1、基因工程DNA文庫構建構建基因文庫的基本程序：構建基因文庫的基本程序： 提取研究對象基因組提取研究對象基因組DNA，制備合適大小的，制備合適大小的DNA片段，或提取組織或器片段，或提取組織或器官的官的mRNA并反轉錄成并反轉錄成cDNA； DNA片段或片段或cDNA與經特殊處理的載體連接形成重組與經特殊處理的載體連接形成重組DNA； 重組重組DNA轉化宿主細胞或體外包裝后侵染受體菌；轉化宿主細胞或體外包裝后侵染受體菌； 陽性重組菌落或噬菌斑的選擇。陽性重組菌落或噬菌斑的選擇。第一節第一節 基因組基因組DNA文庫的構建文庫的構建一、基因組一、基因組DNA文庫的類型和發展文庫的類型和發展 質粒文庫

2、質粒文庫 噬菌體文庫噬菌體文庫 黏粒文庫黏粒文庫 人工染色體文庫人工染色體文庫 亞基因組文庫亞基因組文庫鳥槍法（霰彈法）：利用機械剪切力和超聲波等物理鳥槍法（霰彈法）：利用機械剪切力和超聲波等物理方法或限制性核酸內切酶酶切等生化方法將生物方法或限制性核酸內切酶酶切等生化方法將生物chr.打打斷，隨后通過斷，隨后通過T4 DNA連接酶把這些片段與適當的質粒連接酶把這些片段與適當的質粒載體進行重組，轉化受體菌后進行無性繁殖，獲得一載體進行重組，轉化受體菌后進行無性繁殖，獲得一大群含不同外源大群含不同外源DNA片段的克隆，再用簡便的篩選方片段的克隆，再用簡便的篩選方法從眾多的轉化菌株中篩選出含有某一

3、目的基因的菌法從眾多的轉化菌株中篩選出含有某一目的基因的菌株，從中獲得所要的基因。株，從中獲得所要的基因。代表性：代表性：指文庫中所有克隆所攜帶的指文庫中所有克隆所攜帶的 DNA 片段重新組合起來可片段重新組合起來可以覆蓋整個基因組，即可以從該文庫中分離任何一段以覆蓋整個基因組，即可以從該文庫中分離任何一段 DNA 。代表。代表性是衡量文庫質量的一個很重要的指標。性是衡量文庫質量的一個很重要的指標。文庫構建策略：文庫構建策略：采用部分酶切或隨機切割的方法來消化染色體采用部分酶切或隨機切割的方法來消化染色體 DNA ，以保證克隆的隨機性，保證每段，以保證克隆的隨機性，保證每段 DNA 在文庫中出

4、現的頻率均等；在文庫中出現的頻率均等；提高文庫所含基因組提高文庫所含基因組 DNA 的總容量，通常用覆蓋基因組的倍數來衡量。的總容量，通常用覆蓋基因組的倍數來衡量。二、文庫的代表性和隨機性二、文庫的代表性和隨機性三、基因組三、基因組DNA文庫構建流程文庫構建流程 載體的制備；載體的制備； 高純度大分子量基因組高純度大分子量基因組 DNA 的提取；的提取； HMW DNA 的部分酶切與脈沖電泳分級分離（的部分酶切與脈沖電泳分級分離（PFGE size selection）；）； 載體與外源片段的連接與轉化或侵染宿主細胞；載體與外源片段的連接與轉化或侵染宿主細胞； 重組克隆的挑取和保存。重組克隆的

5、挑取和保存。1基因組基因組 DNA 文庫的載體制備文庫的載體制備 載體的制備要求：載體的制備要求：純度高；純度高；去磷酸化好。去磷酸化好。2高質量大分子量基因組高質量大分子量基因組 DNA 的提取和部分酶切的提取和部分酶切 提取的基因組提取的基因組 DNA 要求保存完整。要求保存完整。 分子量越大，所得到的重組克隆的插入片段越大。分子量越大，所得到的重組克隆的插入片段越大。3文庫的連接轉化或包裝侵染文庫的連接轉化或包裝侵染 在電轉化和包裝侵染過程中，首先選擇轉化效率高的感受態細胞或效在電轉化和包裝侵染過程中，首先選擇轉化效率高的感受態細胞或效價高且質量穩定的包裝蛋白；同時，研究表明對連接產物進

6、行脫鹽處理也價高且質量穩定的包裝蛋白；同時，研究表明對連接產物進行脫鹽處理也可以明顯地提高其效率。另外，對于電轉化而言，選擇合適的轉化電壓對可以明顯地提高其效率。另外，對于電轉化而言，選擇合適的轉化電壓對不同插入片段的不同插入片段的 DNA 的轉化效率也有所不同。的轉化效率也有所不同。4文庫的質量檢測文庫的質量檢測 文庫的平均插入片段長度是通過文庫的平均插入片段長度是通過 PFGE 電泳檢測一定數目的重電泳檢測一定數目的重組子的插入片段大小所得平均值。美國的研究機構對組子的插入片段大小所得平均值。美國的研究機構對 BAC 文庫，一文庫，一般要求植物的在般要求植物的在 130kb 左右，而動物的

7、在左右，而動物的在 150kb 左右。左右。插入效率：有插入片段的克隆在所有檢測的克隆中所占的比例。插入效率：有插入片段的克隆在所有檢測的克隆中所占的比例。基因組覆蓋倍數平均插入片段長度基因組覆蓋倍數平均插入片段長度克隆數克隆數/基因組基因組 DNA 的長度的長度（一般是約數（一般是約數 ）；）； 基因組覆蓋度是指文庫中的克隆覆蓋基因組的范圍，檢測時是通過選基因組覆蓋度是指文庫中的克隆覆蓋基因組的范圍，檢測時是通過選擇一定數目的已知的單拷貝的基因作探針來篩選文庫。由于所使用的每擇一定數目的已知的單拷貝的基因作探針來篩選文庫。由于所使用的每個探針篩選的克隆數目即表明文庫中對該基因位點的覆蓋倍數，

8、因此，個探針篩選的克隆數目即表明文庫中對該基因位點的覆蓋倍數，因此，基因組覆蓋倍數又等于所有探針篩到的陽性克隆的總個數基因組覆蓋倍數又等于所有探針篩到的陽性克隆的總個數/使用的總探使用的總探針數的比值針數的比值 第二節第二節 cDNA文庫的構建文庫的構建 cDNA 文庫中的外源文庫中的外源 DNA 片段是互補片段是互補 DNA （complementary DNA , cDNA）。）。 cDNA 是由生物的某一特定器官或特定發育時期細胞內的是由生物的某一特定器官或特定發育時期細胞內的 mRNA 經體外反轉錄后形成的雙鏈經體外反轉錄后形成的雙鏈 cDNA 。 cDNA 文庫代表生物的某一特文庫代

9、表生物的某一特定器官或特定發育時期細胞內轉錄水平上的基因的群體，并不能包括該生定器官或特定發育時期細胞內轉錄水平上的基因的群體，并不能包括該生物的全部基因，且這些基因在表達豐度上存在很大差異。物的全部基因，且這些基因在表達豐度上存在很大差異。 cDNA 文庫構建步驟：文庫構建步驟： 細胞總細胞總 RNA 的提取和的提取和 mRNA 分離；分離； 第一鏈第一鏈 cDNA 合成；合成； 第二鏈第二鏈 cDNA 合成；合成； 雙鏈雙鏈 cDNA 克隆進質粒或噬菌體載體并導入宿主中繁殖。克隆進質粒或噬菌體載體并導入宿主中繁殖。 mRNA 在總在總 RNA 中所占比例很小，因此從總中所占比例很小，因此從

10、總 RNA 中富集中富集 mRNA 是構是構建建 cDNA 文庫和其它應用所必需進行的步驟。文庫和其它應用所必需進行的步驟。 目前目前mRNA的純化的純化 方法：在固體支持物表面共價結合固定一段由脫方法：在固體支持物表面共價結合固定一段由脫氧胸腺嘧啶核苷組成的寡聚核苷酸氧胸腺嘧啶核苷組成的寡聚核苷酸 oligo（dT）鏈，由它與鏈，由它與 mRNA 的的 Poly（A）尾巴雜交，從而吸附固定住）尾巴雜交，從而吸附固定住 mRNA ，進而將，進而將 mRNA 從其它組從其它組分中分離出來。分中分離出來。1mRNA 的完整性的完整性 指導合成高分子量蛋白質的能力；指導合成高分子量蛋白質的能力； 指

11、導合成目的多肽的能力（利用免疫共沉淀和指導合成目的多肽的能力（利用免疫共沉淀和SDS-PAGE）；）； mRNA 的大小（的大小（500bp-8kb，多數，多數1.5-2kb）；）； 總總 mRNA 制劑指導合成制劑指導合成 cDNA 第一鏈長分子的能力。第一鏈長分子的能力。 一、一、 mRNA 的分離的分離3mRNA 的富集的富集 3.1 按大小對按大小對 mRNA 進行分級分離進行分級分離 3.2 cDNA 的分級分離的分級分離近年來多采用此方法，特別是大近年來多采用此方法，特別是大 mRNA ，可避免降解，可避免降解 mRNA , agarose 分離大小易辨。分離大小易辨。 3.3 多

12、聚核糖體的免疫學純化法多聚核糖體的免疫學純化法用抗體來純化合成的目的多肽的多聚核糖體。用抗體來純化合成的目的多肽的多聚核糖體。 免疫親和柱免疫親和柱/ A蛋白蛋白-Sepharose 柱，單克隆抗體把正在合成新生鏈柱，單克隆抗體把正在合成新生鏈的多聚核糖體結合到的多聚核糖體結合到 A 蛋白蛋白-spharose 柱上，隨后用柱上，隨后用 EDTA 解離下來，解離下來，通過通過 oligo（dT）層析分離）層析分離 mRNA 。此法分離的。此法分離的 mRNA 只占總只占總 mRNA 的的 0.01-0.05% 。2mRNA 的豐度的豐度 高豐度高豐度 mRNA ：在特定細胞中占：在特定細胞中占

13、 50-90%，如：免疫球蛋白，如：免疫球蛋白 。 低豐度低豐度 mRNA ：含量：含量 0.5% 被稱為低豐度或稀有被稱為低豐度或稀有 mRNA 。二、二、cDNA 第一鏈的合成第一鏈的合成常用的反轉錄酶：常用的反轉錄酶： AMV （來自禽成髓細胞瘤病毒）（來自禽成髓細胞瘤病毒） MMLV （來自（來自 Moloey 鼠白血病病毒）鼠白血病病毒）依賴于依賴于 RNA 的的 DNA 聚合酶，有聚合酶，有 5-3 DNA 聚合酶活性。聚合酶活性。合成合成 DNA 常用的引物：常用的引物： Oligo（dT）和隨機引物。）和隨機引物。 Oligo（dT）引）引物一般包含物一般包含 1020 個脫氧

14、胸腺嘧啶核苷和一段帶有稀有酶切位點的個脫氧胸腺嘧啶核苷和一段帶有稀有酶切位點的引物共同組成，隨機引物一般是包含引物共同組成，隨機引物一般是包含 610 個堿基的寡核苷酸短片個堿基的寡核苷酸短片段。段。 Oligo（dT）引導的）引導的 cDNA 合成是在合成是在 cDNA 的合成過程中加入高濃度的的合成過程中加入高濃度的 Oligo（dT）引物，）引物， Oligo（dT）引物與）引物與 mRNA 的的 3 末端的末端的 poly（A）配）配對，引導反轉錄酶以對，引導反轉錄酶以 mRNA 為模板合成第一鏈為模板合成第一鏈 cDNA 。這種。這種 cDNA 合成的合成的方法在方法在 cDNA 文

15、庫構建中應用極為普遍，其缺點主要是由于文庫構建中應用極為普遍，其缺點主要是由于 cDNA 末端存末端存在較長的在較長的 poly（A）而影響）而影響 cDNA 測序。測序。 隨機引物引導的隨機引物引導的 cDNA 合成是采用合成是采用 610 個隨機堿基的寡核苷酸短片段來錨個隨機堿基的寡核苷酸短片段來錨定定 mRNA 并作為反轉錄的起點。由于隨機引物可能在一條并作為反轉錄的起點。由于隨機引物可能在一條 mRNA 鏈上有多個鏈上有多個結合位點而從多個位點同時發生反轉錄，比較容易合成特長的結合位點而從多個位點同時發生反轉錄，比較容易合成特長的 mRNA 分子的分子的 5-端序列。隨機引物端序列。隨

16、機引物 cDNA 合成的方法不適合構建合成的方法不適合構建 cDNA 文庫，一般用于克隆文庫，一般用于克隆特定特定 mRNA 的的 5 末端，如末端，如 RT-PCR 和和 5-RACE 。 1自身引導法：自身引導法： 首先用氫氧化鈉消化雜合雙鏈中的首先用氫氧化鈉消化雜合雙鏈中的 mRNA 鏈，解離的第一鏈鏈，解離的第一鏈 cDNA 的的 3-末端就會形成一個發夾環（發夾環的產生是第一鏈末端就會形成一個發夾環（發夾環的產生是第一鏈 cDNA 合成時的特性，原因至今未知，據推測可能是與帽子的特殊結構相合成時的特性，原因至今未知，據推測可能是與帽子的特殊結構相關），并引導關），并引導 DNA 聚合

17、酶復制出第二鏈，此時形成的雙鏈之間是連聚合酶復制出第二鏈，此時形成的雙鏈之間是連接在一起的，再利用接在一起的，再利用 S1 核酸酶將連接處（僅該位點處為單鏈結構）核酸酶將連接處（僅該位點處為單鏈結構）切斷形成平端結構可以進行連接。切斷形成平端結構可以進行連接。三、三、cDNA 第二鏈的合成第二鏈的合成2置換合成法：置換合成法：RNaseH：將：將mRNAcDNA 雜合雙鏈中的雜合雙鏈中的 mRNA 鏈切割成很多的鏈切割成很多的小片段；小片段；大腸桿菌大腸桿菌 DNA 聚合酶聚合酶 ：以形成的小片段為引物，以第一鏈：以形成的小片段為引物，以第一鏈 cDNA 為模板合為模板合成一段段互補的成一段段

18、互補的 cDNA 片段。片段。 DNA 連接酶：合成的這些小連接酶：合成的這些小cDNA片段被連接成一條鏈。片段被連接成一條鏈。3引導合成法：引導合成法： 本方法是本方法是 Okayama 和和 Berg 1982 提出的。首先是制備一端帶有提出的。首先是制備一端帶有 Poly（dG）的片段）的片段 和帶有和帶有 Poly（dT）的載體片段）的載體片段 ，并用片，并用片段段 來代替來代替 Oligo（dT）進行）進行 cDNA 第一鏈的合成，在第一鏈第一鏈的合成，在第一鏈 cDNA 合成后直接采用末端轉移酶（合成后直接采用末端轉移酶（TdT）在第一鏈）在第一鏈 cDNA 的的 3-端端加上一段

19、加上一段 Poly（dC）的尾巴，同時進行酶切創造出另一端的粘端，）的尾巴，同時進行酶切創造出另一端的粘端，與片段與片段 一起形成環化體，這種環化了的雜合雙鏈在一起形成環化體，這種環化了的雜合雙鏈在 RNaseH 、大腸桿菌大腸桿菌 DNA 聚合酶聚合酶 和和 DNA 連接酶的作用下合成與載體聯系連接酶的作用下合成與載體聯系在一起的雙鏈在一起的雙鏈 cDNA 。其主要特點是合成全長。其主要特點是合成全長 cDNA 的比例較高，的比例較高，但操作比較復雜，形成的但操作比較復雜，形成的 cDNA 克隆中都帶有一段克隆中都帶有一段 Poly（dC）/（dA），對重組子的復制和測序都不利。），對重組子

20、的復制和測序都不利。 4引物銜接頭合成法引物銜接頭合成法第一鏈合成后直接采用末端轉移酶在第一鏈第一鏈合成后直接采用末端轉移酶在第一鏈 cDNA 的的 3-端加上一段端加上一段 Poly（dC）的尾巴，然后用一段帶接頭序列的的尾巴，然后用一段帶接頭序列的 Poly（dG）短核苷酸鏈作引物合成互補的）短核苷酸鏈作引物合成互補的 cDNA 鏈，接頭序列可以是適用于鏈，接頭序列可以是適用于 PCR 擴增的特異序列或用于方便克隆的酶擴增的特異序列或用于方便克隆的酶切位點的序列。這一方法目前已經發展成切位點的序列。這一方法目前已經發展成 PCR 法構建法構建 cDNA 文庫的常用方法。文庫的常用方法。 c

21、DNA 克隆時常出現丟失末端序列的現象，需較長時間獲得全長克隆時常出現丟失末端序列的現象，需較長時間獲得全長 cDNA 克克隆。隆。 cDNA 克隆中克隆中, 得到了不完整的片段得到了不完整的片段, 可采用此方法獲得可采用此方法獲得 3 末端和末端和 5 末末端的序列。工作原理見后圖。篩選文庫時一般只能回收一個或幾個端的序列。工作原理見后圖。篩選文庫時一般只能回收一個或幾個 cDNA 克隆，克隆， 而而 RACE 可產生大量獨立克隆。引物可產生大量獨立克隆。引物 GSP1 根據已經得到的不完整根據已經得到的不完整的的 cDNA 的序列設計。的序列設計。 （3） RACE（ random amp

22、lification of cDNA ends） 第三節第三節 基因克隆的篩選策略基因克隆的篩選策略 一般來說，這一篩選過程的難易程度，主要取決于所一般來說，這一篩選過程的難易程度，主要取決于所采用基因的克隆方案和目的基因的性質與來源。從文庫中采用基因的克隆方案和目的基因的性質與來源。從文庫中篩選目的基因的方法主要有：核酸雜交法、特異性抗原的篩選目的基因的方法主要有：核酸雜交法、特異性抗原的免疫學檢測法、免疫學檢測法、PCR篩選法。篩選法。 基因克隆的本質：從文庫中篩選目標克隆，重點在篩選。基因克隆的本質：從文庫中篩選目標克隆，重點在篩選。常見篩選工具：探針（常見篩選工具：探針（probe）

23、狹義：核酸，抗體狹義：核酸，抗體 廣義：還包括其他篩選手段。廣義：還包括其他篩選手段。 生物體的表型特征由控制其性狀的基因編碼。因此，可以通過生物體的表型特征由控制其性狀的基因編碼。因此，可以通過觀察表型的變化來篩選目的基因。表型篩選法就是根據目的基因編觀察表型的變化來篩選目的基因。表型篩選法就是根據目的基因編碼比較特殊的功能，并且載體的幫助下可以在宿主菌（如大腸桿菌）碼比較特殊的功能，并且載體的幫助下可以在宿主菌（如大腸桿菌）中表達該基因，表現出其特殊的功能所決定的表型性狀來，這樣就中表達該基因，表現出其特殊的功能所決定的表型性狀來，這樣就很容易通過導入的基因帶來新的功能或恢復其缺失的功能來

24、確定目很容易通過導入的基因帶來新的功能或恢復其缺失的功能來確定目的基因。的基因。一、表型篩選法一、表型篩選法 抗性基因：抗生素抗性基因、抗重金屬抗性基因抗性基因：抗生素抗性基因、抗重金屬抗性基因 分解基因：苯環化合物、分解酶分解基因：苯環化合物、分解酶 功能活性：殺蟲、酶功能活性：殺蟲、酶 啟動子啟動子/復制子：復制子： 功能缺失：在獲得相應突變體的前提下，以此突變體作為宿主，功能缺失：在獲得相應突變體的前提下，以此突變體作為宿主，將野生型的將野生型的DNA導入后檢測回復突變（如：營養缺陷型相關的基導入后檢測回復突變（如：營養缺陷型相關的基因）。因）。 當目標基因是未知功能的基因或一些不能在原

25、核生物中表達當目標基因是未知功能的基因或一些不能在原核生物中表達的真核生物的基因，可以利用的可能只是該基因的部分序列、同的真核生物的基因，可以利用的可能只是該基因的部分序列、同源基因片段或不完整的蛋白質產物，此時就必須考慮其它的方法源基因片段或不完整的蛋白質產物，此時就必須考慮其它的方法來篩選。雜交篩選法是應用最為廣泛的篩選目標基因克隆的一種來篩選。雜交篩選法是應用最為廣泛的篩選目標基因克隆的一種方法。方法。二、雜交篩選二、雜交篩選 同源同源DNA探針：探針： 高度保守的基因高度保守的基因 rRNA基因基因 鄰近種屬的相應基因鄰近種屬的相應基因 相應基因的序列比較相應基因的序列比較 合成寡核苷

26、酸：合成寡核苷酸： 蛋白質蛋白質N-末端末端aa序列序列 簡并探針簡并探針 根據密碼子的使用頻率，合成猜測體探針根據密碼子的使用頻率，合成猜測體探針 設計兩組簡并探針，用第二個探針對第一次篩選的陽性克隆子作設計兩組簡并探針，用第二個探針對第一次篩選的陽性克隆子作第二次雜交第二次雜交實驗組實驗組mRNA & 對照組對照組mRNA 分別制備探針（分別制備探針（mRNA或或cDNA) 分別篩選含目的基因的分別篩選含目的基因的cDNA文庫文庫 陽性菌落陽性菌落x光底片顯色光底片顯色 比較比較x光底片和對照平板，挑出含目的基因的菌落光底片和對照平板，挑出含目的基因的菌落 鑒定目的基因鑒定目的基因

27、 (一一) 差別雜交差別雜交 (differential hybridization )優點優點 - 簡便、直觀簡便、直觀缺點缺點 - 敏感性不高，難以獲得低豐度差異表達基因敏感性不高，難以獲得低豐度差異表達基因 - 膜雜交篩選工作量大，信號強度可比性不佳膜雜交篩選工作量大，信號強度可比性不佳 實驗組實驗組mRNA&對照組對照組mRNA 反轉錄為單鏈反轉錄為單鏈cDNA（量少）（量少）- 生物素標記生物素標記mRNA（量多）（量多） 雜交雜交(約約1:20) 生物素標記生物素標記mRNA：cDNA雜合子雜合子 與鏈球菌抗生物素蛋白進行交聯反應與鏈球菌抗生物素蛋白進行交聯反應 生物素標記

28、生物素標記mRNA：cDNA雜合子交聯于鏈球菌抗生物素蛋白上雜合子交聯于鏈球菌抗生物素蛋白上 去雙鏈結構去雙鏈結構 單鏈單鏈cDNA 制備差減探針制備差減探針 & 構建差減構建差減cDNA文庫文庫 差減差減cDNA文庫篩選文庫篩選 鑒定目的基因鑒定目的基因(二二) mRNA 減法雜交減法雜交（subtractive hybridization)原理：原理：SSH是差減雜交與是差減雜交與PCR結合的簡單、快速分離差異基因的方法。結合的簡單、快速分離差異基因的方法。其運用雜交動力學原理，即豐度高的單鏈其運用雜交動力學原理，即豐度高的單鏈DNA在退火時產生同源雜交在退火時產生同源雜交的速度快

29、于豐度低的單鏈的速度快于豐度低的單鏈DNA，從而使不同豐度的單鏈，從而使不同豐度的單鏈DNA得到均衡；得到均衡；抑制抑制PCR則利用鏈內退火優于鏈間退火的優點，使非目的基因片段兩則利用鏈內退火優于鏈間退火的優點，使非目的基因片段兩端反向重復序列在退火時產生類似發卡的互補結構端反向重復序列在退火時產生類似發卡的互補結構, 無法作為模板與引無法作為模板與引物配對，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增，從而使目的基因得物配對，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增，從而使目的基因得到富集、分離。到富集、分離。（三）（三） 抑制性差減雜交抑制性差減雜交(suppressive subtractive hyb

30、ridization, SSH)方法：方法： 提取實驗組和對照提取實驗組和對照組組mRNA合成雙鏈合成雙鏈cDNA，經識別，經識別4堿堿基的限制性內切酶切基的限制性內切酶切割；割； 實驗組實驗組cDNA平均平均分為分為2份，分別連接份，分別連接2個接頭；個接頭； 進行進行2輪差減雜交輪差減雜交和抑制和抑制PCR； 獲得富集的目的獲得富集的目的基因。基因。檢測組檢測組 (Tester) 含目的基因含目的基因cDNA，加接頭，加接頭驅逐組驅逐組 (Driver) 不含目的基因不含目的基因cDNA，不加接頭，不加接頭 * 接頭含接頭含PCR 引物引物正向正向SSH: 易感者易感者(Tester) +

31、 不易感者不易感者(Driver) 易感者特異表達或高表達基因易感者特異表達或高表達基因 反向反向SSH: 不易感者不易感者(Tester) + 易感者易感者(Driver) 不易感者特異表達或高表達基因不易感者特異表達或高表達基因優點：采用兩次差減雜交和兩次優點：采用兩次差減雜交和兩次PCR，保證了高特異性，保證了高特異性 (假陽性率可假陽性率可降至降至6); 在雜交過程中可使不同豐度基因均衡化，從而獲得低豐度在雜交過程中可使不同豐度基因均衡化，從而獲得低豐度差異表達基因差異表達基因;操作相對簡便，是目前分離新基因的主要方法。操作相對簡便，是目前分離新基因的主要方法。缺點：起始材料需要缺點：

32、起始材料需要g級量級量mRNA; SSH差減克隆片段較小，獲取差減克隆片段較小，獲取cDNA全全長序列有一定難度。長序列有一定難度。三、免疫篩選三、免疫篩選 免疫篩選法和核酸雜交的方法類似，只是其使用的探針不是免疫篩選法和核酸雜交的方法類似，只是其使用的探針不是核酸，而是特異性的抗體。適合免疫雜交法篩選的外源基因首先核酸，而是特異性的抗體。適合免疫雜交法篩選的外源基因首先要在宿主細胞中存在抗原蛋白的表達，用于篩選的要在宿主細胞中存在抗原蛋白的表達，用于篩選的 DNA 文庫必須文庫必須是表達文庫，通常是原核生物的基因組是表達文庫，通常是原核生物的基因組 DNA 文庫和真核生物的文庫和真核生物的

33、cDNA 表達文庫。而且，所檢測的對象為宿主中不編碼的基因或宿表達文庫。而且，所檢測的對象為宿主中不編碼的基因或宿主中缺失表達的基因。主中缺失表達的基因。四、高表達基因四、高表達基因 高豐度高豐度mRNA，如用苯肼做了貧血處理的兔網織紅細胞中，如用苯肼做了貧血處理的兔網織紅細胞中，血紅蛋白血紅蛋白mRNA的含量占絕大多數的含量占絕大多數 mRNA3末端有末端有12種可能的序列；種可能的序列； 以此以此12種引物引導種引物引導cDNA第一鏈合成；第一鏈合成； 以以10nt隨機引物引導隨機引物引導cDNA第二鏈合成，可產生第二鏈合成，可產生50-100條條100-500bp的條帶；的條帶； 12種

34、錨定引物和種錨定引物和20種隨機引物組成種隨機引物組成240組引物，產生約組引物，產生約20000種種DNA條帶。條帶。五、五、mRNA差別顯示差別顯示 酵母雙雜交系統由酵母雙雜交系統由Fields和和Song等首先在研究真核基因轉錄調控等首先在研究真核基因轉錄調控中建立。典型的真核生長轉錄因子，中建立。典型的真核生長轉錄因子， 如如GAL4、GCN4、等都含有二、等都含有二個不同的結構域個不同的結構域: DNA結合結構域結合結構域可與可與DNA序列的特定位點即上序列的特定位點即上游激活序列結合；轉錄激活結構域游激活序列結合；轉錄激活結構域協助協助RNA聚合酶聚合酶復合體激活復合體激活上游激活序列（上游激活序列（UAS）下游基因的轉錄。這兩個結構域的功能是獨立）下游基因的轉錄。這兩個結構域的