1、槐定堿預處理對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞c-Jun表達的影響作者：劉靜， 張巍， 楊峰，黃菱，周婭【摘要】 目的 觀察槐定堿預處理對LPS刺激RAW264.7巨噬細胞c-Jun表達的影響，探討槐定堿抗內毒素機制。方法 培養RAW264.7巨噬細胞，以槐定堿（31.25mg·L-1）預處理細胞24h后給予LPS(E.coli O55:B5)100g·L-1刺激細胞，并于刺激后5、30、60、120min收集細胞；再以槐定堿31.25、15.63、7.81mg·L-1三個濃度同上預處理細胞，于LPS刺激后60min收集細胞。利用免疫細胞化學技術檢測RAW26

2、4.7巨噬細胞中c-Jun的表達。結果 單獨槐定堿對c-Jun表達無影響；LPS模型組各時間點c-Jun陽性細胞數均顯著高于巨噬細胞對照組（P0.01），且隨LPS刺激時間延長而升高，持續升至120min；槐定堿預處理組在LPS作用后30、60、120min時c-Jun陽性細胞數均較同時間點LPS模型組降低，差異有統計學意義（均P0.01），但槐定堿預處理組各時間點c-Jun陽性細胞數無明顯變化。不同濃度槐定堿（31.25、15.63、7.81 mg·L-1）預處理細胞，對LPS刺激的c-Jun表達均有顯著抑制作用（均P0.01），且31.25 mg·L-1的作用強于另兩個

3、濃度（15.63、7.81 mg·L-1），差異有統計學意義（均P0.05）。結論 槐定堿預處理RAW264.7巨噬細胞能顯著抑制LPS誘導的c-Jun蛋白表達，其作用有劑量依賴性。 【關鍵詞】 槐定堿；LPS；RAW264.7巨噬細胞株；c-JunAbstract: Objective To explore the anti-endotoxin fuctions and its mechanisms by observing the effects of Sophoridine pretreating on the expression of c-Jun in macrophage

4、 RAW264.7 induced by LPS.Methods Cultured RAW264.7 cells,using LPS(E.coli O55:B5) at final concentration of 100g·L-1 to stimulate cell after Sophoridine pretreating cells for 24 hours,and collecting cells at 5min,30min,60min,120min after stimulating;then using Sophoridine (31.25,15.63,7.81mg

5、83;L-1) preatreating cells again，and collecting cells at 60 min after LPS stimulating.The expression of c-Jun in macrophage RAW264.7 was detected by Immunocytochemistry.Results Single Sophoridine had no effect on the expression of c-Jun.The positive cells of c-Jun of LPS model group at each time spo

6、t were significantly higher than those of macrophage control group(P0.01),and the positive cells ascended along with time,reached summit at 120 min.Compared with LPS model group,the positive cells of c-Jun in Sophoridine pretreating group had significantly decreased after LPS stimulating at 30min,60

7、min,120min (all P0.01),but the number of the positive cells of c-Jun of Sophoridine pretreating groups had no obvious change at each time spot.Different concentration (31.25,15.63,7.81 mg·L-1) Sophoridine pretreating cells had significantly inhibitory action（all P0.01）,and the action of 31.25 m

8、g·L-1 had the advantage over other concentration(15.63,7.81 mg·L-1) (all P0.05).conclusion Sophoridine pretreating macrophage RAW264.7 can inhibit the expression of c-Jun protein induced by LPS,and its action show the dose dependent.Key words:sophoridine; LPS; RAW264.7 Cells; c-Jun細菌內毒素（en

9、dotoxin，ET）即脂多糖（lipopolysaccharide,LPS)，是G-菌的主要病原相關分子模式（Pathogen associated molecular pattern,PAMP），巨噬細胞等通過模式識別受體（Pattern recognition receptors,PRR）結合PAMPs，導致炎癥失控性表達,對機體造成嚴重損害。c-Jun蛋白是細胞核內轉錄因子激活蛋白1（activator protein-l，AP-1）的主要組分之一，它參與了LPS的細胞內信號轉導和轉錄調控?；倍▔A( sophoridine )是豆科槐屬植物苦豆子(Sophora alopecuroid

10、es,L)中含量較高的生物堿之一，前期研究發現槐定堿可顯著減輕內毒素肺損傷小鼠的病理損傷1。本文擬進一步觀察不同濃度槐定堿預處理小鼠單核/巨噬細胞株(RAW264.7)巨噬細胞，以及LPS刺激槐定堿預處理細胞后不同時間點c-Jun表達的變化，以探討槐定堿抗內毒素的作用機制。1 材料與方法1.1 藥品和試劑 槐定堿購于寧夏藥物研究所，批號:960324，mp 109，含量98%以上；RAW264.7來源于中科院上海細胞庫；抗小鼠c-Jun多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；DMEM為美國Gibco 公司；胰蛋白酶、LPS(E.coli O55:B5)均系美國

11、Sigma 公司產品；兔SP檢測試劑盒、DAB顯色劑購自北京中杉金橋；TritonX-100，北京中山試劑公司。1.2 實驗方法1.2.1 藥品配制稱取槐定堿,無內毒素三蒸水溶解，10 N HCl調節pH值至7.27.4之間，使用前稀釋至所需濃度。稱取LPS,無內毒素三蒸水溶解，使用前旋渦混旋器混旋30min,稀釋至所需濃度。1.2.2 實驗分組培養RAW 264.7巨噬細胞，待其處于對數生長期時用于實驗。0.25%胰酶消化細胞，混懸，調節細胞濃度為1×106個·mL-1。將無菌蓋玻片放入六孔培養板中，接種細胞懸液，每孔1mL，待細胞80%融合后分組處理。巨噬細胞（M）對照

12、組：無血清DMEM培養基孵育細胞；槐定堿對照組：含槐定堿31.25mg·L-1培養基孵育細胞24h后給予無血清DMEM培養基孵育細胞；LPS模型組：含LPS 100L·L-1培養基孵育細胞；槐定堿預處理組：含槐定堿31.25mg·L-1培養基孵育細胞24h后給予含LPS 100L·L-1培養基孵育細胞。各組分別給予無血清DMEM培養基或含LPS 100L·L-1培養基孵育細胞后5、30、60、120min收集細胞爬片。每個處理方式重復3次。觀察槐定堿預處理對LPS刺激RAW264.7細胞后不同時間點c-Jun 表達的影響。 同時，槐定堿對照組和

13、槐定堿預處理組分別用含槐定堿31.25、15.63、7.81mg·L-1三個濃度的培養基孵育細胞24h后，分別給予無血清DMEM培養基和含LPS 100L·L-1培養基孵育細胞60min，收集細胞爬片。重復3次。觀察不同濃度槐定堿預處理對LPS刺激RAW264.7細胞后c-Jun 表達的影響。1.2.3 免疫細胞化學收集各組細胞爬片，4%多聚甲醛固定30min，0.3%TritonX100室溫下30min，3%過氧化氫室溫10min，5%山羊血清封閉室溫下10min,不洗甩干，加1200稀釋的c-Jun一抗（兔抗小鼠c-Jun多克隆抗體），37濕盒內120min，加1200

14、稀釋的二抗（辣根酶標記山羊抗兔IgG），37濕盒內90min，1200稀釋的SP(過氧化物酶標記的鏈酶卵白素) 37濕盒內30min，DAB(辣根過氧化物酶底物顯色劑)室溫下顯色3min，蘇木素復染3s,依次經過80%、95%、100%、100%酒精脫水各1min,二甲苯中透明5min,中性樹膠封片。采集圖像。結果判定：細胞核內著棕黃色為陽性細胞，藍色為陰性細胞。400×顯微鏡下觀察,每一細胞爬片隨機選取3個視野計數陽性細胞數及細胞總數，計算陽性百分率 （%），每組重復3次。1.3 統計學方法所有數據均采用SPSS 11.5統計軟件分析,組間比較采用2檢驗，P0.05為差異有統計學意

15、義。2 結果2. 1 槐定堿預處理對LPS刺激RAW264.7細胞后不同時間點c-Jun蛋白表達的影響 結果表明M對照組與槐定堿對照組之間各時間點c-Jun陽性細胞數差異均無統計學意義（P0.05）；LPS模型組各時間點c-Jun陽性細胞數均顯著高于同時間點M對照組（2=45.239,P=0.000；2=281.841,P=0.000；2=396.366,P=0.000；2=1776.592,P=0.000），而且c-Jun表達隨LPS刺激時間延長而升高，持續升至120min?；倍▔A預處理組，在LPS作用5min時與LPS模型組比較差異無統計學意義（2=3.13,P=0.077），在30、60

16、、120min時槐定堿預處理組c-Jun陽性細胞數較LPS模型組顯著降低（分別為2=136.44,P=0.000；2=216.42,P=0.000；2=1747.59,P=0.000），但均顯著高于同時間點M對照組（分別為2=21.57,P=0.000；2=29.46,P=0.000；2=30.61,P=0.000；2=41.69,P=0.000）。槐定堿抑制LPS誘導的c-Jun表達的時間效應與LPS模型組不平行，槐定堿預處理組各時間點c-Jun陽性細胞數均無明顯變化。結果見表1，圖1(見封3)。表1 槐定堿對LPS誘導RAW264.7細胞不同時間點c-Jun表達的影響（略）2.2 不同濃度

17、槐定堿預處理對LPS刺激后RAW264.7細胞c-Jun蛋白表達的影響 三個濃度槐定堿（31.25 、15.63 、7.81 mg·L-1）預處理RAW264.7細胞，其c-Jun陽性細胞數均與M對照組差異無統計學意義（分別為2=0.01，P=0.92；2=0.02，P=0.90；2=0.07，P=0.78）,說明所用的三個濃度槐定堿本身均不影響RAW264.7細胞的c-Jun表達。三個濃度槐定堿預處理組分別用LPS刺激60min后其c-Jun陽性細胞數均顯著少于同時間點LPS模型組（分別為2=216.421，P=0.000；2=151.519，P=0.000；2=133.251，P

18、=0.000），但均顯著高于M對照組（分別為2=30.61,P=0.000；2=90.55,P=0.000；2=102.44,P=0.000）。31.25 mg·L-1槐定堿的效應與另兩個濃度（15.63、7.81 mg·L-1）比較差異有統計學意義（均P0.05）。結果見表2。表2 同濃度槐定堿對LPS誘導RAW264.7細胞c-Jun表達的影響（略）3 討論 近年的研究表明，LPS激活巨噬細胞表面Toll-like receptors 4(TLR4)后，在細胞內通過信號通路逐級轉導，主要從兩個方向分別激活轉錄因子NF-B和AP-l，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是其

19、中之一，它普遍存在于多種生物體內，是導致炎癥反應發生的大多數細胞因子轉錄、蛋白生成的下游階段。目前己確定的MAPK信號轉導通路有四條2，即細胞外信號調節激酶(ERK1/2)、c-Jun N端激酶(JNK)/應激活化蛋白激酶(SAPK)、p38MAPK和ERK5/BMK1四條通路。其中c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino terminal kinase,JNK）信號轉導通路主要參與細胞因子和環境應激，如內毒素、炎癥等引起的細胞反應。JNK被LPS激活以后，活化的JNK可磷酸化c-Jun蛋白N-末端并增強其轉錄活性，c-Jun N末端磷酸化后還可促進c-Jun和c-fos異二聚體與同二聚

20、體的形成，這些二聚體可以與許多炎癥因子基因啟動子區的AP-1結合位點結合，增強這些基因的轉錄活性3-4，最終促使TNF-、NO、ICAM-1等炎癥因子的大量失控表達而致病5-8。因此c-Jun是JNK信號轉導通路下游AP-1家族中的一個關鍵的信號分子,LPS刺激細胞后經過一系列的信號轉導逐級放大可引起c-Jun蛋白的變化。本實驗觀察到c-Jun在RAW264.7細胞核中即有基礎表達，當受到LPS刺激后，RAW264.7細胞中c-Jun陽性細胞數明顯增多，證實LPS刺激可以導致細胞核內c-Jun的高表達9。本研究所用三個濃度槐定堿對LPS誘導的c-Jun表達均有抑制效應，且其效應有劑量依賴性，高

21、濃度（31.25 mg·L-1）效應強于中、低濃度，而本研究中三個濃度槐定堿本身對RAW264.7細胞c-Jun表達均無影響，說明槐定堿預處理抑制的是LPS誘導的c-Jun表達，與LPS信號轉導通路有關，而對RAW264.7細胞的c-Jun基礎表達無影響。 槐定堿預孵育細胞24h后給予LPS刺激，在本研究所設的四個時間點中，自5min起c-Jun陽性細胞數開始較同時間點LPS模型組減少，但無統計學意義，30min起各時間點均較同時間點LPS模型組顯著減少，有統計學意義（均P0.01），但均未回復至M對照組水平，說明槐定堿不能完全抑制LPS誘導的c-Jun表達，考慮可能與LPS刺激c-

22、Jun表達的某些通路是槐定堿作用不涉及的有關。另外，槐定堿作用細胞后對LPS誘導的c-Jun表達的時間效應與LPS模型組不平行。LPS模型組隨LPS作用時間延長，c-Jun陽性細胞數逐漸增高，持續升至120min；而槐定堿預處理組各時間點c-Jun陽性細胞數無明顯變化，其時間效應曲線幾乎呈一直線，但均一致性的顯著高于同時間點M對照組（P0.05或 P0.01）。由此更進一步說明，槐定堿抑制了部分誘導c-Jun表達的LPS轉導通路，但仍有一些LPS刺激c-Jun表達的通路不能被槐定堿抑制。 本實驗結果表明槐定堿可下調LPS所誘導的RAW264.7巨噬細胞c-Jun的高表達，并因此減少炎癥因子表達

23、，減輕內毒素所致炎癥反應。但內毒素信號轉導通路復雜，涉及環節眾多，因此確定槐定堿抑制LPS誘導的c-Jun蛋白表達是作用于c-Jun 還是作用于其上游的某些通路，抑或是多靶點作用，尚須更進一步研究。【參考文獻】 1韓燕，周婭，劉泉.槐定堿抗內毒素效應的初步研究J.寧夏醫學院學報，2006，28（3）：193-195.2kyriakis JM，Avruch J.Mammalian mitogen-activated Protein kinase signal transduction Pathways activated by stress and inflammationJ.Physiol R

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