1、色譜技術(shù)簡(jiǎn)介發(fā)布者：杭州科曉化工儀器設(shè)備發(fā)布時(shí)間：2007年1月30日0 Audo Iook6.0 下載引言色譜法是1906年俄國(guó)植物學(xué)家 Michael Tswett將含有有色的植物葉子色素和溶液通過裝填有白堊粒子吸附劑的柱子，企圖別離它們時(shí)而發(fā)現(xiàn)并命名的。各種色素以不同的速率通過柱子，從而彼此分開。別離開的色素形成不同的色帶而易于區(qū)分，由此得名為色譜法Chromatography ，又稱層析法。其后的一個(gè)重大進(jìn)展是1941年Martin和Synge發(fā)現(xiàn)了液液分配色譜法 Liquid-Lipuid partition Chromatography，簡(jiǎn)稱LIC。他們用覆蓋于吸 附劑外表的并與流

2、動(dòng)相不混溶的固定液來代替以前僅有的固體吸附劑。試樣組分按照其溶解在兩相之間分配。Marti n和Synge因?yàn)檫@一工作而榮獲1952年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。在使用柱色譜的早期年代，可靠地鑒定小量的被別離物質(zhì)是困難的，所以研究開展了紙色譜法Pap er Chromatography，簡(jiǎn)稱PC。在這種"平面的技術(shù)中，別離主要是通過濾紙上的分配來實(shí)現(xiàn)的。然后由于充分考慮了平面色譜法的優(yōu)點(diǎn)而開展了薄層色譜法Thin-Layer Chromatography，簡(jiǎn)稱TLC,在這種方法中，別離系在涂布于玻璃板或某些堅(jiān)硬材料上的薄層吸附劑上進(jìn)行。在Stah l于1958年進(jìn)行了經(jīng)典性的工作將技術(shù)和所用材料加

3、以標(biāo)準(zhǔn)化之后，薄層色譜法方贏得了聲譽(yù)。為了幫助提高紙色譜法或薄層色譜法對(duì)離子化合物的別離效率，可以向紙或板施加電場(chǎng)。這種改良了方法分別稱作紙上電泳或薄層電泳。新近開展起來的色譜法氣相色譜法是 Martin和James于1952年首先描述的，現(xiàn)已成為所有色譜法中最高級(jí)和最廣泛使用的一種方法，它特別適用于氣體混合物或揮發(fā)性液體和固體，即便對(duì)于很復(fù)雜的混合物，其別離時(shí)間也僅為幾分鐘左右，這已 屬司空見慣。高分辯率、分析迅速和檢測(cè)靈敏等幾種優(yōu)點(diǎn)之綜合使氣相色譜法成了幾乎每個(gè)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室要采用的一種 常規(guī)方法。近年來，因?yàn)樾滦鸵合嗌V儀和新型柱填料的開展以及對(duì)色譜理論的更深入了解，又重新引起對(duì)密閉柱液相色

4、譜法的興趣。高效 液相色譜 法High-Peformanee Liquid Chromatography ，簡(jiǎn)稱HPLC迅速成為與氣相色譜法 一樣廣泛使用的方法，對(duì)于迅速別離非揮發(fā)性的或熱不穩(wěn)定的試樣來說，高效液相色譜法常常是更可取的。色譜法分類色譜法有多種類型，也有多種分類方法。一按兩相所處的狀態(tài)分類液體作為流動(dòng)相，稱為" 液相色譜liquid ehromatograp-hy ;用氣體作為流動(dòng)相，稱為"氣相色譜gasehromatogr-aphy 。固定相也有兩種狀態(tài)，以固體吸附劑作為固定相和以附載在固體上的液體作為固定相，所以層析法按兩相所處的狀態(tài)可以分為：液液色譜(

5、liquid-liquid chromatography)氣固色譜( gas-solid chromatography)氣液色譜 gas-liquid chromatography二按層析過程的機(jī)理分類)吸附層析( adsorption chromatography利用吸附劑外表對(duì)不同組分吸附性能的差異，到達(dá)別離鑒定的目的。分配層析 partition chromatography 利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù) 或溶解度不同， 而使之別離的方法。離子交換層析 ion-exchange chromatography 利用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同，而進(jìn)行別離的 方法。凝膠層析

6、 gelchromatography 利用某些凝膠對(duì)于不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異，進(jìn)行別離 的技術(shù)。三按操作形式不同分類柱層析 colum chromatography 將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而到達(dá)別離。紙層析 paper chrmatography 用濾紙作液體的載體擔(dān)體 support ，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開，以到達(dá)別離鑒定的目的。薄層層析 thin layper chromatography將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的別離和鑒定。吸附色譜法吸附色譜法常叫做液固色譜法 Liquid-SolidChromatography，簡(jiǎn)稱LS

7、C,它是基于在溶質(zhì)和用作固定固體吸附劑上的固定活性位點(diǎn)之間的相互作用。可以將吸附劑裝填于柱中、覆蓋于板上、或浸漬于多孔濾紙中。吸附劑是具有大外表積的活性多孔固體，例如硅膠、 氧化鋁和活性炭等?；钚渣c(diǎn)位例如硅膠的外表硅烷醇，一般與待別離化合物的極性官能團(tuán)相互作用。分子的非極性部 分例如烴對(duì)別離只有較小影響，所以液固色譜法十分適于別離不同種類的化合物例如，別離醇類與芳香烴。分配色譜法 在分配色譜法也稱體液液色譜法中，溶質(zhì)分子在兩種不相混溶的液相即固定相和流動(dòng)相之間按照它們的相對(duì)溶解度進(jìn)行分配。固定相均勻地覆蓋于惰性載體一多孔的或非多孔的固體細(xì)?；蚨嗫准埳霞埳献V。為防止 兩相的混合，兩種分配液體在極

8、性上必須顯著不同。假設(shè)固定液是極性的例如乙二醇，流動(dòng)相是非極性的例如乙 烷，那么極性組分將較強(qiáng)烈的被保存。這是通常的操作方式。另一方面，假設(shè)固定相是非極性的例如癸烷，流動(dòng) 相是極性的例如水，那么極性組分易分配于流動(dòng)相，從而洗脫得較快。后一種方法它有相反的極性稱作為反相 液一液色譜法。由于溶解度差異的細(xì)微效應(yīng)，所以液一液色譜法很適于別離同系物的同分異構(gòu)體。在液一液色譜法中， 固定相幾乎都被化學(xué)鍵合在載體物質(zhì)上，而不是機(jī)械覆蓋在它的外表。這種色譜法稱作鍵合相色譜法Bonded-PhaseChromatography，簡(jiǎn)稱BPC。這種方法的機(jī)理尚不清楚，可能是分配機(jī)理，也可能是吸附機(jī)理，視實(shí)驗(yàn)條件而

9、定。高效 液相色譜 法中，鍵合相色譜法的應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過所有其他模式。離子交換色譜法Sober 和 Peterson 于 1956 年首次將離子交換基團(tuán)結(jié)合到纖維素上， 制成了離子交換纖維素， 成功地應(yīng)用于 蛋白質(zhì)的別離。從此使生物大分子的分級(jí)別離方法取得了迅速的開展。離子交換基團(tuán)不但可結(jié)合到纖維上，還可結(jié)合到交聯(lián)葡聚糖S-ephadex和瓊脂糖凝膠Sepharose 上。近年來離子交換色譜技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌體和多糖的別離和純化。它們的優(yōu)點(diǎn)是：具有開放性支持骨架，大分子可以自由進(jìn)入和迅速擴(kuò)散，故吸附容量大。具有親水性，對(duì)大 分子的吸附不大牢固，用溫和條件使

10、可以洗脫，不致引起蛋白質(zhì)變性或酶的失活。多孔性，外表積大、交換容量大， 回收率高，可用于別離和制備。一、根本理論離子交換劑通常是一種不溶性高分子化合物，如樹脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等，它的分子中含有可解離 的基團(tuán)，這些基因在水溶液中能與溶液中的其它陽(yáng)離子或陰離子起交換作用。雖然交換反響都是平衡反響，但在層析 柱上進(jìn)行時(shí)，由于連續(xù)添加新的交換溶液，平衡不斷按正方向進(jìn)行，直至完全。因此可以把離子交換劑上的原子離子 全部洗脫下來，同理，當(dāng)一定量的溶液通過交換柱時(shí)，由于溶液中的離子不斷被交換而波度逐減少，因此也可以全部 被交換并吸附在樹脂上。如果有兩種以上的成分被交換吸著在離子交換劑上，用洗脫液洗脫

11、時(shí)，在被洗脫的能力那么決 定于各自洗反響的平衡常數(shù)。蛋白質(zhì)的離子交換過程有兩個(gè)階段一一吸附和解吸附。吸附在離子交換劑上的蛋白質(zhì)可 以通過改變pH使吸附的蛋白質(zhì)失去電荷而到達(dá)解離但更多的是通過增加離子強(qiáng)度，使參加的離子與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)離子交換劑上的電荷位置，使吸附的蛋白質(zhì)與離子交換劑解開。不同蛋白質(zhì)與離子交換劑之間形成電鍵數(shù)目不同，即親和力 大小有差異 ，因此只要選擇適當(dāng)?shù)南疵摋l件便可將混合物中的組分逐個(gè)洗脫下來，到達(dá)別離純化的目的。二、離子交換的分類及常見種類一分類 離子交換劑分為兩大類，即陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。各類交換劑根據(jù)其解離性大小，還可分為強(qiáng)、弱兩種，即 強(qiáng)酸劑 陽(yáng)離子交換劑弱酸劑

12、強(qiáng)鹼型 陰離子交換劑 弱鹼型 。1. 陽(yáng)離子交換劑陽(yáng)離子交換劑中的可解離基因是磺酸-S03H、磷酸-PO3H2、 羧酸COOH和酚羥基-0H等酸性基。某些交換劑在交換時(shí)反響如下：強(qiáng)酸性： R-SO3 -H+ Na+ R-SO3- Na+H+弱酸性： R-COOHNa+ R-COONaH+國(guó)產(chǎn)樹脂中強(qiáng)酸1X 7 上海樹脂# 732和國(guó)外產(chǎn)品 Dowex 50、Zerolit 225等都于強(qiáng)酸型離子交換劑。2. 陰離子交換劑陰離子交換劑中的可解離基因是伯胺、-NH2、仲胺-NHCH3、叔胺N- CH3 2和季胺-N CH32 等鹼性基團(tuán)。某些交換反響如下：強(qiáng)鹼性：R-N+ CH3 2 H OH-

13、+ Cl R-N+ CH3 2 Cl + OH-弱鹼性：R-N+ CH3 2 H OH- + Cl R-N+ CH3 2 HCl + OH-強(qiáng)鹼性 201 號(hào)國(guó)產(chǎn)樹脂和國(guó)外 Dowex1、 Dowex2、 ZerolitFF 等都屬于強(qiáng)鹼型陰離子交換劑。二 種類1. 纖維素離子交換劑：陽(yáng)離子交換劑有羥甲基纖維素CM纖維素，陰離子交換劑有氯代三乙胺纖維紗DESE纖維素。因而既具有離子交換作用，2. 交聯(lián)葡聚糖離子交換劑： 是將交換基因連接到交聯(lián)葡聚糖上制成的一類交換劑，又具有分子篩效應(yīng)，是一類廣泛應(yīng)用的色譜別離物質(zhì)。常用的Sephadex 離子交換劑也有陰離子和陽(yáng)離子交換劑兩類。陰離子交換劑有

14、DEAE-SephadexA-25 ， A-50 和 QAE- Sephadex A25 ， A50 ； 陽(yáng)離子交換劑有 CM-SephaetxC-50 ， C-50 和 SephadexC-25 , C-50。陰離子交換劑用英文字頭A,陽(yáng)離子交換劑的英文字頭是G英文字后面的數(shù)字表示 Sephadex型號(hào)。3. 瓊脂糖離子離交換劑：是將 DESE或CM基團(tuán)附著在 Sepharose CL-6B上形成，DEAE-Sephades 陰離子和 CM-Sepharose邙日離子，具有硬度大， 性質(zhì)穩(wěn)定，凝膠后的流速好，別離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。三、實(shí)驗(yàn)操作一交換劑的處理，再生與轉(zhuǎn)型 新出廠的樹脂是干樹脂，要用

15、水浸透使之充分吸水膨脹。因其含有政績(jī)一些雜質(zhì)，所要要用水、酸、鹼洗滌。一般手續(xù)如下：新出廠干樹脂用水浸泡 2 小時(shí)后減抽壓去氣泡，傾去水，再用大量無(wú)離子水洗至澄清，去水后加4倍量 2N HCl 攪抖 4 小時(shí)，除去酸液，水洗到中性，再加 4 倍量 2NNaOH攪抖4小時(shí)，除鹼液，水洗到中性備用。將樹脂帶上所希望的某種離子的操作稱為轉(zhuǎn)型。如希望陽(yáng)樹脂帶Na+,那么用4倍量NaOH攪拌浸泡2小時(shí)以上；如希望樹脂帶 H+,可用HCI處理。陰樹脂轉(zhuǎn)型也同樣，假設(shè)希望帶Cl-那么用HCI，希望帶OH-那么用NaOH用過的樹脂使其恢復(fù)原狀的方法稱為再生。并非每次再一都用酸、鹼液洗滌，往往只要轉(zhuǎn)型處理就行了

16、。二柱上操作交換劑裝柱最簡(jiǎn)單的交換層析柱可用鹼式滴定管代替。處理過的樹脂放入燒杯，加少量水邊攪拌邊倒入保 持垂直的層析管中，使樹脂緩慢沉降。交換劑在柱內(nèi)必須分布均勻。上樣向?qū)游鲋鶅?nèi)傾入樣品液洗脫與收集 不同樣品選用的洗脫液不同。原那么是用一種比吸著物質(zhì)更活潑的離子，把吸著物交換出來。由于被吸著 的物質(zhì)往往不是我們所要求的單一物質(zhì)，因此除了正確選擇洗脫液外還采控制流速和分布收集的方法來獲得所需的單 一物質(zhì)。膠色譜法 凝膠色譜技術(shù)是六十年代初開展起來的一種快速而又簡(jiǎn)單的別離分技術(shù)，由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不 需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的別離效果。目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分

17、子免疫學(xué)以及 醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛采用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。一、根本理論一分子篩效益 一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經(jīng)凝膠色譜柱時(shí)，各分子在柱內(nèi)同時(shí)進(jìn)行著兩種不同的運(yùn)動(dòng)：垂 直向下的移動(dòng)和無(wú)定向的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所 以在洗脫時(shí)向下移動(dòng)的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，即進(jìn) 入凝膠相內(nèi)，在向下移動(dòng)的過程中，從一個(gè)凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散， 小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分

18、子的后流出，分子最小的最 后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。具有多孔的凝膠就是分子篩。各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限 和最小極限。分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，就會(huì)全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻。兩種全排阻 的分子即使大小不同，也不能有別離效果。直徑比凝膠最小孔直徑小的分子能進(jìn)入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都 能全部進(jìn)入凝膠孔隙，即使它們的大小有差異，也不會(huì)有好的別離效果。因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍。 綜上所述，在凝膠色譜中會(huì)有三種情況，一是分子很小，能進(jìn)入分子篩全部的內(nèi)孔隙；二是分子很大，完全不能進(jìn)入 凝膠的任何內(nèi)孔隙；三是分子大小適中，能進(jìn)入凝膠的內(nèi)孔隙

19、中孔徑大小相應(yīng)的局部。大、中、小三類分子彼此間較 易分開，但每種凝膠別離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難別離的。對(duì)于分子大小不同，但同屬于 凝膠別離范圍內(nèi)各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進(jìn)入孔徑較大的那一局部凝膠孔隙內(nèi)， 而分子的可進(jìn)入較多的凝膠顆粒內(nèi)，這樣分子較大的在凝膠床內(nèi)移動(dòng)距離較短，分子較小的移動(dòng)距離較長(zhǎng)。于是分子 較大的先通過凝膠床而分子較小的后通過凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質(zhì)別離。另外，凝膠本身具 有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大的分子在通過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的孔隙時(shí)阻力較大，小分子通過時(shí)阻力較小。分子量大小不同的多 種成份在通過凝膠床時(shí)，按照分子

20、量大小“排隊(duì)，凝膠表現(xiàn)分子篩效應(yīng)。二色譜柱的重要參數(shù)柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積外表的體積。在色譜柱中充滿凝膠的局部稱為凝 膠床，因引柱體積又稱“床體積，常用 Vt表示。外水體積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這局部體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。內(nèi)水體積：因?yàn)槟z為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進(jìn)入顆粒內(nèi)部，這就分間隙的總和為內(nèi) 水體積，又稱定相體積，常用 Vi 表示。不包括固體支持物的體積 Vg。峰洗脫體積：是指被別離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液有體積，常用Ve表示。當(dāng)使用樣品的體積很少時(shí)，與洗脫體積比擬可以忽略不計(jì)，在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用 洗脫液體

21、積為 Ve。當(dāng)樣品體積與洗脫體積比擬不能忽略時(shí)，洗脫體積計(jì)算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當(dāng)樣品很大時(shí)， 洗脫體積計(jì)算可以從應(yīng)用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點(diǎn)或半高處。二、凝膠的種類及性質(zhì)一交聯(lián)葡聚糖凝膠 Sephadex SephadexG交聯(lián)葡聚糖的商品名為 Sephndex,不同規(guī)格型號(hào)的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的 10 倍。例如， G-25 為每克凝膠膨脹時(shí)吸水 2.5 克，同樣 G-200 克每克千膠吸水 20 克。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類 有G-10，G-15，G-25, G-50，G-75, G-100, G-150，和G-200。因此，“ G'反

22、映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部 范圍。Sephadex LH-20 ,是一Sephadex G25的羧丙基衍生物，能溶于水及親脂溶劑，用于別離不溶于水的物質(zhì)。二瓊脂糖凝膠：商品名很多，常見的有，Sepharose 瑞典，Pharmacia ， Bio-Gel-A 美國(guó)Bio-Rad 等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級(jí)鏈如氫鍵來維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn) 定的，可以在許多條件下使用如水，pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液。瓊脂糖凝膠在40C以上開始融化，也不能高壓消毒，可用化學(xué)滅菌活處理。三聚丙烯酰胺凝膠：是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯

23、酰胺交聯(lián)成的，經(jīng)枯燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號(hào)的凝膠。交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠-PBio-Gel P ，由美國(guó)Bio-Rod廠生產(chǎn)，型號(hào)很多，從 P-2至P-300共10種，P后面的數(shù)字再乘1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度。四聚苯乙烯凝膠商品為Styrogel ,具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，可用于別離分子量1600到40, 000, 000的生物大分子，適用于有機(jī)多聚物，分子量測(cè)定和脂溶性天然物的 分級(jí)，凝膠機(jī)械強(qiáng)度好，洗脫劑可用甲基亞砜。三、實(shí)驗(yàn)技術(shù)一層析柱層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管。層析柱的直徑大小不影響別離度，樣品用量

24、大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時(shí)應(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外，直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。別離度取決于柱高，為別離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，別離度與柱高的平方根相關(guān)，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。分族別離時(shí)用短柱，一般凝膠柱長(zhǎng)20-30厘米，柱高與直徑的比擬5:1 10:1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。分級(jí)別離時(shí)柱高與直徑之線為20:1 100:1，常用凝膠柱有 50X 25厘米，10X 25厘米。層析柱濾板下的死體積應(yīng)盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被別離組分之間重新混合的可能性就大，其結(jié)果是影

25、響洗脫峰形， 出現(xiàn)拖尾出象，降低分辯力。在精確別離時(shí)，死體積不能超過總床體積的1/1000。二凝膠的選擇 根據(jù)所需凝膠體積，估計(jì)所需干膠的量。一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如SephadexG-20的吸水量為 20, 1克SephadexG-200吸水后形成的凝膠體積約 40ml。凝膠的粒度也可影響層析別離效果。粒度細(xì)胞別離效果好，但阻力大，流速慢。一般實(shí)驗(yàn)室別離蛋白質(zhì)采用100-200號(hào)篩目的的SephadexG-200效果好， 脫鹽用Sephadex G-25、G-50 ,用粗粒，短柱，流速快。三凝膠的制備商品凝膠是枯燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加

26、速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在1-2小時(shí)內(nèi)即可完成。特別是在使用軟膠時(shí)，Sephadex自然膨脹需24小時(shí)至數(shù)天，而用加熱法在幾小時(shí)內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時(shí)間，而且還可消毒，除 去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空氣。四樣品溶液的處理 樣品溶液如有沉淀應(yīng)過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過G-15 短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過4 ，粘度高影響別離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的別離要求確定。別離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4 一般約 0.5-2ml ，進(jìn)行分族別離時(shí)樣品液可為凝膠床的 10，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí)，樣品可

27、達(dá)凝膠床的20-30 。分級(jí)別離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。五防止微生物的污染 交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止微生物的生長(zhǎng)，在凝膠層析中十分重 要，常用的抑菌劑有 :疊氨鈉NaN3在凝膠層析中只要用 0.02 %疊氮鈉已足夠防止微生物的生長(zhǎng)，疊氮鈉易溶一水，在20C時(shí)約為 40；它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會(huì)改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層 析我特性。疊氮鈉可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)。可樂酮 Cl3C-COHCH32 在凝膠層析中使用濃度為 0.01-0.02 %。在微酸性溶液中它的殺菌效果最正確， 在強(qiáng)堿性溶液中或溫度高于60 C時(shí)易引起分

28、解而失效。乙基汞代巰基水楊酸鈉 在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為 0.05-0. 01 %。在微酸性溶液中最為有效。 重金屬離子可使乙基代巰基的物質(zhì)結(jié)合，因而包含疏基的蛋白質(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效果。苯基汞代鹽在凝膠層析中使用濃度為 0.001-0.01 %。在微堿性溶液中抑效果最正確， 長(zhǎng)時(shí)間放置時(shí)可與鹵素、 硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀；復(fù)原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用。親和色譜法一、根本理論一原理在生物體內(nèi)，許多大分子 AKSJDHFKLSDFHKLS具有與某些相對(duì)應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性。例如抗原和抗體、酶和底物及輔酶、激素和受體、RNA和其互補(bǔ)的D

29、NA等，都具有這種特性。生物分子之間這種特異的結(jié)合能力稱為親和力，根據(jù)生物分子間親和吸附和解離的原理，建立起來的色譜法稱親色譜法。親和色譜中兩個(gè)進(jìn)行專一結(jié) 合的分子互稱對(duì)方為配基。如抗原和抗體，抗原可認(rèn)為是抗體的配基，反之抗體也可認(rèn)為是抗原的配基。將一個(gè)水溶 性配基在不傷害其生物學(xué)功能的情況下與水不溶性載體結(jié)合稱為配基的固相化。親和色譜法的根本過程是：1. 配基固相化。將與純化對(duì)象有專一結(jié)合作用的物質(zhì)，連接在水不溶性載體上，制成親和吸附劑后裝柱稱親和性。2. 親和吸附。將含有純化對(duì)象的混合物通過親和柱，純化對(duì)象吸附在柱上，其他物質(zhì)流出色譜柱。3. 解吸附。用某種緩沖液或溶液通過親和柱，把吸附在

30、親和柱上的欲純化物質(zhì)洗脫出來。二應(yīng)用范圍親和色譜可用于以下生物體系：酶：底物、抑制劑、輔酶抗體：抗原、病毒、細(xì)胞外源凝集素：多糖、糖蛋白、細(xì)胞外表受體、細(xì)胞核酸：互補(bǔ)堿基序列、組蛋白、核酸聚合酶 、結(jié)合蛋白激素及維生素：受體、載體蛋白細(xì)胞：細(xì)胞外表特異蛋白、外源凝集素 親和色譜的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、效率高、條件溫和，缺點(diǎn)是使用局限性大。三載體的選擇原那么用于親和色譜的理想載體應(yīng)具有以下特性：不溶性：不溶于水；滲透性：疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，容許大分子自由通過；有一定硬度，最好為均一的珠狀；具有大量可供反響的化學(xué)基團(tuán)，能與大量配基共價(jià)連接；非特異性 吸附能力極低；能抗微生物和酶的侵蝕；有較好的化學(xué)穩(wěn)定性；親水

31、性。選擇配基根據(jù)對(duì)純化大分子的特異性 的全面認(rèn)識(shí)。選擇也的配基有兩條標(biāo)準(zhǔn)：第一是蛋白質(zhì)和配基之間必須有強(qiáng)的親和力，解離常數(shù)在5mM以上不是好配基；相反親和力太高也是有害的，因?yàn)樵诮怆x蛋白質(zhì)一一配基復(fù)合物時(shí)所需的條件就要強(qiáng)烈，這樣可能使蛋白質(zhì)變性。例如用抗生物素蛋白作配基純化含生物素的羧化酶時(shí)，生物素抗生物素蛋白復(fù)合物的解離常數(shù)達(dá)10-15M,解離時(shí)需要pH1.5, 6M鹽酸胍，在這種條件中。羧化酶大多數(shù)已經(jīng)變性。選擇配基的第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是，配基必須具有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，這種基團(tuán)不參與配基與蛋白質(zhì)之間特異結(jié)合，但 可用于活化和載體相連接，同時(shí)又不影響配基與蛋白質(zhì)之間的親和力。四常見載體的特性瓊脂糖凝膠

32、： 親水性強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定 商品名： Sepharose 聚丙烯酰胺凝膠： 理化性質(zhì)穩(wěn)定，耐有機(jī)溶劑及去污劑，抗微生物能力強(qiáng)， 特別適應(yīng)用配基與提取物親和力比擬弱的物質(zhì)。葡聚糖凝膠： 有良好的化學(xué)及物理性質(zhì)，孔經(jīng)小。纖維素： 非特易吸附嚴(yán)重，廉價(jià)，易得。二、實(shí)驗(yàn)方法親和色譜別離的方法隨每種別離物質(zhì)的不同而有不同。一般推薦使用的程序如下：1 選 擇 配 基； 2選擇偶聯(lián)凝膠； 3偶 聯(lián) 配 基； 4裝填適宜的柱； 5平衡2-3 倍體積緩沖液 ； 6應(yīng) 用 樣 品；7洗滌未結(jié)合物質(zhì)；8洗脫結(jié)合物質(zhì)t除鹽；9再生高壓 液相色譜Martin 和Synge 在 1941 年就提出高效相色譜的設(shè)想， 然而

33、直到六十年代后期， 由于各種技術(shù)的開展， 高效 液相色譜 才 付諸實(shí)現(xiàn)。這種色譜技術(shù)曾被稱為高速液相色譜 HighSpeedLiquid Chromatography ，高壓 液相色譜 High Parss-ure Lipuid Chromatography，目前使用最多的名稱是高效 液相色譜 High Pe-rformance LiauidChromatography , HPLC。高效液相色譜已經(jīng)廣泛地應(yīng)用，成為一項(xiàng)不可缺少的技術(shù)。它的主要優(yōu)點(diǎn)是分 辯率高于其它色譜法；速度快，十幾分鐘到幾十分鐘可完成；重復(fù)性高；高效相色譜柱可反復(fù)使用；自動(dòng)化 操作，分析精確度高。根據(jù)別離過程中溶質(zhì)分子與固

34、定相相互作用的差異，高效液相色譜 可分為四個(gè)根本類型，即液固色譜、液液色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜。高效 液相色譜 在生物領(lǐng)域中廣泛用于以下產(chǎn)物的別離和鑒定： 氨基酸及其衍生物；有機(jī)酸；甾體化合物；生物鹼；抗菌素；糖類；卟啉；核酸及其降解產(chǎn)物；9 蛋白質(zhì)、酶和多肽；脂、分類高效 液相色譜 法可分為四個(gè)根本類型：即液固色譜法，鍵合相色譜法，離子交換色譜法及體積排阻色譜法。一液固色譜法 液固色譜法通常稱吸附色譜法，吸附劑有活性碳，氧化鋁和硅膠，在液固色譜法中用的載體都是硅 膠。硅膠對(duì)溶質(zhì)，分子的吸附能力不是平均分布在整個(gè)硅脫外表的，在硅膠外表有一些區(qū)域與溶質(zhì)分子強(qiáng)烈相互作用， 這些區(qū)域?yàn)榛钚晕?/p>

35、置，硅膠與溶質(zhì)分子間主要作用是偶極距力氫鍵及靜電相互作用。極性越強(qiáng)，而化合物在硅膠柱上 的滯留時(shí)間也長(zhǎng)。在液固色譜中，依靠流動(dòng)相溶劑分子與溶質(zhì)分子競(jìng)爭(zhēng)固定相互活性位置，從而使溶質(zhì)從色譜柱上洗脫下來。與硅膠外表活性位置結(jié)合力強(qiáng)的溶劑洗脫溶質(zhì)分子的能力強(qiáng)，因而稱強(qiáng)溶劑，反之為弱溶劑。液一固色譜法的特點(diǎn)是適于別離色譜幾何異構(gòu)體，可用于脂溶性化合物質(zhì)如磷脂，甾體化合物， 脂溶性維生素，前列腺素等。二鍵合相色譜法 鍵合相色譜法是由液液色譜法即分配色譜開展起來的。鍵合相色譜法將固定相共價(jià)結(jié)合在載體顆粒 上，克服了分配色譜中由于固定相在流動(dòng)中有微量溶解，及流動(dòng)相通過色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊，固定相不斷損失，色譜

36、柱的性質(zhì)逐漸改變等缺點(diǎn)。鍵合相色譜法可分為正常相色譜法和反相色譜法。1. 正常相色譜法在正常相色譜法中共價(jià)結(jié)合到載體上的基團(tuán)都是極性基團(tuán)，如一級(jí)氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二 氨基等。流動(dòng)相溶劑是與吸附色譜中的流動(dòng)相很相似的非極性溶劑，如庚烷、已烷及異辛烷等。由于固定相是極性， 因此流動(dòng)溶劑的極性越強(qiáng)，洗脫能力也越強(qiáng)，即極性大的溶劑是強(qiáng)溶劑。固定相與流動(dòng)相的這種關(guān)系正好與液固色 譜法相同，稱這種色譜法為正常相色譜法。盡管如此，正常相色譜法的別離原理主要根據(jù)化合物在固定相及流動(dòng)相中 分配系數(shù)的不同進(jìn)行別離，它不適于別離幾何異構(gòu)體。2. 反相色譜法在反相色譜法中共價(jià)結(jié)合到載體上的固定相是一些直鏈

37、碳?xì)浠衔?，如正辛基等。流?dòng)相的極性比固定 相的極性強(qiáng)。反相色譜法在高效 液相色譜 法中應(yīng)用最廣泛。在反相色譜法中，使溶質(zhì)滯留的主要作用是疏水作用，在高效 液相色譜 中又被稱為疏溶劑作用。所謂疏水作 用即當(dāng)水中存在非極性溶質(zhì)時(shí)，溶質(zhì)分子之間的相互作用、溶質(zhì)分子與水分子之間的相互作用遠(yuǎn)小于水分子之間的相互作用，因此溶質(zhì)分子從水中被“擠了出去?？梢姺聪嗌V中疏水性越強(qiáng)的化合物越容易從流動(dòng)相中擠出去，在色 譜柱中滯留時(shí)間也長(zhǎng)，所以反相色譜法中不同的化合物根據(jù)它們的疏水特性得到別離。反相色譜法適于別離帶有不同 疏水基團(tuán)的化合物，亦即非極性基團(tuán)的化合物。此外，反相色譜法可用于別離帶有不同極性基團(tuán)的化合物

38、?？梢酝ㄟ^ 改變流動(dòng)相的溶劑及其組成和 pH,以影響溶質(zhì)分子與流動(dòng)相的相互作用，改變它們的滯留行為。另外，反相色譜中水 的流動(dòng)相中占的比例伸縮性很大，可以從 0-100，從而使反相色譜可用于水溶性、脂溶性化合物的別離。反相色譜法中的固定相是被共價(jià)結(jié)合到硅膠載體上的直鏈飽和和烷烴,其鏈的長(zhǎng)短不同,最長(zhǎng)的是十八烷基,這也是使用得最 多的固定相。直鏈飽和烷烴疏水特性隨著碳?xì)滏湹拈L(zhǎng)度而增加,在反相色譜柱中溶質(zhì)由于疏水作用而滯留的時(shí)間也將 隨著碳?xì)滏湹拈L(zhǎng)度而增加。在一般情況下這意味著用碳?xì)滏滈L(zhǎng)的反相色譜柱能得到較好的分辯率,在多數(shù)情況下是依 靠反復(fù)來選擇色譜柱。由于反相色譜法的固定相是疏水的碳?xì)浠衔?溶質(zhì)與固定相之間的作用主要是非極性相互作 用,或者說疏水相互作用,因此