1、維生素B12的微生物工程生產研究進展摘要： 維生素 B12 是種人體必需的維生素，已經廣泛地用于醫療及食品行業。自然界中高等生物均不能合成維生素B12,工業生產中主要依賴少數細菌或者古細菌等的微生物發酵方式獲得。多年來，通過遺傳學改造菌株的代謝通路在菌株實際生產過程中極大地提高了產量。本綜述中，我們概述了維生素B12 的生物合成及其代謝調控，并從包括合成生物學和代謝工程等多個策略角度全面了解維生素B12 的微生物工程生產研究進展。關鍵詞：維生素B12；微生物工程；發酵工程；前言維生素B12(Vitamin B12)或稱鉆胺素(Cobalamin ),是一類含金屬鉆離子的B族維生素家族 1 。分

2、子結構是以鈷離子為中心的咕啉環和5,6- 二甲基苯并咪唑為堿基組成的胺素類化合物。維生素 B12 的發現始于對嚴重貧血患者的胃分泌物中檢測研究，美國內科醫生卡斯爾在正常人胃部檢測出維生素B12,卻無法在惡性貧血病患的胃分泌物中發現。維生素B12在機體內主要充當輔酶功能，主要參與碳上的氫原子與鄰位碳上一個基團之間的交換或者分子間的甲基轉移反應， 參與人體必需的氨基酸甲硫氨酸的體內循環途徑及四氫葉酸的再生等生命活動。當上述反應受阻， 核酸合成發生障礙而導致細胞分裂異常，出現巨幼紅細胞性貧血( megaloblastic anemia)2,即惡性貧血。當前工業界生產B12的途徑主要是依賴微生物工程，

3、而微生物的B12合成途徑主要包括兩類即從頭合成及補救途徑3 o微生物從頭生物合成維生素B12通過兩種代謝途徑：在細菌和古菌分別為好氧途徑或厭氧途徑。維生素 B12 也可以通過補救途徑利用大腸桿菌進行合成。 但這些菌株具有其自身缺點，例如發酵周期長，發酵復雜而且設備昂貴，培養基要求高以及缺乏優良的遺傳體系。迄今為止，研究者對于維生素B12 大多數都集中在傳統策略上，例如隨機誘變和發酵過程優化，而對代謝工程的研究卻很有限。最近， 工程師們將注意力轉移到大腸桿菌上，作為生產維生素B12 的平臺。鑒于生產途徑及其代謝調節的復雜性，研究者已對維生素B12生物合成進行了大量研究。一、維生素B12的生物合成

4、途徑微生物的B12合成途徑總體分兩類，即從頭合成( De novo Pathway)及補救途徑(SalvagePathway)。所謂從頭合成，是指原核生物利用小分子從頭合成維生素B12,包括有氧途徑和厭氧途徑。有氧途徑的合成主要是在非硝基甲烷菌中完成，而厭氧途徑則是在S. typhimurium,Bacillus megaterium ，和 P. shermanii 。微生物B12 合成首先是合成四吡咯環。四吡咯合成途徑的第一個前體是 ALA。ALA由C4途徑或C5途徑合成。在C4途徑中，來自甘氨酸和琥珀酰-CoA的酶ALA合酶彳W化ALA的形成。在 C5途徑中，ALA由谷氨酸通過三種酶促反應

5、合成。兩個 ALA分子通過膽色素原合成酶縮合形成單吡咯膽色素原，然后聚合四個膽色素原分子環化形成尿卟啉原 III 。該反應由酶膽色素原脫氨酶和尿卟啉原III 合成酶催化4 。補救途徑(Salvage Pathway )是細菌和古生菌獲得維生素B12 的另外一種途徑，從耗能角度而言非常有效。在革蘭氏陰性菌中，外源的皮質酮通過ATP結合盒(ABC)運輸系統運輸到細胞中， BtuC、 BtuD 和 BtuF 分別是膜滲透酶、atp 酶和質周結合蛋白組分。BtuB 是一種依賴于tonb的轉運體，位于外膜，將皮質酮運送到質周皮質酮結合蛋白BtuF 。后者將皮質遞送到位于內膜的BtuCD復合體。在通過細胞

6、膜運輸之后，Cobinamide被ACATB腺普化，家族內主要包括是 CobA, EutT 和 PduO5 。二、合成生物學角度提高維生素B12產量除了對微生物宿主進行遺傳改造或鑒定全新的微生物宿主，構建基于合成生物學角度而易于遺傳操作的異源生物也是合成維生素B12 是非常有前途的策略。在異源宿主中構建維生素B12生物合成途徑包括選擇合適的宿主、構建合成途徑以及途徑調節。在選擇理想寄主時應注意以下幾點。(1)宿主應有能力提供前體(例如ALA)和輔助因子(例如S-腺昔蛋氨酸)用于生產所需的化學物質 6 。 (2) 需要足夠的基因工程工具，例如表達載體，合適的基因片段7 。 (3) 適合于工業規模

7、的發酵，例如利用廉價且容易獲得的碳源，像葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。合適的宿主可以用來表達來源不同的維生素B12。為了評估維生素B12 生產的能力，工程菌株需要在最佳條件下培養。如何進行異源生物合成途徑的設計，需要注意考慮幾點。(1) 考慮到宿主細胞具有前體和輔因子的供應能力、是否具有構建基因工程菌的內在工具以及是否具有能夠使用廉價和容易獲得的碳源從而具備工業規模發酵能力。( 2)在體外和在體內驗證酶活性。通過光譜分析、質譜或微生物分析檢測體外或細胞內反應的產物。(3)通過基因組裝方法對外源DNA片段進行組裝，如 SLIC、CPEC Gibson、golden.、DNA組裝器和LCR等8。為了減少

8、建立代謝途徑的難度，將其分為單獨的模塊，這些模塊在異源宿 主中按照順序進行驗證，然后組裝。( 4)基于代謝產物的限量，應消除瓶頸效應，使代謝通量達到目標化合物的最大化。為了優化代謝途徑中的基因表達，可以在轉錄水平或翻譯水平上進行設計，從提高啟動子、RBS的基因拷貝數。（5）通過發酵實驗驗證工程菌的特性。從而優化各種底物（例如，ALA鉆離子、甜菜堿和DMB和不同的發酵條件（例如，溶解氧濃度、pH和溫度）以提高產率和生產率。三、維生素B12的代謝工程當種微生物具有自己的或異源的鈷胺合成途徑時，首要任務應致力于構建代謝網絡，以提高維生素 B12 的生產和產量9 。代謝工程允許微生物在整個有機體水平上

9、被工程化，從而生產出遠超出其天然能力的有價值的化學物質10 。 基于硅模擬的代謝設計和工程菌代謝狀態的實驗驗證促進了系統代謝工程。許多基因組代謝通量分析是基于實驗數據確定通量分布，并已用于精確估計限氧條件下反硝化細菌對不同比耗氧速率的中心碳代謝通量估算11 。代謝通量分析表明，葡萄糖主要由Entner-Doudoroff 和戊糖磷酸途徑分解代謝。較高的比氧攝取率加速了前體、甲基和NADPH勺供應，從而提高了維生素 B12的產量12。四、增加維生素B12產量的其他策略除上述方法外，還可以通過其他的代謝途徑提高維生素B12 產量。 例如，隨機誘變法，隨機誘變可產生具有高維生素B12 產量的菌株13

10、 。 具體方法可以通過紫外光或化學誘變劑都可以用來處理相應的微生物，然后可以選擇具有所需表型的菌株，從而提高生產力、遺傳穩定性或對高濃度有毒中間體的具有抗性。第二， 可以基于高通量篩選的方法，此方法已經用于從大型文庫獲得所需的突變體。通過基因重組，將隨機誘變和原生質體融合技術相結合從而提高雪氏瘧原蟲維生素B12 產量。 96h 后，工程菌株比親本菌株多產生約61%的維生素B1214 。第三種方法MAG砂。與隨機突變的基因組相比，MAG腿供了一種同時修飾多個基因組位置的有效方法。MAG片基于入紅色重組系統。在大腸桿菌基因組中重復引入靶向多個位點的SSDNA導致各種突變體。結合標準的高通量篩選方法

11、，MAG時成為一種快速和有效的工具，以獲得 理想 ”細菌生產者。第四種方法可稱為 “可跟蹤多重重組 （ TRMR） ” ， 這種方法可快速同步修改成千上萬個基因。例如可通過改變啟動子、翻譯位點、開關、振蕩器或傳感器的功能區域，進行廣泛的研究。為了更準確地測量維生素B12 的合成量，生物傳感器已被廣泛應用于高通量分析中?？赏ㄟ^熒光測量不易檢測的化學物質，生物傳感器間接地反映化學濃度。維生素B12 傳感器已用于輔酶研究B12的合成。其優點具有較高的靈敏度，熒光或發光報告可顯示細胞內維生素B12濃度。發酵工藝的優化可在培養基中添加維生素B12生物合成途徑的前體，如鉆離子、ALA DMB甘氨酸、蘇氨酸

12、或相容的溶質，如甜菜堿和膽堿?？梢酝ū崾歉ナ掀焦骄S生素B12 培養過程的副產物，可引起微生物細胞生長的反饋抑制。過膨脹床吸附生物反應器來控制丙酸的生成和DMB的添加，從而提高了維生素B12的生物合成。丙酸桿菌和富營養拉爾斯通菌的混合培養也可以解決這個問題，后者可以吸收前者產生的丙酸。為了降低培養基和發酵成本，可以使用廉價的碳源，如麥芽糖漿和玉米漿代替精制蔗糖15 。結語維生素B12廣泛應用于醫藥和食品工業，微生物通過復雜的途徑產生維生素B12。為了維持穩定的維生素B12 濃度， 其生物合成和轉運通過核糖開關在轉錄或翻譯水平上受到調節。維生素B12是通過微生物發酵生產的，使用 P. denit

13、rificans 和P. shermanii等菌株。由于可用于這些菌株的遺傳工具相對較少，且發酵過程復雜，因此菌株工程一直關注于隨機誘變和發酵過程的優化等傳統策略。其中必須引入新的工程工具，如系統代謝工程，來操縱這些菌株。除了維生素B12的天然生產者外，E. coli還被用作異源宿主。為了給維生素B12生產的微生物細胞工廠的建設提供指導。我們總結了合成生物學和代謝工程策略，以及其他已經或可以應用于維生素B12生產的傳統策略。這些策略已廣泛應用于微生物菌種工程，以改善許多其他化學品的生產。在明確了解微生物中維生素B12代謝的基礎上，利用這些策略應該促進微生物維生素B12產量的提高。參考文獻1.

14、Romain M. The role of Vitamin B12 in the critically ill-a review. Anaesth Intensive Care. 2016:Jul;44(4):447-52.2. Yadav MK,Manoli NM, Madhunapantula SV. Comparative Assessment of Vitamin-B12, Folic Acid and HomocysteineLevels in Relation to p53 Expression in Megaloblastic Anemia. PLoS One. 2016 Oct

15、 25;11(10)3. Swithers KS, Petrus AK, Secinaro MA, Nesbo CL, Gogarten JP, Noll KM, Butzin NC. Vitamin B 12 synthesisand salvage pathways were acquired by horizontal gene transfer to the Thermotogales. Genome Biol Evol.2012;4:7309.4. CohenGN.Biosynthesis of cobalamins including vitamin B 12 . In Micro

16、bial biochemistry. Dordrecht: Springer;2014. p. 555565.5. Moore TC, Newmister SA, Rayment I, Escalante-Semerena JC. Structural insights into the mechanism of four-coordinate Cob(II)alamin formation in the active site of the Salmonella enterica ATP:Co(I)rrinoidadenosyl-transferase enzyme: critical ro

17、le of residues Phe91 and Trp93. Biochemis-try. 2012;51:964757.6. Zhang L, Chen J, Chen N, Sun J, Zheng P, Ma Y. Cloning of two 5-ami-nolevulinic acid synthase isozymesHemA and HemO from Rhodopseu-domonas palustris with favorable characteristics for 5-aminolevulinic acid production. Biotechnol Lett.

18、2013;35:763- 8.7. Lee SY, Kim HU, Park JH, Park JM, Kim TY. Metabolic engineering of microorganisms: general strategies and drug production. Drug Discov Today. 2009;14:78- 88.8. de Kok S, Stanton LH, Slaby T, Durot M, Holmes VF, Patel KG, Platt D,Shapland EB, Serber Z, Dean J, et al. Rapid and relia

19、ble DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synth Biol. 2014;3:97- 106.9. Tee TW, Chowdhury A, Maranas CD, Shanks JV. Systems metabolic engineering design: fatty acid production as an emerging case study. Biotechnol Bioeng. 2014;111:849- 57.10. Choi KR, Shin JH, Cho JS, Yang D, Lee SY. Systems

20、 metabolic engineer-ing of Escherichia coli. EcoSal Plus. 2016;7:1.11. Toya Y, Shimizu H. Flux analysis and metabolomics for systematic meta-bolic engineering of microorganisms. Biotechnol Adv. 2013;31:81826.12. Wang Z-J, Wang P, Liu Y-W, Zhang Y-M, Chu J, Huang MZ, Zhuang YP,Zhang SL. Metabolic flux analysis of the central carbon metabolism of the in