1、第二部分：蛋白質結構、功能及研究技術（曹勤紅老師） -橄欖枝整理第一章 蛋白質的分子結構及研究技術1. 氨基酸的分類按R 基團的極性分類a. 具有非極性或疏水R基團的氨基酸8種，丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸/蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、纈氨酸b. 具有極性不帶電荷R基團的氨基酸7種，絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、酪氨酸c. R基團帶負電荷的氨基酸(酸性氨基酸)2種（pH高于3時帶負電荷），天冬氨酸、谷氨酸d. R基團帶正電荷的氨基酸(堿性氨基酸)3種（在生理pH時帶正電荷），精氨酸(胍基)、組氨酸(咪唑基)、賴氨酸(-氨基)第21、22種氨基酸 硒代半胱氨酸

2、、吡咯賴氨酸2. 概念：蛋白質的一級結構、蛋白質的二級結構、蛋白質的超二級結構、蛋白質的結構域、三級結構、蛋白質的四級結構一級結構：指氨基酸在肽鏈中的排列順序。注意：蛋白質一級結構和共價結構的區別：蛋白質的共價結構包括肽鏈的數目、末端氨基酸殘基組成、氨基酸排列順序及二硫鍵位置等內容。二級結構：指多肽鏈主鏈有規律的折疊和盤繞，是多肽鏈主鏈局部的空間排列。維系二級結構的主要作用力是氫鍵。主要包括-螺旋、-折疊、-轉角和無規則卷曲等類型。超二級結構：在各種作用力的平衡下，若干相鄰的二級結構單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規則的，在空間上可辨認的二級結構組合體，充當三級結構的構件，稱為超二級結構，

3、也稱模體（motif）。主要包括組合、組合和組合等類型。結構域：對于較大的蛋白質分子，多肽鏈往往形成幾個緊密的球狀構象，這些球狀結構之間以松散的肽鏈相連，這些球狀構象被稱為結構域。三級結構：多肽鏈借助各種次級鍵和二硫鍵，通過盤繞折疊，形成具有特定肽鏈走向的緊密球狀構象，稱為三級結構。維持三級結構的作用力：氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、范德華力、二硫鍵。四級結構：具有三級結構的球狀蛋白質以非共價鍵彼此締合，形成一個高度有序的功能型聚集體，稱為蛋白質的四級結構。其是亞基的非共價締合。3. 蛋白質序列測定的一般策略蛋白質序列測定的一般步驟：（1）測序前的準備工作：包括純化蛋白質、測定蛋白質的分子量、末端氨基酸

4、殘基的分析、確定蛋白質的肽鏈數目或亞基數目、測定其氨基酸組成、配基的確定（2）序列測定：包括用至少兩種不同方法斷裂多肽鏈并分離小肽段、測定每個小肽段的序列（3）多肽鏈的結構重建：包括確定完整多肽鏈的序列、確定二硫鍵的位置、酰胺的位置蛋白質序列測定的一般策略：1 測定蛋白質分子中多肽鏈的數目2 拆分蛋白質分子的多肽鏈（寡聚蛋白質）3 斷開多肽鏈內的二硫橋4 分析每一多肽鏈的氨基酸組成5 鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端殘基6 裂解多肽鏈成較小的片段7 測定各肽段的氨基酸序列8 重建完整多肽鏈的一級結構9 確定半胱氨酸殘基間形成的S-S交聯橋的位置4. 列舉出三種測定蛋白質二級結構的方法。（1） 圓

5、二色性光譜法圓二色性：當振幅相等并同步的兩束左、右圓偏振光通過光活性物質時，由于該物質對這兩束光的吸收不同（對振幅減少不同），從而使左、右圓偏振光變成了橢圓偏振光，這種光學效應稱為圓二色性。蛋白質的圓二色性光譜只與構象有關圓二色性曲線：以摩爾橢圓度或吸光率之差為縱坐標，波長為橫坐標作出的曲線，稱為圓二色性曲線（圓二色性光譜、CD光譜）（2） 紫外差光譜法生色基團：分子中能夠在紫外區吸收光的基團稱為生色基團；差光譜：發色團的微環境決定于蛋白質分子的構象，構象改變則微環境發生變化，發色團的紫外吸收光譜也將隨之變化，包括吸收峰的位置、強度和譜形狀等。變化前后兩個光譜之差稱差光譜。一般來說，環境極性增

6、大，引起吸收峰向短波長方向移動，稱為藍移。環境極性減小，引起吸收峰向長波長方向移動，稱為紅移。測定：雙光束紫外分光光度計兩個濃度相同只是條件（pH、溶劑、離子濃度或溫度）不同的蛋白質樣品分別裝在參考杯和試驗杯中。種類：溶劑微擾差光譜、pH差光譜、變性差光譜（3） 熒光光譜法測定：測定蛋白質分子的自身熒光。向蛋白質分子的特殊部位引入熒光探測劑，然后測定熒光探測劑的熒光。蛋白質中能發射熒光的氨基酸殘基：Trp（色氨酸）、Tyr（酪氨酸）、Phe（苯丙氨酸）（4） 激光拉曼光譜法（5） 氫同位素交換法5. 比較X-衍射法和核磁共振法測定蛋白質三維結構的優缺點。X-射線晶體衍射的優越性：技術比較成熟

7、能夠達到非常高的分辨率, 1埃 占已知結構的80%以上,目前所有重要的蛋白幾乎都是X射線方法解出的 幾乎沒有分子量的限制, 200萬以上 晶體含約40%-60%水,基本上可視為自然狀態下的結構,如酶晶體有活力 收集數據快,可以全自動化 可以長出膜蛋白晶體核磁共振（NMR）在生物大分子上應用優越性： 不需要結晶； 蛋白質三維結構測定,原子分辨率下的結構與功能研究； 動態結構:溶液中,研究分子柔性與運動性及其它分子相互作用,測出一系列比較穩定的結構； 復合物結構測定,分子識別； 膜蛋白結構,已成功地用于菌視紫質及有機溶劑中細菌F1F0ATP酶的F0膜功能區的C單元的結構解析。核磁共振（NMR）的缺

8、點：必須同位素標記；數據處理復雜；目前最大MW 30KD, 260個殘基；要求蛋白沒有聚合，而且折疊良好，蛋白濃度高，量大，比較穩定；沒有X-線衍射的分辨率高, 核磁譜儀非常昂貴。第二章 蛋白質制備原理和研究技術 1.根據分子量大小分離蛋白質的方法及原理聚丙烯酰胺凝膠電泳原理（1） 不連續體系 上、下兩層凝膠孔徑不同；緩沖液離子組成和pH值不同；pH值不連續形成不連續的電位梯度（2） 三種效應 電荷效應、分子篩效應、濃縮效應聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種：化學聚合法和光聚合法。化學聚合以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基

9、乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產生自由基，后者引發丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產生甲叉鍵交聯，從而形成三維網狀結構。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：SDS：陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質分子的二級和三級結構。強還原劑：如巰基乙醇，二硫蘇糖醇（DTT)，能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。SDS強還原劑：單體蛋白質或亞基的多肽鏈處于展開狀態， SDS以其烴鏈與蛋白質分子的側鏈結合成復合體。一定條件下，SDS與大多數蛋白質的結合比為1.4g SDS/1g蛋白質，相當于每兩個氨基酸殘基結合一

10、個SDS分子。2.根據蛋白質電荷性質不同分離的方法及原理等電聚焦電泳：基本原理：利用蛋白質分子或其它兩性分子的等電點不同，在一個穩定的、連續的、線性的pH梯度中進行蛋白質的分離和分析。根據建立pH梯度原理的不同，可分為：（1）載體兩性電解質pH梯度等電聚焦：在電泳支持介質中加入載體兩性電解質，通過直流電壓在正負極之間形成穩定、連續和線性的pH梯度。蛋白質在pH梯度凝膠中受電場力作用下泳動，它的分離僅僅決定于其本身的等電點，是一個“穩態”過程。蛋白質分子一旦到達它的等電點位置，分子所帶凈電核為零，就不能再遷移。因此蛋白質在與其本身pI相等的pH位臵被聚焦成窄而穩的區帶。這種效應稱之為“聚焦效應”

11、，它保證了蛋白質分離的高分辨率。（2）固相pH梯度等電聚焦：利用一系列具有弱酸或弱堿性質的丙烯酰胺衍生物滴定時，在滴定終點附近形成pH梯度并參與丙烯酰胺的共價聚合，從而形成固定的、不隨環境電場等條件變化的pH梯度。雙向電泳：雙向電泳大都指第一向為等電聚焦，第二向為梯度SDS電泳。樣品經過電荷和質量兩次分離后，可以得到分子的等電點、分子量等信息。分離的結果不是帶，而是點。3.親和層析純化帶有組氨酸標簽（或GST標簽）重組蛋白的原理和方法金屬螯合層析：利用固定相偶聯的配基亞胺基二乙酸（IDA)與二價金屬離子發生螯合作用，該金屬離子又與蛋白質分子中的某些含有巰基或咪唑基的氨基酸結合。利用這種特性進行

12、層析分離的方法，稱為金屬螯合層析。金屬螯合層析用途很廣，尤其是分離某些重組蛋白的末端帶有組氨酸標簽的生物大分子極為有利。利用His Tag標簽進行親和層析：a. 構建表達載體，使目的基因帶上His Tag標簽b. 表達帶有His Tag標簽的目的蛋白c. 用Ni Sepharose HP（GE Healthcare ）等介質親和純化目標蛋白4.測定蛋白質濃度的方法和原理5.鹽溶和鹽析的概念及原因鹽溶：低濃度時中性鹽可以增加蛋白質的溶解度，這種現象稱為鹽溶(salting in)。鹽析：當溶液的離子強度增加到足夠高，例如飽和或半飽和的程度，很多蛋白質可以從水溶液中沉淀出來，這種現象稱為鹽析(sa

13、lting out)。鹽溶的原因：低濃度鹽存在時，蛋白質分子吸附少量相反電荷的鹽離子后，雙電層使蛋白質分子彼此排斥，而蛋白質與水分子之間的相互作用卻加強，因此增加了蛋白質的溶解性。鹽析的原因：水的活度降低（1）原來溶液中大部分甚至全部的自由水轉變為鹽離子的水化水；（2）原來被迫與蛋白質表面的疏水基團接觸的水分子被移去溶劑化鹽離子，疏水基團被暴露，疏水相互作用使蛋白質聚集而沉淀。6.親和層析的概念及一般程序親和層析概念：利用生物大分子的生物學特異性，即生物分子與其配體之間所具有的專一性親和力而設計的層析技術。一般程序：1. 選擇被分離蛋白質的配體（關鍵），將配體以適當的形式連接到支持物上（如瓊脂

14、糖）。2. 將支持物配體絡合物以適當的緩沖夜裝在柱中。3. 蛋白質混合物上到柱頂部。大多數蛋白質徑直通過柱，能與配體相互作用的蛋白質被阻留或被固定在柱上。4. 洗柱，除去不需要的蛋白質。5. 用適當的方法將吸附在柱上的蛋白質洗下來。第三章 蛋白質的結構與功能 1.牛胰核糖核酸酶A的變性和復性過程;牛胰核糖核酸酶A經尿素和巰基乙醇處理由天然、有活性的狀態變為去折疊狀態，二硫鍵被還原，失去活性；再經除去尿素和巰基乙醇，又恢復天然構象，二硫鍵重新形成，活性恢復。2.肌紅蛋白、血紅蛋白在進化中形成的多肽微環境作用;（1）固定血紅素基；（2）保護血紅素鐵免遭氧化；（3）為氧氣分子提供一個合適的結合部位。

15、3. 分析血紅蛋白與肌紅蛋白的氧結合曲線對于肌紅蛋白得到的是一條雙曲線；而對于血紅蛋白得到的是一條S型曲線。一個肌紅蛋白分子只能結合一分子氧，而血紅蛋白卻可以結合四分子氧，所以描述氧結合血紅蛋白的方程比肌紅蛋白就更復雜。S型曲線表明當第一個分子氧結合血紅蛋白時并不有利，可是一旦發生結合，就使得其它的氧分子更容易與余下的3個血紅素結合。4. 別構效應的概念大多數寡聚蛋白質調節它們的生物活性都是借助于亞基相互作用。多亞基蛋白質一般具有多個結合部位，結合在蛋白質分子的特定部位上的配體對該分子的其它部位所產生的影響（如改變親和力或催化能力）稱為別構效應。5. Bohr效應的概念及生理學意義Bohr效應

16、的概念：增加CO2濃度（降低pH），能降低Hb對氧的親和力，促進氧從Hb的釋放，這種現象稱為Bohr效應。Bohr效應的生理意義：當血液流經組織特別是代謝迅速的肌肉時，由于這里pH較低，CO2 濃度較高，因此有利于血紅蛋白釋放O2，使組織比單純的pO2降低獲得更多的氧，而氧的釋放又促使Hb與H+和CO2的結合，以補償由于組織呼吸作用形成的CO2所引起的pH降低，起著緩沖血液pH的作用。當血液流經肺部時，由于肺pO2高，有利于Hb與O2結合并因此促進H+和CO2的釋放，同時CO2的呼出有利于氧合血紅蛋白的生成。6. 鐮刀形細胞貧血病的分子機理正常的血紅蛋白是由兩條鏈和兩條鏈構成的四聚體，其中每條

17、肽鏈都以非共價鍵與一個血紅素相連接。鏈由141個氨基酸組成，鏈由146個氨基酸組成。鐮刀型細胞貧血癥患者的血紅蛋白的分子結構與正常人的血紅蛋白的分子結構不同。其基因發生單一堿基突變，正常基因第6個密碼子為GAG，編譯谷氨酸突變后變為GTG編譯纈氨酸，這種單個氨基酸的替代影響了血紅蛋白的正常合成，使其形態和性質發生了變化，導致鐮刀型貧血癥。7. 抗原、半抗原、抗體的概念抗原：能引起免疫反應的任何分子或病原體稱為抗原(antigen)半抗原：本身無抗原性，與載體蛋白結合后有了抗原性的物質稱為半抗原(hepten)抗體（免疫球蛋白）：是動物為反應外來物質的出現而合成的一種球蛋白。能與外來物質專一地結

18、合，從而消除外來物質對機體的毒害作用。8. 免疫熒光標記的原理（一般步驟）a用化學方法將熒光素(fluorescein)與抗體結合，但不影響抗原-抗體結合的活性；b用熒光抗體處理固定過的標本，在熒光顯微鏡下觀察熒光的出現，可用以鑒定標本中的抗原，并進行抗原的定位。c用高密度顆粒，如鐵蛋白，膠體金與抗體偶聯，然后利用電鏡觀察對結合部位進行高分辨率觀測。9. 酶聯免疫的應用酶聯免疫操作步驟（抗抗型）：a待測樣品中的蛋白質吸附到惰性表面，通常使用96#的聚苯乙烯塑料板。b表面加非特異性蛋白質溫育，封閉未被蛋白質覆蓋的部位。c用含抗待測蛋白質的抗體（一抗）溶液處理。d洗去未結合的抗體并與二抗溫育。與二

19、抗共價連接的酶可催化無色或無熒光底物變成有色或熒光產物。e通過測量顏色和熒光的密度來確定樣品中抗原的含量。酶聯免疫的應用a定量生物樣品中相應抗原的數量；b易于檢測，可以定量少于10-9g的專一抗原蛋白。10. 免疫印跡(Western blotting)的原理及一般步驟原理：將混合抗原樣品在凝膠板上進行單向或雙向電泳分離, 然后取固定化基質膜與凝膠相貼。在印跡紙的自然吸附力、電場力或其它外力作用下, 使凝膠中的單一抗原組份轉移到印跡紙上, 并且固相化。最后應用免疫覆蓋液技術如免疫同位素探針或免疫酶探針等, 對抗原固定化基質膜進行檢測和分析。基本步驟：免疫印跡法基本上可分為凝膠電泳、轉移、封閉、

20、一抗、酶標二抗、底物顯色等步驟。第四章 蛋白質相互作用的研究方法免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） 以抗體和抗原之間的特異結合為基礎，研究蛋白質相互作用； 當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體來免疫沉淀X，那么與X在細胞內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。酵母雙雜交（Yeast Two-hybrid System）原理：酵母的轉錄激活因子GAL4，在N端有一個由147個氨基酸組成的DNA結合域(DNA binding domain，BD)，C端有一個由113個氨基酸組成的轉錄激活域(transcript

21、ion activation domain，AD)。GAL4分子的DNA結合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)結合，而轉錄激活域則能激活UAS下游的基因進行轉錄。但是，單獨的DNA結合域和單獨的轉錄激活域都不能起作用，兩者只有當結合在一起或者空間上比較接近時，才能具有完整的轉錄激活因子的功能。雙分子熒光互補(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)原理：利用黃色熒光蛋白(YFP)作為報告基因，將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標蛋白連接。如果兩個目標蛋白因為相互作用而靠近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基團而發出熒光。在熒光顯微鏡下，通過直接觀察熒光變化就能確定兩個目標蛋白質是否具有相互作用，并且在最接近活細胞生理狀態的條件下觀察到其相互作用發生的時間、位置、強弱、所形成蛋白質復合體的穩定性，以及細胞信號分子對其相互作用的影響等。噬菌體展示技術原理：噬菌體展示技術是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時,外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術。Pull-down技術原理：Pull-down技術是將已帶有標記的餌蛋白（如生物素標