1、流式細胞儀（Flow Cytometry） 1 流式細胞儀的概念及其進展歷史11 流式細胞儀的基本概念流式細胞儀（flow cytonletry，FCM）是對高速直線流淌的細胞或生物微粒進行快速定量測定和分析的儀器，主要包括樣品的液流技術、細胞的計數和分選技術，計算機對數據的采集和分析技術等。流式細胞儀以流式細胞術為理論基礎，是流體力學、激光技術、電子工程學、分子免疫學、細胞熒光化學和計算機等學科學問綜合運用的結晶。流式細胞術是一種自動分析和分選細胞或亞細胞的技術。其特點是：測量速度快、被測群體大、可進行多參數測量，即對同一個細胞做有關物理、生物化學特性的多參數測量，且在統

2、計學上有效。12 流式細胞儀的進展簡史最早的流式細胞儀雛形誕生于1934年，Moldavan提出訪懸浮的單個血紅細胞流過玻璃毛細管，在亮視野下用顯微鏡進行計數，并用光電記錄裝置測量的設想。1953年Crosland-Taylor依據牛頓流體在圓形管中流淌規律設計了流淌室。其后又經過Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不斷改進，設計了光電檢測設備和細胞分選裝置、完成了計算機與流式細胞儀的物理連接及多參數數據的記錄和分析、開創了細胞的免疫熒光染色及檢測技術、推廣流式細胞儀在臨床上的應用。近20年來，隨著流

3、式細胞儀及其檢測技術的日臻完善，人們越來越致力于樣品制備、細胞標記、軟件開發等方面的工作，以擴大FCM的應用領域和使用效果。宋平根的流式細胞術的原理和應用是迄今為止對流式細胞儀及其技術闡述的最為詳盡和透徹的中文著作。這本書格外具體地介紹了流式細胞術的歷史、結構、原理、技術指標等，例舉了其在醫學和生物工程中的應用，格外適合從事此方面專業爭辯的人。由于這本書是13年前出版的，所以基本上沒有涉及植物流式細胞儀檢測技術。此外對于只需要對流式細胞儀有些基本生疏的人士來說，這本書太簡單太淺顯。謝小梅主要介紹了流式細胞儀在生物工程中的應用。楊蕊概括了流式細胞儀的工作原理，簡潔提及了流式細胞儀的應用。本文在分

4、析這三篇論著或文章的優缺點后，用比較通俗的語言介紹了把握流式細胞儀檢測技術必需了解的一些原理，并對目前市場上的主流型號進行了客觀的性能概括。2 流式細胞儀的工作原理和技術指標21 流式細胞儀工作原理除電源外，流式細胞儀主要由四部分組成：流淌室和液流系統：激光源和光學系統；光電管和檢測系統；計算機和分析系統，其中流淌室是儀器的核心部件。這四大部件共同完成了信號的產生、轉換和傳輸的任務。 流淌室和液流系統流淌室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學玻璃、石英等透亮、穩定的材料制作。設計和制作均很精細，是液流系統的心臟。樣品管貯放樣品，單個細胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向

5、噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩液，一般限制液流速度<10m/s。由于鞘液的作用，被檢測細胞被限制在液流的軸線上。流淌室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號可發生振動。 激光源和光學系統經特異熒光染色的細胞需要合適的光源照射激發才能發出熒光供收集檢測。常用的光源有弧光燈和激光；激光器又以氬離子激光器為普遍，也有配和氪離子激光器或染料激光器。光源的選擇主要依據被激發物質的激發光譜而定。汞燈是最常用的弧光燈，其放射光譜大部分集中于300400nm，很適合需要用紫外光激發的場合。氬離子激光器的放射光譜中，綠光514nm和藍光488nm的譜線最強，約占總光強的80%；氪離子激光器光譜多

6、集中在可見光部分，以647nm較強。免疫學上使用的一些熒光染料激發光波長在550nm以上，可使用染料激光器。將有機染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發生轉變以適應需要即構成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,則可得到550650nm連續可調的激光，尤在590nm處轉換效率最高，約可占到一半。為使細胞得到均勻照射，并提高辨別率，照射到細胞上的激光光斑直徑應和細胞直徑相近。因此需將激光光束經透鏡會聚。光斑直徑d可由下式確定：d=4f/D。為激光波長；f為透鏡焦距；D為激光束直徑。色散棱鏡用來選擇激光的波長，調整反射鏡的角度使調諧到所需

7、要的波長。為了進一步使檢測的放射熒光更強，并提高熒光訊號的信噪比，在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長區段的光線濾除或通過。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC（Fluoresceinisothiocyanate,異硫氰熒光素）放射的525nm綠光通過。長波通過二向色性反射鏡只允許某一波長以上的光線通過而將此波長以下的另一特定波長的光線反射。在免疫分析中常要同時探測兩種以上的波長的熒光信號，就接受二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。 光電管和檢測系統經熒光染色的細胞受合適的光激發后所產生的熒光是通過光電轉換器轉變成電信號而進行測量的。光電倍增

8、管（PMT）最為常用。PMT的響應時間短，僅為ns數量級；光譜響應特性好，在200900nm的光譜區，光量子產額都比較高。光電倍增管的增益從10到10可連續調整，因此對弱光測量格外有利。光電管運行時特殊要留意穩定性問題，工作電壓要格外穩定，工作電流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大陽極電流在幾個毫安。此外要留意對光電管進行暗適應處理，并留意良好的磁屏蔽。在使用中還要留意安裝位置不同的PMT，由于光譜響應特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極管的，它在強光下穩定性比PMT好。 從PMT輸出的電信號仍舊較弱，需要經過放大后才能輸入分析儀器。流式細胞計中一般備有兩類放大器。一類是輸出信號輻度與

9、輸入信號成線性關系，稱為線性放大器。線性放大器適用于在較小范圍內變化的信號以及代表生物學線性過程的信號，例DNA測量等。另一類是對數放大器，輸出信號和輸入信號之間成常用對數關系。在免疫學測量中常使用對數放大器。由于在免疫分析時常要同時顯示陰性、陽性和強陽性三個亞群，它們的熒光強度相差12個數量級；而且在多色免疫熒光測量中，用對數放大器采集數據易于解釋。此外還有調整便利、細胞群體分布外形不易受外界工作條件影響等優點。 計算機和分析系統經放大后的電信號被送往計算機分析器。多道的道數是和電信號的脈沖高度相對應的，也是和光信號的強弱相關的。對應道數年縱坐標通常代表發出該信號的細胞相對數目。多道分析器出

10、來的信號再經模-數轉換器輸往微機處理器編成數據文件，或存貯于計算機的硬盤和軟盤上，或存于儀器內以備調用。計算機的存貯容量較大，可存貯同一細胞的68個參數。存貯于計算機內的數據可以在實測后脫機重現，進行數據處理和分析，最終給出結果。除上述四個主要部格外，還備有電源及壓縮氣體等附加裝置。 211 信號的產生、轉換和傳輸在壓力作用下，鞘液管中的鞘液被持續不斷地壓入流淌室，形成一股穩定地連續的液流，保證了樣本液穩定地處于鞘液液流的軸線上，并以單個細胞形式直線通過激光照射區。激光照射區又稱測量區，是指液流與激光束垂直相交的點。當細胞攜帶熒光素標記物（每種物質攜帶的標記物不同嗎?）通過激光照射區時，產生代

11、表細胞內部不同物質、不同波長的熒光信號，這些信號以細胞為中心，向空間360°立體角放射，產生散射光和熒光信號。散射光不依靠任何細胞樣品的制備技術，因此被稱為細胞的物理參數或固有參數。散射光又包括前向角散射和測向角散射。前向角散射與被測細胞直徑的平方親密相關，測向角散射光對細胞膜、胞質、核膜的折射率更敏感，可供應有關細胞內精細結構和顆粒性質的信息。熒光信號也有二種；一種是細胞自身在激光照射下發出的微弱熒光信號，另一種是經過特異熒光素標記后的細胞受激發照射后得到的熒光信號。在免疫分析中常要同時探測兩種以上波長的熒光信號，就接受二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。經熒

12、光染色的細胞受到適合的光激發后產生的熒光是通過光電轉換器轉變成電信號而進行測量的。最常用的光電轉換器是光電倍增管（PMT）。從PMT輸出的電信號需要經過放大后才能輸入分析儀器。流式細胞儀中一般備有兩類放大器。一類是線性放大器，其輸出信號與輸入信號成線性關系。線性放大器適用于在較小范圍內變化的信號以及代表生物學線性過程的信號，如DNA測量等。另一類是對數放大器，其輸出信號和輸入信號之間成常用對數關系。在免疫學測量中常使用對數放大器。放大后的電信號被傳送到計算機，再經模一數轉換器傳輸到微機處理器形成數據文件，保存在計算機上。保存在計算機上的數據可在脫機后再進行數據處理和分析。 參數（例如：細胞的大

13、小、形態、質膜和細胞內部結構）測量原理流式細胞儀可同時進行多參數測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區進行的，所謂測量區就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點。液流中心的單個細胞通過測量區時，受到激光照射會向立體角為2（360°）的整個空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態、質膜和細胞內部結構親密相關，由于這些生物學參數又和細胞對光線的反射、折射等光學特性有關。未患病任何損壞的細胞對光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號對不經染色活細胞進行分析和分選。經過固定的和染色處理的細胞由于光學性質的轉

14、變，其散射光信號當然不同于活細胞。散射光不僅與作為散射中心的細胞的參數相關，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關。 在流式細胞術測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：前向角（即0角）散射（FSC）；側向散射（SSC），又稱90角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角散射光的強度與細胞的大小有關，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大；對球形活細胞經試驗表明在小立體角范圍內基本上和截面積大小成線性關系；對于外形簡單具有取向性的細胞則可能差異很大，尤其需要留意。側向散射光的測量主要用來獵取有關細胞內部精細

15、結構的顆粒性質的有關信息。側向散射光雖然也與細胞的外形和大小有關，但它對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感，也能對細胞質內較大顆粒給出靈敏反映。 在實際使用中，儀器首先要對光散射信號進行測量。當光散射分析與熒光探針聯合使用時，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細胞。光散射測量最有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。 熒光信號主要包括兩部分：自發熒光，即不經熒光染色細胞內部的熒光分子經光照射后所發出的熒光；特征熒光，即由細胞經染色結合上的熒光染料受光照而發出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不同。自發熒光信號為噪聲信號，在多數狀況下會干擾對特異熒光信號的辨別和測量。在免疫細胞化學等測量中

16、，對于結合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關鍵。一般說來，細胞成分中能夠產生的自發熒光的分子（例核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發熒光越強；培育細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發熒光越強。 削減自發熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：盡量選用較亮的熒光染料；選用適宜的激光和濾片光學系統；接受電子補償電路，將自發熒光的本底貢獻予以補償。212 流式細胞儀分選原理并不是全部的流式細胞儀都具有分選功能。流式細胞儀的分選功能是由細胞分選器來完成的。由噴嘴射出的液流柱在電信號作用下發生振動，斷裂形成均勻的小液滴。依據選定的某個參數由規律電路判明是否

17、將被分選，而后由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發生偏轉，落入收集器中。使用不同孔徑的噴孔及轉變液流速度，可能會轉變分選效果。從參數測定經規律選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間。精確測定延遲時間是打算分選質量的關鍵，可依據具體要求進行適當調整。213 數據的顯示和分析數據處理主要包括數據的顯示和分析。單參數直方圖是使用最多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。單參數直方圖是由X、Y二方向組成的二維平面圖。橫座標X是所測的熒光或散射光的強度，用“道數”（Channel No）來表示。選擇的放大器類型不同，標度不同。縱座標Y通常表示被測細胞的確定數目。正常狀況下

18、，數據分析得到的圖形為具有一個或若干個峰的曲線圖。對曲線圖的解釋應當具體問題具體分析。除直方圖外，數據顯示方式還包括二維點圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。二維點圖也是比較常用的數據顯示類型。它顯示兩個獨立參數與細胞相對數之間的關系，也是二維平面圖，橫縱坐標可以依據自己選定的被測參數自行打算，點的位置表明白細胞和顆粒具有的二個被測參數的數值。二維點圖所供應的信息量要大于單參數直方圖。數據分析的方法大體可分為參數法和非參數法兩大類。當被檢測的生物學系統能夠用某種數學模型時則多使用參數方法。非參數分析法不用對顯示的圖像做任何假設，也不接受數學模型，分析程序可以很簡潔，也可能很簡單。臨床醫學較常

19、使用非參數分析法。22 流式細胞儀性能的技術指標流式細胞儀性能的技術指標主要有熒光辨別率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度等。熒光辨別率是指辨別兩個相鄰峰的最小距離，通常用變異系數（CV值）來表示。現在市場上主流型號出廠時的熒光辨別率應當小于2.0%。熒光靈敏度反映了儀器探測最小熒光光強的力量。一般用熒光微球上可測出的FITC的最少分子數來表示。目前儀器均可達到1000左右。儀器工作時樣品濃度一般在105107細胞/ml。分析速度/分選速度是指流式細胞儀每秒種可分析或分選的顆粒數目。一般分析速度為500010000，分選速度把握在1000以下。流式細胞儀測量的數據是相對值，因此需要在使用前對

20、系統進行校準或標定。流式細胞儀的校準有二個目的，即儀器的準直調整和定量標度。通常使用標準微球作為非生物學標準樣品，雞血紅細胞做為生物學標準樣品。3 主流流式細胞儀型號及其特性介紹目前擁有市場較大份額的公司是美國的BD（Becton-Dickinson）公司、Beckman-Coulter公司（原名稱Coulter）和德國的Partec公司。31 BD公司流式細胞儀介紹BD公司生產的流式細胞儀都冠以FACs（fluorescence activated cell sorter），即熒光激活細胞分選器。其型號種類比較齊全，如早期的FACSort、FACS Canto、FACSean。現在市場上供應

21、的型號有五種：FACSCount（小型流式細胞儀）、FACS CAlibur（流式細胞儀）、FACSA ria（流式細胞分選儀）、FACSV antage SETM（多色分析和高速分選流式細胞儀）、LSR II（數字化分析型流式細胞儀）。FACSCount為精確計數淋巴細胞CD3，CD4，CD8確定數而設計的。FACSCalibur是全自動多色流式系統，偏重于臨床，其整體設計掛念臨床醫生快速實現常規免疫表型、CD4T細胞計數、DNA、網織紅細胞、血小板等臨床分析，兼具分選功能。配備有二根激光管，可同時檢測4個熒光參數。可識別粘聯細胞。BD FACSA ria流式細胞分選儀為臺式高速細胞分選儀，

22、獵取速度達70，000細胞/s，分析速度達50，000/s。使用石英杯流淌檢測池固定光路校準技術。使用三種激光，多色分析，分析參數可達15色。兩管或四管分選，可以使用多種規格的收集管。液流監測系統白動監測液流斷點，檢查堵塞，實現了細胞分選的無人操作。配件BDACDU裝置，可以在微孔板或載波片上定量分選細胞。FACSV antage SETM是在FACSV antage的細胞分選功能基礎上推出的分選增加型流式細胞儀。六色熒光分析系統，點對點分選，配置FACS Diva數字化系統，供應全面的配套試劑。速度和功能優于FACSV antage。BD LSR II是LSR的數字化升級版，其性能介于FAC

23、SV antage SE和FACS Calibur之間，是專為生命科學爭辯設計的臺式機。配備固定校準的紫外激光，四種激光立體空間激發、十色熒光同時分析、電子系統數字化、比較易學易用。32 Beckman-Coulter公司流式細胞儀介紹Beckman- Coulter公司生產的流式細胞儀以Profile（早期，現已停產）和EPICS系列為代表，近年又推出了Cytomics FC500系列。EPICS系列是大型流式細胞儀，目前市場上有XL、XL-MCL和ALTRA三種型號，其中ALTRA具有分選功能，適用于免疫學、細胞生理、分子生物學、遺傳學、微生物學、水質分析和植物細胞分析。Cytomics

24、FC500系列流式細胞儀體積小，可自動進行5種顏色的分析，適用于免疫學檢測，如人類HIV診斷。特殊是FC500MPL的獨特設計可以在同一系統上使用12×75mm的離心管和24或96孔的平板。特殊適合工作量大的試驗室。這二個公司主要針對醫學爭辯和臨床工作進行設計和生產，其產品可應用于生物醫學基礎爭辯以及臨床檢測的很多領域，如遺傳、腫瘤、血液、免疫等諸多爭辯中紅細胞、T細胞、淋巴細胞亞群測定、檢測早期細胞凋亡、腫瘤細胞免疫測定等。這二個公司的流式細胞儀價格昂貴，我國主要購買、使用的單位基本上都是一些醫療機構。33 Partec公司流式細胞儀介紹與BD和Becman-Coutler公司的產

25、品相比，德國Partec公司生產的流式細胞儀的共同特點是體積小，造價低，易操作，便于攜帶，適合植物學爭辯，適合邊遠地區和進展中國家。德國Partec公司的產品分為三類：CCA家族、PAS家族和CyFlow家族（Galaxy為早期產品，已停產）。CCA家族包括細胞計數分析儀CCA和倍性分析儀PA-I。它是單或雙參數的臺式小型機，可以進行一些常規分析，如核DNA測定（檢測倍性或細胞周期）、細胞計數、細胞凋亡。它的特點是體積小，易操作，價格低，檢測范圍廣，可以檢測多種熒光素（如PI、DAPI、Fluorescein）發出的熒光。PAS家族包括粒子分析系統PAS、粒子分析系統III（PAS-III）和

26、倍性分析儀PA-II。供應三種激光器的三種組合，可檢測十余種熒光染料。最多可檢測和記錄八個獨立熒光參數。倍性分析儀PA能夠在2分鐘內自動測量植物的倍性水平，檢測異倍體。可以對葉片、幼苗、種子、果皮、根、花等植物材料進行分析。在大多數植物中，異倍體染色體的檢測辨別率為±1條染色體。PA-I使用HBO-100汞燈，屬于弧光燈，可產生紫外激發光和藍光。PA-II中增加了488nm氬離子激光器，能夠檢測幾乎全部的熒光染料，如DAPI，Hoeehst，PI，EB，MMC，FITC，FDA等。汞燈發光是電流經過氣體時，氣體電離產生的。它能供應最佳的激發波長。CyFlow（R）SL配備三種激光管，

27、可應用于諸如人類健康、微生物學、工業應用、過程把握、生態學等爭辯。如HIV掃描中免疫標記細胞計數、食品處理過程中的微生物計數、細胞凋亡等。它使用l2 V直流電，特殊適合邊遠地區和進展中國家。國際上20世紀80年月開頭將流式細胞儀檢測應用到植物的爭辯中（Galbraith，1983），眾多學者都認為流式細胞儀是一種精確、快速的檢測DNA含量的方法（Michaelson，1991）。應用范圍主要是利用流式細胞儀爭辯屬內、屬間多種植物的DNA含量（Baird，1994；Jacob，1996；HALL，2000）和倍性水平（Costich，1993；Meng，2002）、檢測體細胞雜種（Pfosser

28、，1995；Keller，1996）和游離小孢子培育再生株（Kim，2003）的DNA含量。過去我國應用這一檢測技術的植物爭辯工作者寥寥無幾，且大多是在國外試驗室完成的。爭辯內容包括植物生理、程序性死亡、倍性鑒定等。植物爭辯中使用的流式細胞儀基本上都是Partec公司的產品，也有少量是BD公司生產的流式細胞儀。BD公司的產品主要定位于醫學爭辯與應用，與Partec產品相比，不太適合從事植物染色體倍性的鑒定。主要體現在不能供應植物樣品制備技術/試劑，數據獵取軟件可同時檢測到的倍性數目少。鑒于目前我國科研院所中使用較多的是BD公司生產的流式細胞儀，在下一篇中將會對利用BD流式細胞儀進行植物倍性檢測

29、的技術和技巧做具體報告。如何選擇流式細胞儀 自七十年月消滅第一代流式細胞儀以來，隨著計算機技術、電子制造技術、激光技術及熒光素合成技術的不斷進展，現代流式細胞儀已今非昔比，制造工藝、功能、精確度有了質的飛躍。流式細胞儀生產廠商推出各種不同型號的流式細胞儀來滿足用戶的不同需要。現生產流式細胞的廠商全球至少有六家，各廠商產品又有不同的系列，各具特點。如何從眾多的型號中選擇出最適合自己的機型，我們還需從分析應用動身，評估自己的需求來打算什么樣的流式細胞儀最具性價比、最適合自己。、DNA倍體分析DNA分析是流式細胞儀最初且是現在應用最廣檢測項目。由于惡性細胞DNA含量通常與正常細胞不同，存在

30、異倍體細胞，所以現有很爭辯評價異倍體細胞與腫瘤惡性度及其預后的關系。DNA含量檢測還可供應細胞周期方面的信息，這在細胞生物學中運用很廣泛。特殊地，它可表示出細胞毒性藥物對細胞作用過程。這些DNA檢測還可與細胞表面標志物標記同時進行，這樣在細胞混合培育中，可通常追蹤表達特異標志物的細胞顯示其生長周期狀況。全部方法都是基于染料能與核酸起特異的化學反應并放射出熒光，常用的染料為PI，DAPI。流式細胞儀要求：488nm光源，575nm濾光片。、細胞生存力量試驗使用Heochest 33342染料與DNA特異性結合，后因細胞活力不同，染料的結合程度也各異，故可評估細胞的活性度。流式細胞儀要求：360n

31、m光源，455nm濾光片。、計數外周血中檢測網織紅細胞使用TO染料能夠特異性地與RNA結合，結合系數高達3000，故具有很好的性價比。流式細胞儀要求：488nm光源，525nm濾光片，液量確定計數系統。、外周血、骨髓采集物中CD34陽性干細胞計數，臨床上用于骨髓移植前干細胞數理的測定使用標準ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE標記CD34抗體，PE-CY5標記CD45抗體。流式細胞儀要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片，液量確定計數系統。、交叉淋巴細胞、粒細胞毒試驗檢測識別供體血清中免疫球蛋白與受體粒細胞之間是否存在反應有著重要臨床意義，由于這

32、種反應會導致移植后發熱、移植后肺損傷及免疫性粒細胞缺乏癥。流式細胞儀可檢測全血樣本與血清孵育后粒細胞上結合的人免疫球蛋白。FITC標記人免疫球蛋白抗體、PE標記粒細胞表面標志物、PE-CY5標記HLA抗體。流式細胞儀要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片。、血小板自身抗體檢測血小板自身抗體識別人血小板抗原，會引起各種臨床相關癥狀，如新生兒自免性血小板削減癥、輸血后紫癜、難治性血小板削減。流式細胞可快速精確地檢測血小板自身抗體。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別血小板抗體。流式細胞儀要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片。、移植交叉配型原細胞毒試驗，

33、主要用于避開移植物超急性排拆反應。流式細胞儀用于監測T或B細胞是否受到受體血清中免疫球蛋白攻擊，作為HLA配型前的預試驗。流式細胞儀因其高精確性已成為該領域內的金標準。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別T細胞CD3或B細胞CD29抗體。儀器要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片。、檢測細胞經抗原或細胞有絲分裂刺激后活化效應淋巴細胞早期活化指標CD69可用來檢測免疫治療效果。流式細胞使用三色分析可監測淋巴細胞各亞群活化狀況：FITC標記的CD3抗體、PE標記的CD8抗體、PE-CY5標記的CD69抗體。流式細胞儀要求：488nm光源，525nm、575nm、575nm濾光片

34、。、檢測細胞內因子（TH1/TH2細胞檢測）未活化的淋巴細胞所分泌的細胞因子極少，用流式細胞儀很難檢測出來，因此在檢測前需刺激活化。活化所用的刺激素為PMA 佛波酯+Ionomycin。淋巴細胞在刺激素的作用下，活化分泌細胞因子到細胞外。因流式細胞儀只能對細胞表面或內部的抗原進行檢測，如細胞因子分泌到細胞外則檢測不到，因此必需阻擋細胞因子的分泌。抑制細胞因子分泌的試劑為Brefedlin A或Monensin。Th1/Th2細胞首先是CD4+T細胞，因此存在著用CD4來設定細胞群的問題。我們知道CD4不但在T 細胞上表達，還在全部的單核細胞上表達，因此單獨用CD4設門無法將CD4+T

35、細胞區分開來。那么我們用CD3和CD4雙參數設門是否可以呢？回答是否定的。由于在佛波酯的刺激作用下CD4 抗原的表達會快速下調，甚至完全丟失，所以不適合于設門。用CD3和CD8設門，因CD8不受佛波脂的影響且絕大多數CD3+CD8-的細胞都是CD3+CD4+細胞，因此可用CD3+CD8-細胞群來確定CD4+T細胞群。FITC標記CD8，PE標記IL-4和，PE-CY5標記IFN-r，APC或PE-CY7標記CD3。流式細胞儀要求：488nm或633nm（僅限APC染料）光源，525nm、575nm、675nm，767nm濾光片。、細胞增殖狀態檢測核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量細胞增殖分裂狀況，在評估腫瘤預后有重要意義。為些標志物的檢測一般同細胞表面標志物同時檢測。FITC標記PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或（并）PE-CY5標記細胞表面標志物。流式細胞儀要求：488nm或633nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片。、染色體