1、第九章_色譜分析法導論 現 代 儀 器 分 析 的四大波譜: 光譜法、核磁共振波譜法 、色譜法、 質法、 光譜法: 利用光(電磁輻射)作為 “探針” 來探測物質性質、含量和結構的光學分析法.核磁共振波譜法:利用磁性核在外磁場作用下,核自旋能及躍遷原理來研究有機物的結構與組成的一種化學物理分析法.質譜法:是將待測樣品在離子源中轉化為離子,然后利用離子在電磁場中運動的性質,將離子按質荷比(m/e)分開,記錄并分析離子按質荷比大小排列質譜圖,通過對質譜圖的解析進行定性,定量分析. 色譜法:利用樣品中各組分在固定相與流動相中受到的作用力不同，而將待分析樣品中的各組分依次分離，然后順序檢測各組分含量的分

2、離分析方法。色譜法是一種分離技術,把這種分離技術應用到分析領域.并與適當的檢測手段結合起來,就是色譜分析法.由于色譜法的分離效率比常用分離方法(如重結晶、蒸餾、萃取等)高效.又有非常靈敏的檢測手段.因此應用范圍極其廣泛,已成為生產、科研等各部門不可缺少的分離分析手段.色譜法也叫層析法，它是一種高效能的物理化學分離技術，將它用于分析化學并配合適當的檢測手段，就成為色譜分析法。 色譜法的最早應用是用于分離植物色素，其方法是這樣的：在一玻璃管中放入碳酸鈣，將含有植物色素（植物葉的提取液）的石油醚倒入管中。一.色譜定義:：利用物質(樣品)中組分在固定相與流動相中受到作用力不同,而將待測樣品分離,然后順

3、序檢測各組分含量的一種物理化學分析方法. 四.色譜的分類:1. 按流動相狀態分:2、按固定相狀態分: 按固定相的形式分類可分為 按分離機理分類 5. 按照展開程序分類6. 按儀器分類：1.按流動相狀態分: 液相色譜 氣相色譜 液相色譜: 流動相為液體的色譜. 氣相色譜: 流動相為氣體的色譜. 2、按固定相狀態分:氣-固色譜: 流動相為氣體,固定相為固體的氣相色譜. 氣-液色譜: 流動相為氣體,固定相為流動的氣相色譜.液-固色譜: 流動相為液體,固定相為固體 的液相色譜. 液-液色譜: 流動相為液體,固定相為液體的 液相色譜.3 按固定相的形式分類可分為：柱 色譜： 固定相裝在色譜柱中； 紙色

4、譜： 利用濾紙作載體，吸附在紙 上的水作固定相；薄層色譜：將固體吸附劑在玻璃板或塑料板上制成薄層作固定相。 吸附色譜: 利用組分在吸附劑上 的吸附能力 強弱不同而得以分離的方法。分配色譜 : 利用組分在固定液（固定相） 溶解度不同而達到分離的方法。離子交換色譜 :利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而 達 到分離的方法。凝膠色譜 利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達到分離，稱排阻色譜法。 電 色 譜 利用帶電物質在電場下移動速度不同進行分離的色譜。親和色譜 利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力進 行分離的色譜 色譜分離的過程 遷移 擴散 遷移-分離 色譜過程

5、的熱力學性質有關 擴散-峰寬 色譜過程的動力學性質有關。如圖所示為一色譜流出曲線：（一）色譜流出曲線和色譜峰 由檢測器輸出的電信號強度對時間作圖,所得曲線稱為色譜流出曲線.曲線上突起部分就是色譜峰。 如果進樣量很小,濃度很低,在吸附等溫線或分配等溫線的線性范圍內,則色譜峰是對稱的.（二）基線：在實驗操作條件下，色譜柱后沒有樣品組分流出時的流出曲線稱為基 線，穩定的基線應該是一條水平直線。（三）峰高：色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以（h）表示。四) 色譜峰寬Y ： 色譜峰的區域寬度是色譜流出曲線的重要參數之一，衡量色譜柱的柱效及反映色譜操作條件下的動力學因素。寬度越窄，其效率越高，分離的效果也

6、越好。表示色譜峰區域寬度的三種方法1.標準偏差s：即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。2. 半峰寬Y1/2：即峰高一半處對應的峰寬。它與標準偏差的關系為 Y1/2=2.354s3. 峰底寬度Y：即色譜峰兩側拐點上的切線在基線上截距的距離.它與標準偏差s的關系是 Y= 4 s（五）保留值 1. 死時間 tm：不被固定相吸附或溶解的物質進入色譜柱時，到出現峰極大值所需的時間稱為死時間.它正比于色譜柱的空隙體積，因為這種物質不被固定相吸附或溶解.2.保留時間tr：試樣從進樣到柱后出現峰極大點時所經過的時間，稱為保留時間。3.調整保留時間tr´：某組分的保留時間扣除死時間后，稱為該組分的調整

7、保留時間，即 tr´= tr -tm 由于組分在色譜柱中的保留時間tr包含了組分隨流動相通過柱子所須的時間和組分在固定相中滯留所須的時間，所以tr實際上是組分在固定相中保留的總時間。保留時間是色譜法定性的基本依據，但同一組分的保留時間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積來表示保留值。4 死體積V0：色譜柱管內固定相顆粒間空隙、色譜儀管路和連接頭間空隙和檢測器間隙的總和。忽略后兩項可得到：5 保留體積Vr：指從進樣到待測物在柱后出現濃度極大點時所通過的流動相的體積。Vr=t r ×F0 6. 調整保留體積 Vr ： 某組份的保留體積扣除死體積后的體積。三. 色

8、譜流出曲線的意義：1 色譜峰數=樣品中單組份的個數；2 色譜保留值定性依據；3 色譜峰高或面積定量依據；4 色譜保留值或區域寬度色譜柱分離效 能評價指標；5 色譜峰間距固定相或流動相選擇是否 合適的依據。四 描述分配過程的參數v 1、分配系數(K)：v 2. 分配比： kv 3. K 與 k 的關系：v 4. 選擇因子a v 5 分配系數 K 及分配比 k 與選擇因子 的關 系 6 分離度 R1、分配系數(K)：它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定和流動相之間分配達平衡時的濃度之比值，即 2. 分配比： k：在一定溫度和壓力下，組份在兩相間的分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質量比，稱為分

9、配比k也等于組分的校正保留時間與死時間的比值k也等于組分的校正保留時間與死時間的比值k越大，停留時間也就越長3. K 與 k 的關系：v b 稱為相比率，它也是反映色譜柱柱型特點的參數。對填充柱，b=635；對毛細管柱， b=60600。4. 選擇因子a ：色譜柱對A、B兩組分的選擇因子a 定義如下：A為先流出的組分，B 為后流出的組分。v 注意：v K 或 k 反映的是某一組分在兩相間的分配v a 是反映兩組分間的分離情況！當兩組分 K 或 k 相同時，a =1 時，兩組分不能分開。 當兩組分 K 或 k 相差越大時，a 越大，分離得越好。也就是說，兩組分在兩相間的分配系數不同，是色譜分離的

10、先決條件a 和 k 是計算色譜柱分離效能的重要參數！5 分配系數 K 及分配比 k 與選擇因子的關系 對A、B兩組分的選擇因子，用下式表示： = t¢r (B) / t¢r (A) = k（A） / k（B） =K（A） / K（B） 通過選擇因子(相對保留值）把實驗測量值k與熱力學性質的分配系數K直接聯系起來. 對固定相的選擇具有實際意義。如果兩組分的K 或k值相等，則=1,兩個組分的色譜峰必將重合，說明分不開。兩組分的K或k值相差越大，則分離得越好。因此 兩組分具有不同的分配系數是色譜分離的先決條件。 下圖是 A、B兩組分沿色譜柱移動時，不同位置處的濃度輪廓。 溶質A和

11、B在沿柱移動時不同位置處的濃度輪廓 圖中KA>KB ， 因此，A組分在移動過程中滯后。 隨著兩組分在色譜柱中移動距離的增加，兩峰間的距離逐漸變大， 同時，每一組分的濃度輪廓（即區域寬度）也慢慢變寬 顯然，區域擴寬對分離是不利的，但又是不可避免的。若要使A、B組分完全分離，必須滿足以下三點： 第一，兩組分的分配系數必須有差異；第二，區域擴寬的速率應小于區域分離的速度；第三，在保證快速分離的前提下，提供足夠長的色譜柱。第一、二點是完全分離的必要條件。 6 分離度 R 分 離 度 R 是一個綜合性指標。它是既能反映柱效率又能反映選擇性的指標，稱總分離效能指標。 分離度又叫分辨率，它定義相鄰兩組

12、分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值，即 R = 2 (tr2 - tr1) / Y1 +Y2 R = (tr2 - tr1) / Y21/2+Y11/2R值越大，表明相鄰兩組分分離越好。 一般說，當R<1時，兩峰有部分重疊；當R=1時，分離程度可達98%； 當R=1.5時，分離程度可達99.7%。 §9.3 色譜法基本原理 色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離.組分要達到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數決定的，即與色譜過程的熱力學性質有關。 但當兩峰間雖有一定距離，如果每個峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。v 這些峰

13、的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質和擴散行為決定的，即與色譜過程的動力學性質有關。v 因此，要從熱力學和動力學兩方面來研究色譜行為。一塔板理論 最早由Martin等人提出塔板理論，把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，同時引人理論塔板數作為衡量柱效率的指標。 塔板理論是描述色譜柱中組分在兩相間的分配狀況及評價色譜柱的分離效能的一種半經驗式的理論將一根色譜柱當作一個由許多塔板組成的精餾塔，用塔板概念來描述組分在柱中的分配行為。v (一)塔板理論假定：1 塔板之間不連續；2 塔板之間無分子擴散；3 組分在各塔板內兩相間的分配瞬間達至平衡，達一次平衡所需柱長為理論塔

14、板高度H；4 某組分在所有塔板上的分配系數相同；5 流動相以不連續方式加入，即以一個一個的塔板體積加入。塔板理論是把色譜柱假想為一個精餾塔，塔內存在許多塔板.組分在每個塔板的氣相和液相間進行分配，達成一次分配平衡。然后隨著流動相按一個塔板、一個塔板的方式向前移動。v 經過多次分配平衡后，分配系數小的組分，先離開蒸餾塔（色譜柱），分配系數大的組分后離開蒸餾塔（色譜柱），v 從而使分配系數不同的組分彼此得到分離。下面我們再舉一個例子說明組分在色譜柱中的分配情況。 為簡單起見，設色譜柱由5決塔板（n=5n為柱子的塔板數）組成，并以塔板編號r表示r=0，1，2，3，4，5；某組分的分配比k=1。v 根

15、據上述假定在色譜分離過程中。該組分的分布可計算如下：開始時，將單位質量（即 m=1）的該組分進入0號塔板上，v 然后將流動相以一個板體積（V）一個板體積的脈動形式進入色譜柱；v 此時組分將安下表所示在固定相和流動相進行分配：v 由表中可見，當n=5時，即5個塔板體積的流動相進入柱中時，組分就開始從柱口流出。并且呈現先小后大的情況。v 以上是當塔板數為5時的情況，出現的峰形不對稱 ，這是由于塔板數太少的原因。v 所以色譜峰一般為正態分布。v 當塔板數大于50時，峰形就是對稱的。在實際色譜柱中，n值很大（約為106 109 ）。v （二）柱效能指標：v 對于一個色譜柱來說，其分離能力（叫柱效能）的

16、大小主要與塔板的數目有關，塔板數越多，柱效能越高。 v 色譜柱的塔板數可以用理論塔板數和有效塔板數來表示。1理論塔板數n：對于一個柱子下說，其理論塔板數可由下式計算：式中：tR為某組分的保留時間； W1/2為某組分色譜峰的半寬度； W 為色譜峰的峰底寬度。 由式可見，柱子的理論塔板數與峰寬和保留時間有關。 保留時間越大，峰越窄，理論塔板數就越多。柱效能也就越高。對于一個柱長固定為L的柱子，其理論塔板高度H為 每一個塔板的高度，即組分在柱內每一次分配平衡所需要的柱長叫理論塔板高度。它越小，也表示柱效能越高。v 2有效塔板數n有效：v 在以上計算理論塔板數的式子中使用的是保留時間，它包括了死時間，

17、它與組分在柱內的分配無關，因此不能真正反映色譜柱的柱效。為此，引入了有效塔板數的概念。v 同理有效塔板高度為：3.塔板理論的點：(1) 當色譜柱長度一定時，塔板數 n 越大 塔板高度 H 越小，被測組分在柱內被分配的次數越多，柱效 能則越高，所得色譜峰越窄。(2)不同物質在同一色譜柱上的分配系數不同，用有效塔板數和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質。 (3)柱效不能表示被分離組分的實際分離效果，當兩組分的分配系數 K 相同時，無論該色譜柱的塔板數多大，都無法分離。 (4)塔板理論無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。二速率理論范弟姆特方程式： 塔板理論是一個半經驗性的理論。它

18、定性的給出了板高的概念，但不能指出影響板高的因素。速率理論就是在塔板理論的基礎上，給出了影響塔板高度的因素：1）渦流擴散項(A) 在填充柱中，由于受到固定相顆粒的阻礙，組份在遷移過程中隨流動相不斷改變方向，形成紊亂的“渦流”：從圖中可見，因填充物顆粒大小及填充的不均勻性同一組分運行路線長短不同流出時間不同峰形展寬。展寬程度以A表示：A=2ldp其中 dp填充物平均直徑；l填充不規則因子。可見，使用細粒的固定相并填充均勻可減小A，提高柱效。對于空心毛細管柱，無渦流擴散，即A=0。2）分子擴散項(B/u) 縱向分子擴散是由于濃度梯度引起的。當樣品被注入色譜柱時，它呈“塞子”狀分布。隨著流動相的推進， “塞子”因濃度梯度而向前后自發地擴散，使譜峰展寬。展寬程度以B表示： B=2gD g 稱為彎曲因子，它表示固定相幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況；D組分在流動相中的擴散系數。組份為氣體或液體時，分別以Dg或Dm表示；q 分子量大的組分，Dg小，即B小 q Dg 隨柱溫升高而增加，隨柱壓q 降低而減小；q 球狀顆粒；大分子量流動相；適當增加