1、離子交換層析 1、酶分離純化、酶分離純化 將酶從細胞或培養基中取出，再與雜質分開，而獲得與使用目的要將酶從細胞或培養基中取出，再與雜質分開，而獲得與使用目的要求相適應的有一定純度的酶產品的過程。求相適應的有一定純度的酶產品的過程。 2、酶分離純化基本步驟、酶分離純化基本步驟 提取、純化、結晶或制劑。提取、純化、結晶或制劑。一、酶的提純概述一、酶的提純概述3、酶分離純化的原則、酶分離純化的原則 （1）原料來源方便，成本低，酶含量及比活力高，可溶性和穩定性好； （2）了解酶生物合成的基因分子學背景； （3）加工條件盡可能溫和，減少破壞天然構象而導致的酶失活； （4）提供有利于酶活保持的最適溶液環境

2、（pH、溫度、離子強度、金屬離子等）； （5）建立靈敏、特異、精確的檢測手段，有效評估純化過程。 （6）選擇恰當的純化策略（依據酶的性質選用各種純化技術，如凝膠過濾、離子交換、親和分離等）。4、酶提取液一般組成、酶提取液一般組成抽提液包含抽提液包含： 離子強度調節劑(常用蔗糖或的KCL) pH緩沖液 溫度效應劑（甘油、二甲基亞砜，以防酶分子因熱變性） 蛋白酶抑制劑（PMSF、DIFP） 抗氧劑（DTT、巰基乙醇） 重金屬絡合劑（EDTA、檸檬酸） 增溶劑（TritonX-100，抽提生物膜中的酶時需加此類除垢劑）5、酶的提純標準及劑型、酶的提純標準及劑型 （1 1）酶的純度標準）酶的純度標準

3、工業級、食品級、層析純、電泳純 （2 2）酶制劑的劑型）酶制劑的劑型 液體酶制劑：除菌、渣后純化直接制成或加以濃縮。 工業級固體酶制劑：純度不一定要求嚴格，但要符合安全衛生要求。直接濃縮干燥制成；或發酵液濾去菌后噴霧干燥制成；或加淀粉等填充物。 高純度固體純酶制劑：較高的純度要求，常作為分析試劑或用作醫療藥物。步驟步驟體積體積（ml）蛋白濃度蛋白濃度mg/ml）蛋白總量蛋白總量（mg）酶濃度酶濃度(u/ml)比活力比活力（u/mg）總活力總活力（u）產率產率（%）提純倍數提純倍數粗無細胞抽提液粗無細胞抽提液1000121200050.41650001001.0050熱變性除雜熱變性除雜蛋白蛋白

4、1000880004.80.604800961.44硫酸銨分級沉淀硫酸銨分級沉淀部分部分250375011.03.672730558.83DETE-凝膠層析凝膠層析pH梯度梯度（第（第50-60管）管）259225839.822004423.6離子交換層析離子交換層析KCL梯度梯度洗脫（洗脫（21-31管）管）573536452182036.4125凝膠過濾葡聚糖凝膠過濾葡聚糖G-100（第（第31-40管）合并管）合并100.929.2170185170034444 6、酶提純過程特征、酶提純過程特征（設想提純步驟）氯過氧化物酶提取純化過程記錄步驟總體積ml蛋白質濃度mg/ml蛋白質總量mg

5、酶濃度比活力總活力產率提純倍數U/mlU/mgU%發酵液10001.3461346185.54137.85 1855401001發酵液脫色9851.2741255 196.63154.34 193680.55104.39 1.12 膜濃縮1506.282942 931.43148.27 139714.575.30 1.08 硫酸銨鹽析326.76216 3565.47527.44 114095.0461.49 3.83 雙水相萃取5.84.5727 13589.722973.68 78820.37642.48 21.57 DEAE-53纖維素離子交換層析5.24.4123 14504.4132

6、88.98 75422.93240.65 23.86 Sephadex G-75凝膠層析6.92.9720 101503417.51 7003537.75 24.79 二、酶的提取二、酶的提取 固體材料 液體材料 干燥粉碎粗酶制品 浸提液浸泡 提取 濃縮酶液真空濃縮- 酶液添加穩定劑、防腐劑稀酶液 加填充劑 鹽析（硫酸銨等） 干燥 沉淀酶 粗酶粉 成型干燥酶粉或酶粒 一般工業級酶制劑提取工藝流程圖三、酶純化三、酶純化 酶純化方法的選擇： 一般依據酶的分子大小、形狀、電荷性質、溶解度、專一性等性質而建立。常用的提純方法：常用的提純方法： 離子交換層析、色譜聚焦、電泳、等電聚焦、鹽溶、鹽析、離心分

7、離、透析超濾、凝膠過濾、親和層析、染料配體親和層析、免疫吸附層析 四、分離純化要點四、分離純化要點1 1、材料選擇、材料選擇 （1）確定材料選擇標準（產地、種類、年齡或季節、健康狀態等）； （2）材料的預處理條件確定（取舍、保藏、保鮮等）； （3）提取液的選擇。2 2、固液（細胞）分離、固液（細胞）分離（1）板框過濾 板框過濾原理板框過濾原理料液流濾液流（2）離心機分離3、細胞的破碎、細胞的破碎 （1 1）機械破碎法）機械破碎法 機械搗碎法： 高速搗碎機（10000r/m），常用于動物內臟、植物葉芽等比較脆嫩的組織細胞破碎。在實驗室中常用； 勻漿法： 適用于細菌、真菌的破碎，且容量大（幾升）。

8、不銹鋼、玻璃或Teflon勻漿器。 （2）物理破碎法）物理破碎法 溫度差破碎法（凍融法）： 一般在凍融液中加入蛋白酶抑制劑，如PMSF（苯甲基磺酰氟）、絡合劑EDTA、還原劑DTT（二硫蘇糖醇）以防破壞目的酶。 壓力差破碎法： 高壓沖擊、突然降壓、滲透壓差等方法。 超聲波破碎法： 頻率20kHz，空穴作用使細胞模破碎。（3 3）化學破碎法）化學破碎法 有機溶劑處理： 常用甲苯、丙酮、氯仿等。 表面活性劑處理： 常用Triton、Tween等。(4）酶學破碎法）酶學破碎法 外加酶處理： 如溶菌酶、B-葡聚糖酶、幾丁質酶、纖維素酶等。 自溶法： 4、酶的提取、酶的提取 （1 1）吸附）吸附 物理吸

9、附： 通過分子力作用，性質穩定、吸附快、選擇性差； 化學吸附： 通過化學鍵作用，單分子層吸附，吸附慢、選擇性強； 交換吸附： 通過帶電荷離子作用，吸附能力與電荷及離子半徑有關。 （2）沉淀）沉淀 鹽析法： 常用鹽析劑有硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀等； 等電點法： 有機溶劑法： 非離子型聚合物沉淀法（絮凝） 高價金屬離子沉淀法（凝聚） （3 3）離子交換法）離子交換法： 提取液中的酶吸附或擴散到樹脂表面相互置換離子而進行的提取過程。 離子交換劑分類離子交換劑分類：陽離子交換劑、陰離子交換劑、兩性離子交換劑、吸附性交換劑、選擇性交換劑、氧化還原交換劑。 離子交換劑結構離子交換劑結構：不溶性網狀骨架、官能

10、團和帶電荷離子。RSO3H RSO3-+H+RSO3-+B+ RSO3BRSO3B +Na+ RSO3Na+BRSO3Na+H+ RSO3H離子樹脂交換劑離子樹脂交換劑 離子交換樹脂的處理離子交換樹脂的處理： 干樹脂充分吸水膨脹（12h）-2mol/lNaCL，4h水洗2mol/lHCL或NaOH,4h洗至所需的pH； RSO3H RSO3-+H+（使用狀態） RSO3-+B+ RSO3B（交換狀態） RSO3B +Na+ RSO3Na+B（洗脫狀態） RSO3Na+H+ RSO3H（再生狀態） 上柱交換：采用順流式（正上柱）或逆流式（倒上柱）兩種。已交換層交換帶未交換層A：活性離子；：活性離

11、子； B：被交換離子：被交換離子A為0，B飽和濃度CsA飽和濃度Cs 漸小，B漸趨0A為Cs ，B飽和濃度0BBBBBBBBBBAAAAABBBBB交換層未交換層交換層至B漏出點，停止交換，進行洗脫或再生洗脫：洗脫： 用親和力更強的同性離子取代被吸附的目的產物。常用鈉離子或氨離子等。 再生：HCL或NaOH處理數小時。（轉型Na+或H+） 如：鈉型強酸樹脂用NaOH溶液再生； 氫型強酸樹脂用HCL再生。水洗至中性保存。（4 4） 過濾分離過濾分離 粗濾粗濾: 借助于過濾介質截留懸浮液中直徑大于2的大顆粒。 主要用于分離：酵母、霉菌、動植物細胞、培養基殘渣以及其它大顆粒。 介質介質： 濾紙、濾布

12、、玻璃纖維、陶瓷、濾板等。為了加快過濾速度，提高分離效果，經常要添加助濾劑，如：硅藻士、活性炭、紙粕等。 常壓過濾常壓過濾：以液位差為推動力。速度慢，分離效果差。 加壓過濾加壓過濾：以壓力泵或壓縮空氣為推動力。 減壓過濾減壓過濾：又稱真空過濾或抽濾。 （5）膜分離技術膜分離技術 微濾微濾：截留顆粒直徑。主要用于分離細菌、灰塵等。介質：微孔陶瓷濾筒。操作壓力：以下。 超濾超濾：截留顆粒直徑20-2000埃，相當于分子量1000500000道爾頓。主要用于分離病毒和大分子物質等。介質：丙烯腈、醋酸纖維素、尼龍等高分子聚合物制成的多孔薄膜。操作壓力：以下。 反滲透反滲透：孔徑小于20埃。截留顆粒分子

13、量小于1000道爾頓。主要用于分離各種離子和小分子物質等。5 5、酶的純化、酶的純化（1）層析）層析 吸附層析吸附層析： 常用吸附劑：硅藻土、氧化鋁、活性炭等。一般在低pH、低離子強度下對酶有吸附作用，在高pH、離子強度下對酶有解吸附作用。 離子交換層析離子交換層析： 利用可解離基團對各種離子的親和力不同而分離。母體：離子交換樹脂、離子交換纖維素（DEAE纖維素、AE-纖維素、CMC）和離子交換凝膠（DEAE葡聚糖凝膠、DEAE聚丙烯酰胺凝膠DEAE瓊脂糖凝膠、CM凝膠等）。凝膠層析凝膠層析：又稱排阻層析或分子篩方法，是根據蛋白質的大小和形狀進行分離和純化的。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀

14、結構物質，多是交聯的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質。如：葡聚糖凝膠sephadexG-10-200、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、CM凝膠等）。 親和層析親和層析：配基連接在不溶性母體（葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、CMC凝膠等）上母體和配基之間常引入連接臂。母體與配基相聯稱母體活化。 母體母體連接臂配基配基分離物質分離物質（2 2）電泳分離）電泳分離A、 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 垂直板電泳裝置垂直板電泳裝置加樣加樣樣品遷樣品遷移方向移方向電泳過程中分子遷移的規律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當電泳過程中分子遷移的規律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳

15、凝膠相當于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。混合樣品混合樣品帶孔膠帶孔膠 按分子按分子大小分離大小分離電泳方向電泳方向 電泳電泳 小分子小分子大分子大分子夾在兩塊玻璃夾在兩塊玻璃板之間的凝膠板之間的凝膠 電泳電泳緩沖液緩沖液 電泳電泳緩沖液緩沖液 加在槽中的經加在槽中的經SDS處理的樣品處理的樣品分子量小分子量小分子量大分子量大電源電源電泳后的凝膠徑考馬斯亮籃染色、脫色后的凝膠照片標準蛋白分子量標準蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝膠濃度下，在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數與多肽鏈分子量的對數與多肽鏈的相對遷移率成多肽鏈的相對遷移率成線性關系，所以可以通線性關系，所

16、以可以通過標準曲線求未知多肽過標準曲線求未知多肽鏈分子量鏈分子量。 相對遷移率相對遷移率 利用聚丙烯酰胺凝膠內的緩沖液在電場作用下沿電場方向在凝膠內制造一利用聚丙烯酰胺凝膠內的緩沖液在電場作用下沿電場方向在凝膠內制造一個個pHpH梯度。梯度。 每種蛋白質都將遷移至與它的每種蛋白質都將遷移至與它的pI pI 相一致的相一致的pHpH處。處。凝膠中加有兩凝膠中加有兩性電解質溶液性電解質溶液（pH9-3） 加電場后在加電場后在凝膠內形成一凝膠內形成一個穩定個穩定pH梯度梯度 加樣品，加樣品，然后繼續然后繼續電泳電泳凝膠染色表明樣凝膠染色表明樣品按照各自品按照各自pI值值沿著沿著pH梯度分布梯度分布B

17、 、等電聚焦電泳（、等電聚焦電泳（ IFE）等等電電聚聚焦焦電電泳泳進進行行過過程程中中等等電電聚聚焦焦電電泳泳結結束束后后（）（）（）（）（）（）（）（）高高pH高高pH低低pH低低pH（3 3）結晶結晶 鹽析結晶法： 有機溶劑結晶法 透析平衡結晶法 等電點結晶法濃縮濃縮：真空蒸發和薄膜蒸發。（4 4）濃縮與干燥）濃縮與干燥干燥：真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥、吸附干燥實例: CPOCPO的提取純化的提取純化（實驗方案） 1、CPO提取純化過程 固液分離-除雜處理-鹽析沉淀-脫鹽-層析純化-濃縮-冷凍干燥-成品 2 2、分離、分離 發酵液3000 g冷凍離心分離10min，得清液。

18、加4-7%PEG，攪拌30min，脫色處理； 3000 g冷凍離心分離10min，得脫色清液。 調節脫色清液pH至； 陰離子交換樹脂除雜蛋白。（處理量待定）提取提取 硫酸銨鹽析：根據分離液體積，計算硫酸銨加入量，攪拌并緩慢添加固體硫酸銨至100%硫酸銨飽和度，沉淀CPO。 4靜置沉淀1-4h. 4，12000r/min離心分離CPO蛋白沉淀物。 緩沖液溶解沉淀物（控制體積數盡可能小） 溶解的CPO溶液裝入透析袋，加緩沖液透析至無硫酸根離子。 濃縮酶液：在試驗量不大情況下，可采用將透析袋埋入PEG中，將水份吸出。純化純化（1）DE-53預處理稱DE-53 5克，懸于500ml蒸餾水，1小時后傾去

19、上層細粒。按每克DE-53加0.5N NaOH 15ml的比例，將DE-53浸泡于0.5N NaOH中，攪勻，靜置30分鐘，裝入布氏漏斗(墊有2層濾紙)中抽濾，并反復用蒸餾水抽洗至pH呈中性；再以0.5N HCl同上操作過程處理，最后以0.5N NaOH再處理一次。處理完后，將DE-53浸泡于，PH 5.8 PB中過夜。(2)(2)裝柱裝柱(1)將層析柱垂直固定于滴定鐵架上，柱底墊一園尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關閉開關。 (2)將，pH5.8 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入經預處理并以同上緩沖液調成稀糊狀的DE-53。待DE-53凝膠沉降2-3cm厚時，啟開出水口螺旋夾，控制流

20、速1ml/分鐘，同時連續倒入糊狀DE-53凝膠至所需高度。(3)關閉出水口，待DE-53凝膠完全沉降后，柱面放一園形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口，通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。 （4）平衡:啟開出水口螺旋夾，控制流速12-14滴/分鐘，使約2倍床體積的洗脫液流出。并以pH計與電導儀分別測定洗脫液及流出液之PH值與離子強度是否相同。達到一致時關閉出水口，停止平衡。（5）加樣及洗脫:啟開上口橡皮塞及下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當柱面液體與柱面相切時，立即關閉出水口，以毛細滴管沿柱壁加入樣品(體積應床體積的2，蛋白濃度以100mg為宜)。松開出水口螺旋夾使柱面樣品緩慢進入柱內，至與柱面相切時，立即關閉下口，以少量洗脫液洗柱壁2-3次；再放開出水口，使洗液進入床柱，隨后立即于柱面上加入數ml洗脫液，緊塞柱上口，使整個洗脫過程成一密閉系統。并控制流速1214滴分鐘。 （6）收集：開始洗脫的同時就以試管進行收集。每管收集35ml。共收集1015管。 （7）測蛋白：以751-G型紫外分光光度計分別測定每管OD280nm，與OD260nm，按前述公式計算各管蛋白含量。并以OD280nm為縱座標，以試管編號為橫座標，繪制洗脫曲線。 （8）合并、濃縮：將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進行合并，于4保存備用。 （9）DE-53的再生:在柱上先