導薄膜材料而制成的超導低溫探頭,當樣品溫度由溫控單元維持時,采用閉環或開環制冷系統使超導線圈溫度降到25K,消除了譜圖的電噪聲,相對常規5 mm探頭而言,其潛在靈敏度可以提高8 10 倍。國內已有此類探頭使用, 500MHz信噪比達3 2001,可達到800MHz水平。2. HPLCNMR在中藥分析中的應用2.1 HPLCNMR聯用技術在檢測植物藥有效成分中的應用2.1.1 半夏水提取物中的應用陳平、梁世瓢等利用HPLCNMR對半

10、夏水提取物中8種化合物的結構進行分析. 他們采用 Loop-collection（環收集方式）的工作方式，將液相分離后不同組分分別收集在不同餾分收集環(Loop)里，然后逐個注入流動探頭，再根據化合物濃度不同,進行不同采樣時間的核磁共振檢測，根據需要增加低濃度樣品的核磁采樣時間。由實驗結果分析而得半夏水提取物中的8種化合物分別是胞昔、酪氨酸、尿普、腺喋吟、鳥營、苯丙氨酸、腺營和色氨酸(Figure2-6)。實驗過程中被測組分從loop中進入NMR分析，在數據采集前必須利用溶劑抑制技術去除流動相產生的巨大的共振信號的干擾。使用溶劑抑制技術帶來的一個問題是如果被測化合物的NMR共振信號恰好在溶劑峰

11、包埋之下，則這些信號將與溶劑信號一樣被壓掉。當被測化合物是未知化合物時，這些信號的缺失將會嚴重。2.1.2 對蛇葡萄根的化學成分的研究王映紅、李娜等通過用HPLCNMR儀對葡萄科蛇葡萄根的化學成分進行研究。在INOVA2500 LCNMR上, 用停止流動的方法采集LCNMR 1HNMR譜及WEGCOSY譜. 進樣量為25L , 1HNMR 譜采樣時間為1.5 s ,累加次數為416。 WETG2COSY的F1 , F2 均為60000. 0 Hz , nt = 24 , ni = 128 ,總采樣時間為1h7min37。由結果鑒定出其中主要成分的結構為一白藜蘆醇四聚體Vitisin B。2.1

12、.3 對長葉框樹中的木脂素類化合物的分析Zhao等用停止流動HPLC-NMR鑒別了紫杉科植物長葉框樹中的木脂素類化合物。長葉框樹針葉樣品經提取、固相提取等預精制后，以梯度洗脫HPLC分得8個化合物峰，通過停止流動方法記錄1HNMR譜，再結合EI-MS等對其中7個化合物作了結構研究。峰1-6分別為化合物絡石昔元、去甲絡石糖昔元、牛芬昔元、歐側柏內醋甲基醚、松脂素和甲基松脂素。峰7的HPLC-1HNMR譜與1-6的不同，提示為一個新木脂素型化合物。峰8通過HPLCNMR測定，表明是一個未知結構的非木脂素類化合物。2.1.4 對棕櫚油提取物的分析StrohscheinL等以C30HPLCNMR聯用研

13、究了富含維生素E同系物的粗棕櫚油提取物。通過對圖譜分析分離、鑒定去粗棕櫚油提取物中有一和-型生育三烯酚、型生育三烯、a一生育三烯酚、a一生育酚、a一生育烯酚。本方法用甲醇作為流動相而不需加緩沖液的色譜條件對聯用技術來說是理想的。2.1.5 山藍色素前體分子組成與化學變化的研究謝運昌、文永新等用HPLCNMR聯用技術研究山藍中山藍色素前體的分子組成與化學變化，由分析1HNMR圖譜表明山藍色素前體分子有由2個紫藍氨酸殘基和1個氨基酚殘基鍵合而成的片段，在室溫下放置后，氨基酚結構轉變為醌結構。研究結果為山藍色素前體、山藍色素及其相關化合物的結構測定提供了重要數據為山藍色素的化學、山藍色素形成機理的闡

14、明起到了關鍵作用。2.1.6 LC一NMR聯用技術分析黃連中微量生物堿的研究王愛國、馮幸章等運用INVOA 500 LC一NMR聯用儀對黃連中微量生物堿進行LC一NMR研究，分別測定幾個微量成分的1HNMR，根據LC一NMR分析，推定黃連總堿中幾個微量成分為化合物(1)為5一羥基一13一甲基小檗堿；化合物(2)為5-羥基一棕櫚堿；化合物(3)為13一甲基小檗堿；化合物(4)為棕櫚堿，該研究對黃連成分的研究有重要的指導意義。2.2 HPLCNMR對雙氫青蒿素差向異構體轉化的研究劉寧、楊臘虎等通過HPLCNMR儀對雙氫青蒿素進行分離和測定。在HPLC色譜條件下所分離而得的2個異構體以工作頻率為50

15、0MHz的NMR儀進行分析,用氘代甲醇為溶劑,并兼作化學位移內標,在室溫下對溶解在氘代甲醇30min后和異構體轉化平衡時進行氫譜檢測。在對實驗初期和放置一段時間后的1HNMR圖譜比較,在1HNMR圖譜中明顯一個峰位高低轉化的過程,說明雙氫青蒿素在溶液中存在異構體的轉化過程。并由圖譜得出2個異構體的1HNMR圖譜主要在5位H于12位H化學位移值有明顯的差異。2.3 LC-NMR在用血清藥化學方法對單味中藥內活性成分進行研究中的應用楊春、梁曉天等 以“血清藥物化學”方法為研究思路，用LC-NMR聯用技術對服用當歸后大鼠的血清樣品進行研究，分析其中的活性成分。用HPCL法在大鼠服藥后的血清中發現了5

16、個當歸活性成分，在肝臟中發現8個當歸活性成分。用HPLC一NMR聯用技術對肝臟和血清中2個主要活性成分研究表明，它們為莫本內酯和6，7一二羥基一3a，6，7，7a-四氫藁本內酯。在服藥后大鼠的肝臟中，阿魏酸的含量最高，而6, 7-二羥基-3a,6,7,7a-四氫藁本內酯的含量比藁本內酯高。在血清中，6, 7-二羥基-3a,6,7,7a-四氫藁本內酯的含量最高，而藁本內酯的含量較低，未發現阿魏酸。在大 鼠 服 藥后1.Oh 的肝臟中發現阿魏酸的含量最高，而藁苯類化合物的含量并不高。這可能由于阿魏酸的水溶性大，而藁苯類為脂溶性化合物，因此阿魏酸在體內吸收較好。但在1.Oh 的血液中并未發現它的存在

17、，可能其代謝較快。由于體內生物樣品中的活性成分來源于中藥，在排除代謝產生的成分后，通過對中藥中相應成分的檢測，可知中藥在體內的活性成分，這為中藥的研究提供了一種新的思路。總結實踐證明HPLCNMR 在結構具有規律性的同類化合物的鑒定中,可起到提高工作效率、避免盲目重復勞動的作用. 在中藥分析的提取分離工作中不但有指導作用,還可以提供較為準確的光譜信息, 排除雜質的干擾,大大降低了中藥中混合物結構分析的難度，從而可以確定其結構和立體構型。在過去幾年里，雖然HPLCNMR聯用技術的靈敏度已大大提高，并在分離和鑒定上有了一些成功的應用，但仍不夠滿意，柱與池間以及池本身造成的峰擴散需進一步降低。不斷提

18、高NMR的靈敏度和色譜光譜分辨能力，使得實驗結果更準確可靠。參考文獻1. 劉文英 藥物分析 第6版 人民衛生出版社； 2. 徐蘇麗 聯用技術在中藥研究中的應用 海峽藥學2007年第19卷第6期； 3. 張亮，張正行 HPLC/NMR聯用技術及其在藥物分析中的應用 國外醫學藥學分冊 1991年 第18卷 第4期；4. 陳平，梁世瓢，李川，宋國強 液核聯用(LC/NMR)與液質聯用(LCIMS)的結合用于中藥多成分化學結構的分析(該分析技術平臺的建立及其在分析半夏水提物中的應用) 中國藥學會學術年會論文集 2002: 742-744；5. 王映紅, 李娜, 賀文義等 高效液相2核磁共振儀聯用技術及

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