1、傷寒副傷寒甲乙三聯菌苗制造及檢定規程本品系用傷寒、副傷寒甲、乙菌分別培育，取菌苔制成懸液 經甲醛殺菌，以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋成每ml含傷寒菌1.5億、副傷寒甲、乙菌各0.75億制成。用于預防傷寒及副傷寒甲、 乙。1菌種1.1菌種來源制造傷寒、副傷寒甲、乙三聯菌苗用的菌種及檢定菌種用的 各種診斷血清，應由中國藥品生物制品檢定所分發或經同意。1.2 菌種檢定檢定菌種可用pH7.27.4的肉湯瓊脂、馬丁瓊脂或其他適 宜的培養基。1.2.1 培養特性各菌株應具有典型的形態、培養及生化特性。1.2.2 血清凝集試驗用37C培育1820小時的培養物以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀 釋成含菌6億/ml，與相應的傷寒

2、、副傷寒甲、乙菌診斷血清做 定量凝集試驗，搖勻后放 37C過夜，以肉眼可見到凝集（+）之 血清最高稀釋度為凝集反應之效價，凝集價不應低于血清原效價 之半。傷寒菌種加用傷寒 Vi及0血清做凝集試驗，應與Vi血清 有凝集，與0血清不凝集，或僅有較低凝集。123 毒力試驗用37C培育1216小時的瓊脂培養物以生理鹽水稀釋為下列濃度的菌液：傷寒、副傷寒乙菌種：3億/ml、1.5億/ml及0.75/ml。副傷寒甲菌種；15億/ml、7.5億/ml及3.75億/ml。根據菌種毒力情況稀釋度可作更改，也可增加稀釋度。每一稀釋度的菌懸液腹腔注射體重1416g之小白鼠，至少5只，每只0.5ml，觀察3天，使小白

3、鼠于感染后 3天內全部死 亡的最小劑量為1個致死量（LD）,傷寒、副傷寒乙菌種1LD應 不超過1.5億菌，副傷寒甲不超過 7.5億菌。1.2.4 毒性試驗用37 C培育1820小時之瓊脂培養物混懸于磷酸鹽緩沖生 理鹽水內，傷寒及副傷寒甲菌液加溫 56C1小時，副傷寒乙菌液 加溫58C1小時殺菌（或其他方法殺菌），不加防腐劑。殺菌試 驗合格后稀釋為每 ml含菌60、30及15億等3個濃度，每一濃 度的菌懸液以0.5ml腹腔注射體重1518g小白鼠5只，觀察3 天，注射7.5億菌之小白鼠應全部生存，注射 15億菌之5只小 白鼠可有3只死亡。1.2.5 免疫力試驗用加溫殺菌（或用其他方法殺菌）不加防

4、腐劑的菌液稀釋成 如下的濃度：傷寒及副傷寒乙菌液：2.5億/ml。副傷寒甲菌液：5億/ml。每一菌液免疫體重1416g小白鼠至少30只，每只皮下注 射上述濃度的菌液0.5ml。注射2次，間隔7天，末次免疫后9 11天進行毒菌攻擊。每種死菌菌液免疫之小白鼠各腹腔注射1LD的相應毒菌（含于0.5ml中），同時應用同批飼養或體重與免疫 組相同的小白鼠3組，每組至少5只作對照，分別于腹腔注射2、 1及1/2LD的毒菌（各含于0.5ml中），觀察3天。對照組小白 鼠感染2及1LD者應全部死亡，感染1/2LD者要有部分死亡。傷 寒、副傷寒乙菌液免疫組至少保護70%、白鼠活存，副傷寒甲菌液免疫組至少保護60

5、%、白鼠活存，則免疫力試驗為合格。免疫力試驗也可用LD50法判定結果:用加溫殺菌（或用其他方法殺菌）不加防腐劑的菌液稀釋成 如下的濃度：傷寒及副傷寒乙菌液：2.5億/ml。副傷寒甲菌液：5億/ml。每一菌液免疫體重1416g之小白鼠至少30只，每只皮下 注射上述濃度的菌液0.5ml，注射2次，間隔7天，末次免疫后 911天，用培養1216小時的傷寒、副傷寒甲或乙菌株之菌 苔以pH7.27.4的肉湯及生理鹽水等稀釋至適當的濃度進行攻 擊。免疫組小白鼠應感染100個LB。以上的毒菌。同時應用同批 飼養或體重與免疫組相同的小白鼠分為34組，每組至少5只，分別感染不同劑量毒菌作對照。免疫組及地照組分別

6、腹腔注射 0.5ml，觀察3天，計算LD50。免疫組至少應保護 70%、白鼠存 活。在做免疫力試驗時，應以參考菌苗作對照。1.2.6 抗原性試驗選體重2kg左右之健康家兔至少3只，用免疫力試驗所用之 菌液靜脈注射3次每次0.5ml，第1次注射7億菌，第2次14 億菌，第3次21億菌，每次間隔7天。末次注射后1014天采 血做定量凝集試驗測定效價。 傷寒菌免疫的血清對免疫菌效價應不低于1 : 12800,副傷寒甲、乙效價不低于 1 : 6400, 2/3家兔 血清之凝集價達上述要求即為合格。1.3 菌種保存菌種應凍干保存，凍干菌種保存于28C。菌種凍干后應抽取樣品按 1.2項進行檢查，合格后可使

7、用 3 年。以后每次生產前必須檢查全部特性一次，合格者可繼續使用2年。2菌苗制造制造傷寒、副傷寒甲、乙三聯菌苗所用的每一菌種選用2個菌株。2.1 菌種凍干菌種啟開后應檢查菌形、純度及進行玻片凝集試驗 （傷寒菌加用Vi血清），合格后即可使用。每啟開1支凍干菌種用于生產不應超過6代。2.2 制造用培養基用pH7.27.4的馬丁瓊脂或肉湯瓊脂或其他適宜的培養2.3 原液制造2.3.1 接種采用涂種，接種后置 37C培育1814小時。232 采集采集前逐瓶檢查，有雜菌者廢棄。刮取菌苔混懸于磷酸鹽緩 沖生理鹽水中。2.3.3 純菌試驗原液采集后應逐瓶取樣接種瓊脂斜面1管，于37 C培育3天，2426C1

8、天，有雜菌生長應廢棄。2.3.4 殺菌原液用甲醛溶液殺菌，各種原液加入甲醛溶液濃度如下：傷寒菌原液不超過1.1%土 0.1% ( ml /ml )。副傷寒甲菌原液不超過 1.4%± 0.1% ( ml /ml )。副傷寒乙菌原液不超過 1.8%± 0.2% ( ml /ml )。加殺菌劑后的原液應放在 37C，不得超過7天，以后保存 于28°C。無菌試驗純菌試驗合格的原液，應取樣接種不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培 養基及普通瓊脂斜面各1管，放37 C培育5天有本菌生長，可 加倍量復試一次；有雜菌生長應廢棄。236原液合并無菌試驗合格之原液，按不同菌株或不同制造日期分別過濾

9、 合并，合并后應加不超過 0.5% (g /ml )的苯酚或其他適宜之 防腐劑，保存于28C。2.4 原液檢定2.4.1 鏡檢菌形應正常，無雜菌。2.4.2 凝集試驗原液與相應血清進行凝集試驗，其凝集效價不應低于血清原 效價之半。無菌試驗按生物制品無菌試驗規程進行。2.4.4 濃度測定應按中國細菌濁度標準與質量檢定部門會同測定濃度245免疫力試驗原液于無菌試驗合格后與質量檢定部門會同進行。抽驗批數應不少于生產批數的1/5。方法同項，唯所用小白鼠每組 至少15只。對傷寒或副傷寒甲乙毒菌之攻擊，均應保護60%、白鼠活存為合格。2.5 原液保存原液應保存于28C。原液自采集之日起至用于菌苗稀釋 時不

10、得少于4個月，保存效期自采集之日起為2年半。2.6 菌苗稀釋2.6.1 原液配合稀釋前應先將不同菌種所制之原液按比例配合。每一種菌所加的菌數與應加菌數在總菌數不變的原則下，允許兩種菌之間在20%勺范圍內互有增減；同一種菌不同菌株之原液按等量混合， 但每個菌株所加的菌數與應加菌數在總菌數不變的原則下，允許兩個菌株之間在40%范圍內互有增減。2.6.2 菌苗稀釋稀釋菌苗用含0.25%0.5% (g /ml )苯酚或其他適宜的防 腐劑之磷酸鹽緩沖生理鹽水。263 苗菌濃度菌苗每ml含傷寒菌1.5億，副傷寒甲及副傷寒乙菌各 0.75 億。2.7 菌苗分批同組配合的原液用同批稀釋液在同一日稀釋的種瓶菌苗

11、為1批。大罐稀釋時應按大罐分批，并按分裝機分為亞批。2.8 檢定稀釋后每批應逐瓶抽樣進行無菌試驗及測定防腐劑含量(大罐稀釋時除外)。2.9 分裝分裝后應每亞批抽樣送質量檢定部門進行成品檢定。3成品檢定3.1物理化學檢查菌苗應為乳白色懸液，pH值為6.87.4，不應有搖不散的 菌塊或異物。苯酚含量應為 0.25%0.5% (g /ml )。3.2 菌形及純度染色鏡檢，應為革蘭氏陰性桿菌。至少觀察10個視野，平均每個視野內不得有10個以上非典型菌（線狀、粗大或染色可 疑桿菌），并不應有雜菌。3.3 無菌試驗按生物制品無菌試驗規程進行。3.4 安全試驗341 毒性試驗用體重1820g之健康小白鼠5只，每只腹腔注射菌苗0.5ml，或用體重350450g之健康豚鼠2只，腹腔注射菌苗 1.