1、第三章酶的分離純化第三章酶的分離純化第一節酶分離純化工作的基本原則及步驟第二節細胞破碎第三節酶的抽提第四節酶的純化第五節酶的純度與產量第六節酶的劑型與保存第一節酶分離純化工作的基本原則及步驟1926 年 Summer 制備了第一個結晶酶，自此以后，酶分離純化工作進展很快，現已有數以百計的酶制成了結晶，相當數量的酶達到了高度純凈，并根據酶的作用特點，理化性質、發展了各種類型的分離純化方法、試劑和設備。一、基本原則二、 酶分離純化的基本步驟為了能成功地進行酶的分離純化，需注意以下兩個基本原則：1. 防止酶變性失效防止酶變性失效是酶分離純化工作很重要的問題，這一點在純化后期尤為突出。一般地，凡是用以

2、預防蛋白質變性的方法與措施，都可考慮用于酶分離純化工作中。常見的措施有：（ 1 ）低溫 ：除少數例外，所有操作應在低溫下進行，有有機溶劑存在時，更應注意。二、酶分離純化的步驟酶分離純化時，一般要經過如下步驟：1. 細胞破碎：除在體液中提取酶或胞外酶，一般都要進行細胞破碎，促使胞內酶溶出，以利于抽 提。2. 抽提3. 純化下面分節對這三個基本環節加以介紹第二節細胞破碎細胞破碎的方法很多，有機械破碎法、物理破碎法、化學破碎法和酶學破碎法。二、物理破碎法四、酶學破碎法：通過機械運動所產生的剪切力作用，使細胞破碎的方法，稱為機械破碎法，常用的有如下幾種。1. 機械搗碎法：利用高速組織搗碎機的高速旋轉葉

3、片所產生的剪切力，將組織細胞破碎，轉速可高達 10000r/min 。常用于動物內臟、植物葉芽等脆嫩組織細胞破碎，也可用于微生物，尤其是細 菌的細胞破碎。此法在實驗寶和生產規模均可采用。通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素作用，使組織細胞破碎的方法，該稱為物 理破碎法。物理破碎法包括如下幾種方法；1. 溫度差破碎法：通過溫度的突然變化使細胞破碎。即將冷凍的細胞突然放進較高溫度的水中，或將在較高溫度中的細胞突然冷凍都可使細胞破壞。溫度差破碎法對那些較脆弱易破的細胞破碎效果較好。超聲波細胞破碎的程度與輸出功率和破碎時間有密切關系。同時受細胞濃度、溶液粘度， pH 值、溫度以及離子強度等因素的影響，必

4、須根據細胞種類以及酶的特性加以選擇。一般操作條件為： 音頻10kHz或20kHz;功率100、150W;溫度010C; pH4-7 ;處理時間310min,最好間隔幾次操作； 細胞濃度和溶液粘度不宜太高，最好采用對數生長期的細胞進行破碎。超聲波破碎在實驗室應用具有簡便、快捷、效果好等特點，特別適用于微生物細胞的破碎。但要在大規模工業生產中應用，困難很多。化學破碎法是應用各種化學試劑與細胞膜作用，使細胞膜結構改變而破壞的方法。化學破碎法中，常用的化學試劑有：有機溶劑和表面活性劑。在一定條件下，通過外加的酶或細胞自身存在的酶的作用，使細胞破碎的方法稱為酶學破碎法。第三節酶的抽提酶的抽提是指在一定條

5、件下，用適當的溶劑處理含酶原料，使酶充分溶解到溶劑中的過程。一、酶抽提的主要方法二、酶提取過程中應注意事項根據酶提取時，所采用的溶劑或溶液的不同，酶抽提的方法主要有鹽溶液提取，酸 溶液提取，堿溶液提取，有機溶劑提取等。1鹽溶液提取：大多數酶在一定濃度的鹽存在條件下，酶的溶解度增加，即鹽溶，但鹽濃度不能太高，否則溶解度反而降低，即鹽析。故：一般采用稀鹽溶液進行酶的提取，鹽濃度控制在0.02 0.5mol/L 。例如：用固體發酵生產的款曲中的 “-淀粉酶，糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mol /L的氯化鈉溶液或 0.020.05mol/L的磷酸緩沖液提取；酵母醇脫氫酶用 0.50.6mol/L

6、的 磷酸氫二鈉溶液提取；有少數酶，如霉菌產生的脂肪酶，用清水提取比鹽溶液提取的效果較好。在酶的提取過程中，為了提高提取率并防止酶變性失活，須注意以下幾點：1 溫度：通常抽提溫度應控制在0-10oC（ 0-4 oC） 。對某些耐溫的酶，如胃蛋白酶等，可適當提高抽提溫度，在37 oC 下保溫抽提，效果較好。因為提高溫度、可提高酶的擴散速度，增加酶的溶解度，有利于酶的提取。第四節酶的純化一、酶純化的一般原則二、酶純化中常用方法概述三、沉淀分離法四、離心分離法五、過濾與膜分離六、層析分離七、電泳分離八、酶的結晶九、濃縮與干燥十、酶純化實例三、沉淀分離法 沉淀分離是通過改變某些條件，使溶液中某種溶質的溶

7、解度降低，從而從溶液中沉淀析出，與其它溶質分離。在酶的分離純化中，經常采用此法。沉淀分離的方法有很多，如鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等。1 鹽析沉淀法2 等電點沉淀法3有機溶劑沉淀法4復合沉淀法（選擇性沉淀法）四、離心分離法離心是借助離心機旋轉所產生的離心力，使不同大小和不同密度的物質分離的技術，是酶的純化過程中最為常用的一種方法。進行離心分離時，應根據欲分離物質的大小，密度和特性的不同，選擇適當的離心機、離心方法和離心條件。1 離心機種類及用途2離心方法選擇3. 離心條件的確定五、過濾與膜分離1. 概述2. 粗濾3膜分離技術六、層析分離1 概述2. 吸附層析3離子交換層析4分子篩凝膠層析5

8、 親和層析七、電泳分離1 、電泳基本原理2、影響電泳因素3、主要電泳技術八、酶的結晶結晶是使溶質呈晶態從溶液中析出的過程，它是酶和蛋白質等生物大分子分離，純化方法之一。同時，結晶化合物也是生物大分子結構分析研究的材料。1、蛋白質和酶結晶條件2、結晶方法九、濃縮與干燥濃縮與干燥都是使酶與溶劑（通常是水）分離的過程，是酶分離純化過程中不可缺少的環節之一。1. 濃縮2.干燥1、 酶純化的一般原則在酶的提取液中，不可避免地雜有其它小分子和大分子物質，其中，小分子雜質在相繼的純化步驟中一般會自然地除去；而大分子雜質包括有：核酸、粘多糖、其它蛋白質。其中核酸和粘多糖易干擾后面的純化、故最好預先除去。核酸可

9、加硫酸鏈霉素，聚乙烯亞胺，魚精蛋白或MnCl 2等，使之沉淀移去，也可使用核酸酶降解。粘多糖則常用醋酸鉛、乙醇、丹寧酸和離子型表面活性劑等處理。余下就剩雜蛋白，而純化的主要工作，也是較困難的工作，就是要將酶從雜蛋白中分離出來。在進行酶與雜蛋白分離工作時，為獲得較好的分離效果，應注意以下基本原則：2、 酶純化工作中常用方法概述現有的純化方法都是以酶與雜蛋白在理化性質、穩定性上的差異以及酶的生物特性為依據而建立的，主要有如下幾類：1 根據溶解度建立的方法：鹽析法，有機溶劑沉淀法，共沉淀法及選擇性沉淀法，等電點沉淀法等。2根據分子顆粒大小、重量差別建立的方法：離心法、凝膠過濾法、超過濾法。1. 鹽析

10、沉淀法（ 1）鹽析法的原理：根據球蛋白在低鹽濃度的溶液中，溶解度隨鹽離子強度升高而增加，表現為“鹽溶 ”，而隨著鹽濃度繼續升高，并超出某一上限時，其溶解度又會以不同速度下降，表現為“鹽析 ” 的這一特性，由于酶和雜蛋白在高鹽濃度的溶液中，其溶解度存在差別而建立的一種純化方法。在鹽析條件下，蛋白溶解度與溶液離子強度間有如下關系：b.加固體（NH4） 2SO4：當蛋白溶液原來體積已經很大，而要達到的鹽濃度又很高時，以加固 體（NH4） 2SO4為宜，加入量可查表，也可以下式計算：W =（ g）式中：W: 1升Si飽和度溶液提高到 S2飽和度時，需加固體（NH4） 2SO4的量（g）S2、Si：分別

11、為需達到的和原來溶液的（ NH4） 2SO4飽和度，A、B:常數，與溫度有關，0oC時，A=0.27、B=70720oC 時 , A=0.29、 B=756（ 3）鹽析時的pH 控制：控制鹽析pH 可以提高純化效果，一般鹽析pH 宜接近待純化酶的等電點。因為等電點時，蛋白質或酶的溶解度最低，有利于鹽析。另外，有些酶易與雜蛋白形成某種結合，從而干擾鹽析，可控制pH<5 或 pH>9，使它們帶相同電荷，以減少絡合物形成，改善鹽析效果。（ 4）鹽析時溫度控制：鹽析溫度以4oC 為宜。此條件下酶溶解度低而穩定性強（ 5）鹽析時的蛋白質濃度控制：蛋白質濃度是鹽析時一個十分重要但又易被忽視的因

12、素。一般蛋白濃度<100ug/ml,鹽析沉淀很難形成，而當200ug/ml<蛋白濃度<1mg/ml,沉淀雖能形成，但耗時，且回收率不高。因此為獲得較好的鹽析效果，蛋白濃度應在img/ml 以上。b. 分級沉淀：由于各種酶及某蛋白在不同濃度的鹽溶液中，溶解度不同，故可采用分級沉淀法將其逐漸剝離。例如：兔肝SOD 分離時，采用如下分的沉淀步驟：反抽提法為：先加（NH4） 2SO4至50%飽和度，得沉淀，再將沉淀懸浮于 42%飽和度（NH4）2SO4 液中，溶解雜蛋白，而沉淀物即為RNA 聚合酶。反抽提法較一般分級沉淀法，具有一定的優越性： 許多蛋白質從溶液中析出較為容易，是非特異

13、性的，而要溶解卻有相當高的特異性，故反抽提法可以比較細致地除去雜蛋白。 反抽提法提取，酶不易失活，可能是因為酶蛋白在非溶解狀態較能抵御蛋白酶攻擊的緣故。2. 等電點沉淀法（ 1）等電點沉淀法原理：兩性電解質在等電點時，溶解度最低，而不同的兩性電解質是不同等電點，由此可 將酶純化。3. 有機溶劑沉淀法（ 1）有機溶劑沉淀法原理：利用不同蛋白質在有機溶劑中溶解度不同而使之分離的方法為有機溶劑沉淀法。沉淀原理如下：a.有機溶劑降低溶液的介電常數 由于分子間的引力是與溶劑的介電常數成反比，而有機溶劑能降低溶液的介電常數，加入有機溶劑，蛋白質分子間引力增加，溶解度降低。（ 3）溫度控制：大多數蛋白質遇有

14、機溶劑很不穩定，特別是在溫度較高（室溫）時， 極易變性失效，故操作應在0oC以下進行。有機溶劑必須先冷到-20°C-15°C,并在攪拌下緩慢加入，沉淀析出后應盡快在低溫下離心分離。（ 4） pH 控制：pH 以接近目的酶的等電點為宜。（ 6）有機溶劑沉淀法的優缺點a. 優點：沉淀易于分離，過濾，分辨率高，且有機溶劑易除去或回收，適用于食品工業用 酶制劑的制備。b. 缺點：易引起酶變性失活，故必須在低溫下操作且析出沉淀要盡快分離，分離出的沉淀 物應立即用水或緩沖液溶解，以盡量減少沉淀中有機溶劑的含量。4復合沉淀法（選擇性沉淀法）（ 1）復合沉淀法原理：在酶液中加入某些物質，使

15、它與酶形成復合物而沉淀，再用適當方法將酶從復合物 中重新析出，此即為復合物沉淀法。(2)酶沉淀劑：能與酶形成復合物沉淀的物質稱為酶(蛋白質)沉淀劑，常用的有單寧、聚丙烯酸 等(Wj分子聚合物。聚丙烯酸(Polyalrylic acid, PAA)PAA+酶 PAA-酶 JPAA-酶+Ca2+ PAA-Ca 2+ J + 酶PAA- Ca2+SO42- CaSO4+PAA (可循環使用)1 .離心機種類及用途(1)常速離心機：轉速 8000r/min ,用于細胞、細胞碎片、培養基殘渣及粗結晶等較大顆粒的 分離。(2)高速離心機：轉速1000025000r/min ,用于各種沉淀物、 細胞碎片及較

16、大細胞器的分離。(3)超速離心機：轉速 2500080000r/min ,有制備用、分析用、制備分析兩用3種類型。用于生物大分子、細胞器、病毒等的分離純化以及純度檢測、沉降系數和分子量的測定等。2.離心方法選擇：主要有差速離心、密度梯度離心、等密度梯度離心。(1)差速離心 ：a.含義：采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法，稱為差3）等密度梯度離心a. 含義：當欲分離的不同顆粒的密度范圍在離心介質的密度梯度范圍內時，在離心力作用下，不同浮力密度的物質顆粒或向下沉降，或向上漂浮，一直移動到與它們各自浮力密度恰好相等的位置（等密度點），形成區帶。這種方法稱為等密度梯度離心

17、。或稱為平衡等密度離心。3. 離心條件的確定離心分離的效果好壞與諸多因素有關。除了上述的離心機種類、離心方法，離心介 質及密度梯度等以外，主要的是確定離心機的轉速和離心時間。此外還要注意離心介質溶液的pH 值和溫度等條件。（2） 離心時間離心時間依據離心方法的不同而有所差別。差速離心時間：是指某種顆粒完全沉降到離心管底的時間。等密梯度離心時間：是指顆粒完全到達等密度點的平衡時間。密度梯度離心時間：是指形成界限分明的區帶的時間。對于密度梯度離心和等密度梯度離心所需的區帶形成時間或平衡時間，影響因 素很復雜，可通過試驗后確定。4）差速離心分離實例：差速離心分離細胞內組分1. 概述1）過濾含義：借助

18、于過濾介質將不同大小，不同形狀的物質分離的技術。2）過濾介質有：濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷及各種高分子膜。其中以各種高分子膜為過濾介 質的過濾稱為膜分離技術包括微濾、超濾，反滲透等。2. 粗濾（ 1）粗濾含義：借助過濾介質截留懸浮液中直徑大于2科m的大顆粒，而使固液分離的技術稱為粗濾。（ 2）粗濾常用介質：濾紙、濾布、玻璃纖維、陶瓷濾板等。（ 3）粗濾種類：常壓過濾、加壓過濾、減壓過濾。b. 加壓過濾：加壓過濾以壓力泵或壓縮空氣為過濾的推動力。在生產中常用的各種壓濾機屬于此類。為了加快過濾速度和提高分離效果，可采用添加助濾劑，降低懸浮液粘度和適當提高溫度等措施。加壓過濾設備比較簡單；過濾速度較

19、快，過濾效果較好，在生產中廣泛使用。3膜分離技術：（ 1 ）膜分離技術的含義：借助于一定孔徑的各種高分子薄膜，將不同大小、不同性狀和不同特性的物質顆粒或分子分離的技術，統稱為膜分離技術。（ 2）膜分離技術常用的薄膜：膜分離所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、硝酸纖維素、賽璐玢及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜，有時也可用動物膜和羊皮紙等。b. 電場膜分離：電場膜分離是在半透膜的兩側分別裝上正，負極，在電場作用下，小分子的帶電 物質或離子向著與其本身所帶電荷相反的電極移動，透過半透膜，而達到分離的目的。電滲析和離子交換電滲析即屬于此類。用途：透析主要用于酶、蛋白質、核酸等生物大分子的分離純化

20、，從中除去小分子物質，也可用于溶液的脫鹽等。透析設備簡單，操作簡便。但透析時間長；若不更換水或緩沖液時，只擴散到膜 內外平衡為止；透析結束時，透析袋內的保留液體積較大，濃度較低。1 概述1）層析法基本原理：2. 吸附層析（ 1 ）吸附層析含義：3離子交換層析：（ 1）離子交換層析的含義：般規律是:h. 交換劑選擇，應考慮交換容量，交換容量包括兩個方面：總交換容量：每克干離子子交換劑上帶有的總交換基數。實效交換容量：特定實驗條件下，實際可用于交換的交換基數，它與介質的PH 、離子強度、溫度等有關，也因目的酶分子大小而顯著不同。一般情況，離子交換纖維素的容量小于凝膠，而對于離子交換凝膠，分子量為1

21、0,000100,000 的選擇 SephadexA-50 或 C-50 ,分子量大于 400,000 的，選擇 SephadexA-25 或 C-25 ，或Sepharose。b. 上柱：打開離子交換柱出口閥，讓柱內液體慢慢流出。當液面剛好到達交換劑表面時，小心加進酶液，使酶液盡快均勻地分布于交換劑的全表面，然后均勻進入交換劑層進行離子交換。繼續加入酶液，直至交換劑的交換容量飽和為止。c. 洗脫和收集：上柱完畢后，先用水或緩沖液流過層析柱，使未吸附的物質洗出。然后用適當的洗脫液，將吸附在離子交換劑上的離子按親和力從小至大的順序逐次洗脫下來，分別收集，以達到分離的目的。注意：酶液中除了欲得到的

22、某種酶以外，還含有各種雜質。酶和雜質與離子交換劑的親和力不同，采用適當的洗脫液洗脫，可使酶與雜質分離。d. 離子交換劑再生：洗脫收集完畢后，為使離子交換劑再次使用，需要經過再生處理。含雜質較少時，再生只要用酸，堿或鹽進行轉型即可。但在離子交換劑含雜質較多的情況下，再生時要先經過酸、堿浸泡清洗，用水洗至中性，然后再轉型，以備再次上柱進行交換。如此循環往復，離子交換劑可反復使用一段較長的時間。如離子交換柱要較長時間停用，可在再生后，加入適當的防腐劑以防止微生物生長。陽離子交換樹脂常用0.02的疊氮鈉作為防腐劑。而陰離子交換樹脂常用的防腐劑是10ppm 的苯乙酸汞等。4分子篩凝膠層析（ 1）凝膠層析

23、基本原理：是以各種多孔凝膠為固定相利用溶液中酶與其它雜質分子大小不同而進行的分離技術。示意圖如下：為定量衡量各組分流出順序，常采用分配系數Kd 來量度。式中：V e 洗脫體積，表示某一組分物質從加進層析柱到流出液中該組分出現高峰時，所需的洗脫液的體積（ml） 。V 0 外體積，即為層析柱內凝膠一顆粒間空隙的體積（ml）V i 內體積，即為層析柱內凝膠顆粒內部各微孔體積的總和（ml）當某組分Kd=1 時，即 Ve=Vi+Vo即：洗脫體積=外體積+內體積，說明該組分可自由擴散，進出全部凝膠微孔，最后洗脫出來。而其它組分Kd 應介于 0-1 之間， Kd 小的先洗脫，Kd 大的后洗脫出來。Ve、 V

24、o、 Vi 與凝膠種類、凝膠型號、凝膠處理方法，裝柱量以及裝柱質量等因素有關，在裝好凝膠柱后，可通過實驗測得Vo, Vi,及某些已知組分的 Ve,從而計算 Kdo（ 2）凝膠層析法常用凝膠：主要有葡聚糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠a. 葡聚糖凝膠：葡聚糖凝膠是以葡聚糖（葡萄糖通過“ -1,6糖昔鍵結合而成白線性高分子）為單體,以 1,2 環氧氯丙烷為交聯劑，聚合而成的具多孔網狀結構的高分子化合物。商品名為Sephadex。其網孔的大小可通過調節交聯劑和葡聚糖的比例來控制，交聯度越大，網孔越小，交聯度越小，網孔越大。其結構如下圖：b. 瓊脂及瓊脂糖凝膠：瓊脂：瓊脂是一種天然的多糖混合物。將瓊

25、脂加一定量的水，加熱溶解后冷卻凝固 成凝膠。瓊脂凝膠有較大的孔隙，能分離的物質分子量范圍較大。但其強度較差，而且含有大量負電荷，用于凝膠層析時，會影響物質的分離效果。瓊脂糖凝膠：瓊脂中帶負電荷的組分為瓊脂膠（agaropectin）,含有磺酸基和竣基，通過精制， 可將瓊脂膠除去，而得到不帶負電荷的瓊脂糖（agarose）。 瓊脂糖是由D 半乳糖和3, 6脫水L 半乳糖相間結合而成的多糖。瓊脂糖可制成各種型號的瓊脂糖凝膠。其商品名也有多種。如瑞典的 Sepharose僅1下表），美國的 Bio-gel A,丹麥的 Gelarose等。瓊脂糖凝膠的特點：多孔，液體流動性好，取代基團多，對物質的吸附

26、性弱，分離范圍較大，適用于蛋白質、酶、多糖等多種物質的分離。但其穩定性較差，溫度超過40會熔化，使用時pH 范圍在49之間。改善瓊脂糖的穩定性：采用雙環氧丙烷等雙環氧化合物將其交聯，制成交聯瓊脂糖凝 膠。交聯瓊脂糖凝膠的結構堅實，保持了原有的多孔性和流動性等優點，適用的pH 范圍擴寬到312,并可在120c以下加熱滅菌，使之能更廣泛應用。特點：聚丙烯酰胺凝膠的化學穩定性好，強度高，通過改變單體和交聯劑濃度可使聚合成的凝膠孔徑改變。但在濃酸或濃堿的作用下，酰胺鍵會水解而生成羧基，使凝膠帶上電荷，成為離子交換基團，而影響凝膠層析效果。故，聚丙烯酰胺凝膠適宜在pH211的范圍內使用。商品聚丙烯酰胺凝

27、膠有多種型號。（ 3）凝膠層析操作過程：a. 裝柱：選擇好凝膠的種類和型號后，首先將一定量的干燥凝膠粒懸浮于,定量的干燥凝膠粒懸浮于510倍體積的溶液（與洗脫液相同）中充分溶漲，然后減壓排氣，裝進層析柱。裝柱時應注意凝膠分布均勻，不能有氣泡或裂紋存在。柱裝好后，不管使用與否，都應有液體（與洗脫液相同）浸過凝膠表面，以免混入空氣。4）凝膠層析法的應用：a. 作為分析工具，對混合物各組分進行鑒別。b. 作為脫鹽工具。c. 高分子溶液濃縮，利用干膠的吸收性。d. 除熱原。e. 測高分子物質分子量。f. 用于酶等物質的分離及純化。5 親和層析（ 1）親和層析的基本原理：親和層析是利用生物分子之間所具的

28、專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化的技術。酶與底物（包括輔助因子）、底物類似物或其競爭性抑制劑之間都具有較高的生物親和力，能專一而可逆地形成酶 配基絡合物。因此，當將這類配基偶聯固定于載體作為固定相時，含有待純化酶的溶液流經該固定相，該酶就能迅速而有選擇性地與相應配基結合，而其它雜質流出固定相，從而達到純化該酶的目的。（ 2）親和層析的載體：a.對載體要求：結構疏松，可使待純化分子自由地與配基接觸；必須具有大量可以和配基進行偶聯反應的基團；最好是惰性的不和雜蛋白分子產生非專一吸附；能耐受偶聯、吸附、洗脫各過程中 PH 、離子強度、溫度變化，以及變性劑等的反復處理。b. 常用載體：瓊脂糖凝

29、膠，葡聚糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，纖維素等，其中以瓊脂糖凝膠最理想，用的最多的瓊脂糖4B。a. 載體活化：偶聯之前先須活化，一般葡聚糖和瓊脂糖的糖羥基可用溴化氰活化，形成十分活 潑的亞氨基碳酸鹽衍生物。經活化后，如果配基的偶聯基團是伯胺基或芳香胺基，則可直接與之偶聯但如此聯結的親和劑，配基與載體距離太近，而酶活性部位常又在酶分子內部，難以與之結合，故通常在配基偶聯前還需加一段短臂。b. 加臂：在親和層析劑的加臂中，應注意： 臂的長度必須適中，太短效果不大，太長則可能導致非專一吸附。 臂應有可以和載體及配基進行共價偶聯的功能基團；不帶電荷，但親水，能經受化學處理。親和層析劑中常用臂有三類： 碳氫鏈

30、：如a , co 二胺化合物,a , w 氨基竣酸； 聚氨基酸：如聚 DL 丙氨酸，聚 DL 賴氨酸等。 某些天然蛋白質，如白蛋白等。其中第類最為常用。(5) 親和層析的一般過程：親和層析的操作過程主要包括：特定親和層析劑的制備、預處理平衡、裝柱、加樣吸附、洗滌洗脫、以及脫鹽再生。a. 特定親和層析劑的制備：采用瓊脂糖凝膠為母體，選用適宜的配基制成親和層析劑。例如：以細菌細胞壁的水解產物為配基，偶聯于瓊脂糖凝膠上，用于溶菌酶的分離純化；用環狀糊精作為配基，以環氧化物活化的瓊脂糖凝膠為母體制成親和層析劑，用于分離純化a 淀粉酶等。c. 洗滌：主要是除去非專一吸附的雜質，通常可用平衡緩沖液或其它緩

31、沖液淋洗。d. 洗脫：是層析過程中非常關鍵一步，常用洗脫方式有：非專一性洗脫：包括改變溫度洗脫、改變PH 洗脫、 改變離子強度洗脫、改變溶劑系統洗脫、加促溶劑洗脫和電泳解吸。專一性洗脫：包括半抗原競爭性洗脫、抑制劑競爭洗脫和底物類似物競爭洗脫。其他洗脫方式：包括變性、斷裂和降解洗脫。通過改變溫度進行的洗脫：這是由于溶質從液相吸附到惰性固相載體是一個放熱過程，因此，升高溫度能使吸附平衡移向解吸方向。而且，吸附過程愈是放熱大，隨著溫度升高愈易被洗脫。親和吸附服從這一規律，當被吸附的分子有不同的吸附熱時，通過改變溫度就可將它們分別洗脫下來。這種洗脫方法的優點是洗脫液中不需要加入鹽類等外來因素。例如：

32、吸附于AMP Sepharose 的激酶和脫氫酶類，這種洗脫方式特別有用，通過線性溫度梯度洗脫就能達到好的分離。通過加促溶劑進行洗脫：當親和力很大，如，kd<10-6 mol L 時，加促溶劑洗脫可達到較好的效果。如：加螯合劑可解吸由多價陽離子通過靜電鍵而形成吸附；加入與水相混溶的溶劑，如乙二醇、二甲亞砜、二甲乙亞胺等可解吸由范德瓦爾力和疏水鍵建立的專一性吸附。由于促溶離子具有破壞水的結構并削弱疏水鍵的作用，因而也可直接用作解吸洗脫劑。促溶離子在免疫親和層析中應用最多，它們的洗脫效果有如下規律：專一性洗脫：主要用于 族”專一性吸附劑或者結合力較低(如10-6 mol/L<kd<

33、;10-4 mol/L)的情況。進行這種洗脫時，常采用半抗原、類底物、抑制劑、輔助因子或其他與被吸附的成分有特殊親和力的物質。它們或者能競爭性地和被吸附物質結合，或者能競爭性地和配基結合，從而將目的酶替換洗脫出來。例如：用NADH將激酶或脫氫酶從 5' YMP Sepharose4B上洗脫下來。洗脫方式：通過升高親和洗脫劑濃度進行濃度梯度洗脫。用幾種不同的解吸劑(包括親和洗脫劑)進行脈沖洗脫。變性、斷裂和降解洗脫變性洗脫：在常用的洗脫都不適用時，可以選擇較激烈的變性手段進行洗脫。但是，這種洗脫也可能導致不可逆變性，而且即使是可逆變性，隨時間延長也可能向不可逆轉化，故在洗脫后應立即除去變

34、性劑。例如：可以加脲、鹽酸胍等，在低pH 條件下使被吸附的酶構象發生可逆改變而解吸下來。1、電泳基本原理帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳，不同物質，由于其帶電性質及顆粒大小、形狀不同，因而在一定的電場中，它們移動方向和移動速度也不同，故此可使它們分離。在電場中，顆粒移動速度以泳動度(或遷移率)表示，泳動度是指帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度，可用下式表示：2、影響電泳因素(1) 電場強度：電場強度指每1cm 距離的電壓降。電場強度越高，帶電顆粒泳動速度越快。一般E為210V/cm , V為100500V,為常壓電泳，電泳時間從幾十分鐘 幾十小時，常用分離大分子

35、。E為20200V/cm,為高壓電泳，電泳時間幾分鐘幾小時，多用于分離小分子物質。(2) 溶液PH： PH 影響帶電顆粒的解離，也即決定了顆粒所帶凈電荷的多少。對兩性電解質，PH 偏離 PI 越遠，帶電荷越多、泳動速度越快，PH=PI ，其凈電荷為零，不移動。(3) 離子強度：溶液離子強度越高、顆粒泳動速度越慢。一般離子強度為0.02 0.2 較適宜。(4) 電滲：在電場中，液體對于固體支持物的相對移動稱為電滲。電滲將改變顆粒在電場中的泳動速度。例如：在紙電泳中，由于濾紙纖維素上帶有一定量的負電荷，而使與紙相接觸的水分子感應而帶一些正電荷。水分子便向負極移動并帶動溶液中的顆粒一起向負極移動。若

36、顆粒本來向負極移動，則其表觀泳動速度將比其本來的泳動速度快；若顆粒原來向正極移動，則其表觀泳動速度慢于其本來的泳動速度；凈電荷為零的顆粒也會隨水向負極移動。3、主要電泳技術聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE )種類：按操作方式分為：垂直管形盤狀電狀、垂直板型電泳。按凝膠組成系統分為：連續凝膠電泳、不連續凝膠電泳、濃度梯度凝膠電泳、SDS 凝膠電泳等。a. 連續電泳：b. 不連續電泳：c. 濃度梯度凝膠電泳：d. SDS 凝膠電泳：主要用于測蛋白質分子量。連續凝膠電泳：采用相同的凝膠，即采用相同濃度的單體和交聯劑，用相同 pH 值和相同濃度的緩沖液制備成連續均勻的凝膠，然后在同一條件下進行電泳。聚丙烯

37、酰胺凝膠是由丙烯酰胺和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺(bis)在催化劑的作用下聚合而成的。常用催化劑如下：不連續凝膠電泳：電泳凝膠由二層或三層不同孔徑、不同pH 的凝膠層組成。不連續凝膠電泳能使稀樣品在電泳過程中濃縮成層后再進入分離膠分離，從而提高分辨能力。不連續凝膠電泳的凝膠層由上至下分別為：(1) 樣品膠：是包含樣品的大孔徑凝膠，丙烯酰胺濃度為緩沖液中聚合而成。其目的是防止樣品對流損失。有時可用混和后加樣，而取代樣品膠。(見示意圖)2.5% ,在 pH 6.7 6.8 的 Tris-HCl10%甘油或520%蔗糖與樣品液(2) 濃縮膠：用于使樣品濃縮成層的大孔徑凝膠。除了不含有樣品以外，其濃度、pH

38、 值和聚合方法均與樣品膠相同。濃縮膠濃縮樣品成層的原理：(1)由于在各層凝膠中均含有Tris-HCl , HCl幾乎全部解離為 C1-, C1-在電場中泳動速度最快，稱為快離子或先導離子；在電極緩沖液中含有甘氨酸，甘氨酸進入樣品膠和濃縮膠后，由于濃縮膠層的pH為6.76,8,甘氨酸只有0.11.0%解離成負離子，在電場中泳動速度很慢，稱為慢離子或隨后離子；而樣品液中所含的酶、蛋白質等組分的泳動速度介乎快離子和慢離子之間。當電泳開始后，快離子速度最快，走在最前面，與其后面的酶或蛋白質之間形成一個離子濃度較低的低電導區，低電導產生較高的電位梯度，這種高電位梯度使落在后面的蛋白質或酶分子加速移動，逐

39、漸趕上走在前頭的蛋白質或酶分子，從而使樣品在快離子和慢離子之間被濃縮成薄薄的一層。濃度梯度凝膠電泳： 電泳使用的凝膠，其丙烯酰胺濃度由上至下形成由低到高的連續梯度。梯度凝膠內部孔徑由上而下逐漸減小。電泳后不同分子量的顆粒停留在與其大小相對應的位置上，故此，濃度梯度凝膠電泳適宜用于測定球蛋白等分子的分子量。濃度梯度凝膠的配制：采用梯度混合器配制時，濃溶液置于混合室，稀溶液置于貯存室，兩室的液面保持同一水平。濃溶液和稀溶液中都按比例含有催化劑。但催化劑的量要控制好，以便有足夠的時間制成梯度凝膠。啟動梯度混合器后，流出的混合液經過導液管小心地引進玻璃管或玻璃板之間。在液面加一層蒸餾水，然后垂直放置，

40、讓其聚合成濃度梯度凝膠。梯度范圍由樣品中各組分的分子量決SDS-凝膠電泳：在聚丙烯酰胺凝膠制備時，加入12%的十二烷基硫酸鈉（SDS）,制成SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。SDS-凝膠電泳主要用于測定蛋白質的分子量。蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，其遷移率主要決定于其所帶的電荷以及分子的大小和形狀。但在聚丙烯酰胺凝膠中加入一定量的 SDS 以后， 蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于其分子量大小，而與分子形狀及其所帶電荷無關。在一定的條件下，蛋白質分子量與其電泳遷移率的關系可用下式表示：（ 2）等電聚焦電泳a. 等電聚焦電泳原理：利用兩性電解質載體（商品名為Ampholine） ，在電場作用下，能形

41、成一個由陽級到陰級連續增高的PH 梯度，當蛋白質，酶或多肽進入這個體系時，不同蛋白質即移動到與其等電點相當的PH 位置，從而使不同等電點蛋白質得以分離。c. 載體兩性電解質的必備條件： 在等電點狀態下有足夠的緩沖能力，以便控制好pH 梯度。 在等電點狀態下有足夠的導電能力，以便使一定的電流通過。而且要求各個等電點不同的兩性電解質有相同的導電系數，使整個體系中電導均勻，否則電導不均勻時，電位降有大有小，難于保持pH 梯度的穩定性。d. 理想的載體兩性電解質合成：用具有幾個PI 值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六胺）為原料，與不飽和酸（如丙烯酸）發生加合反應。見下圖e. 密度梯度等電聚焦：采用密度梯度溶液使PH 梯度穩定，以防止對流和避免已分離組分重新混和。密度梯度由重溶液和輕溶液在梯度混和器中，配制而成，常用密度梯度溶質是蔗糖、甘油，也可用乙二醇、甘露醇、右旋糖酐等。密度梯度溶液配制：重溶液 （例如 50% 的蔗糖溶液）， 一部分載體兩性電解質和樣品液置于梯度混和器的混和室，而輕溶液(如蒸餾水)，部分載體兩性電解質，和樣品置于貯存室，啟動攪拌器，打開閥門，流出液經導液管小心引入等電聚焦柱中，制成等電聚焦系統1、蛋白質和酶結晶條件(1) 純度：蛋白質和酶在溶液中必須達到一定純度，才