1、精選優質文檔-傾情為你奉上實驗四 微生物平板菌落計數法一、實驗目的學習并掌握平板菌落計數的基本原理和方法。 二、實驗原理 平板菌落計數法是將待測樣品經適當稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經過培養，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞。統計菌落數，根據其稀釋倍數和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數。但是，由于待測樣品往往不易完全分散成單個細胞，所以，長成的一個單菌落也可能來自樣品中的23或更多個細胞。因此平板菌落計數的結果往往偏低，為了清楚地闡述平板菌落計數的結果，現在已傾向使用菌落形成單位（cfu）而不以絕對

2、菌落數來表示樣品的活菌含量。 平板菌落計數法雖然操作較繁，結果需要培養一段時間才能取得，而且測定結果易受多種因素的影響，但是該計數方法的最大優點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗（如活菌制劑），以及食品、飲料和水（包括水源水）等的含菌指數或污染程度的檢測。 三、實驗器材 1 菌種：酵母菌。 2 培養基：YEB培養基。 3 儀器或其他用具： 1ml 無菌吸管，無菌平皿，盛有 4.5ml 無菌水的試管，試管架，恒溫培養箱等。四、實驗步驟 1 編號 取無菌平皿 9 套，分別用記號筆標明 10-4 、 10-5 、 10-6 （稀釋度）各 2 套，另取 6 支盛有 4.5ml 無菌水的試

3、管，依次標是 10-1 、 10-2 、 10-3 、 10-4 、 10-5 、 10-6 。 2 稀釋 用 1ml 無菌吸管吸取 1ml 已充分混勻的大腸桿菌菌懸液（待測樣品），精確地放 0.5ml 至 10-1 的試管中，此即為 10 倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。 將 10-1 試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支 1ml 吸管插入 10-1 試管中來回吹吸菌懸液三次，進一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸入管底，吹時離開液面，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內液體外溢。用此吸管吸取 10-1 菌液 1ml ，精確地放 0.5ml 至 10-2 試

4、管中，此即為 100 倍稀釋。······其余依次類推。 放菌液時吸管不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結果誤差較大。 3 倒平板法：1）取樣。用三支 1ml 無菌吸管分別吸取 10-4 、10-5 和 10-6 的稀釋菌懸液各 1ml ，對號放入編好號的無菌平皿中，每個平皿放 0.2ml 。 不要用 1ml 吸管每次只靠吸管尖部吸 0.2ml 稀釋菌液放入平皿中，這樣容易加大同一稀釋度幾個重復平板間的操作誤差。 2） 倒平板。盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至 45 左右的LB培

5、養基約 15 毫升 / 平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養基與菌液混合均勻，而又不使培養基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。 由于細菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養皿后，應盡快倒入融化并已冷卻至 45 左右的培養基，立即搖勻，否則細菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計數。 3）待培養基凝固后，將平板倒置于 37 恒溫培養基中培養。 4.涂布法：涂抹平板計數法與倒平板法基本相同，所不同的是先將培養基熔化后趁熱倒入無菌平板中，待凝固后編號，然后用無菌吸管吸取0.1ml菌液對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上（每個編號設三個重復）。再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻（圖22-3），每個稀釋度用

6、一個滅菌刮鏟，更換稀釋度時需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上2030min，使菌液滲透入培養基內，然后將平板倒轉，保溫培養，至長出菌落后即可計數。5 計數 培養 48h 后，取出培養平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數，并按下列公式進行計算：每毫升中菌落形成單位（ cfu ） = 同一稀釋度三次重復的平均菌落數×稀釋倍數× 5 一般選擇每個平板上長有 30300 個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適，同一稀釋度的三個重復對照的菌落數不應相差很大，否則表示試驗不精確。實際工作中同一稀釋度重復三個對照平板不能少于三個

7、，這樣便于數據統計，減少誤差。由 10-4 、 10-5 和 10-6 三個稀釋度計算出的每毫升菌液中菌落形成單位數也不應相差太大。 平板菌落計數法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的，一般三個連續稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養后，所出現的平均菌落數在 50 個左右為好，否則要適當增加或減少稀釋度加以調整。 五、實驗結果將培養后菌落計數結果填入下表： 稀釋度 10-4 10-5 10-6 1 2 3 平均 1 2 3 平均 1 2 3 平均 Cfu 數 / 平板                         每毫升中的 cfu 數       六、 思考題 （ 1 ）為什么融化后的培養基要冷卻至 45 左右才能倒平板？ （ 2 ）要使平板菌落計數準確，需要掌握哪幾個關鍵？為什么？ （ 3 ）試比較平板菌落計數法和顯微鏡下直接