1、生物分離工程生物分離工程親和純化技術親和純化技術總體學習目的和要求總體學習目的和要求 理解生物親和作用的本質，影理解生物親和作用的本質，影響因素和作用體系。親和純化的原響因素和作用體系。親和純化的原理與操作。了解幾種常用親和純化理與操作。了解幾種常用親和純化方法。方法。 目錄目錄n生物親和作用生物親和作用n親和色譜原理親和色譜原理n親和親和色色譜譜介質介質n親和吸附平衡親和吸附平衡n親和親和色色譜譜的應用的應用n親和膜親和膜色色譜譜n其它親和分離技術其它親和分離技術生物親和作用生物親和作用-學習要點學習要點n識記：識記：生物親和作用的概念生物親和作用的概念 n理解：理解：生物親和作用的本質，影

2、響生物親和作用的本質，影響親和作用的因素親和作用的因素 n應用：應用：了解常用的親和作用體系了解常用的親和作用體系 親和作用的由來親和作用的由來nAffinity一詞源于拉丁語的affinitus，意為結婚或親緣關系生物親和作用生物親和作用-定義定義 生物分子能夠區分結構生物分子能夠區分結構和性質非常接近的其他和性質非常接近的其他分子，選擇性地與其中分子，選擇性地與其中某一種分子相結合。生某一種分子相結合。生物分子間的這種特異性物分子間的這種特異性相互作用稱為親和作用相互作用稱為親和作用生物親和作用生物親和作用-本質本質n親和作用機理，特別是蛋白質親和作用機理親和作用機理，特別是蛋白質親和作用

3、機理尚不清楚尚不清楚n蛋白質表面存在一些凹陷或凸起結構蛋白質表面存在一些凹陷或凸起結構n上述結構恰好能使某些小分子進入到其中，上述結構恰好能使某些小分子進入到其中，形成構象上的鑰匙形成構象上的鑰匙- -鎖關系鎖關系n親和作用不僅依靠結構上相似性，還需要多親和作用不僅依靠結構上相似性，還需要多種力的相互作用種力的相互作用親和作用中的靜電作用親和作用中的靜電作用n中性中性pH值下，蛋白質分子上的天冬氨酸、谷氨酸和值下，蛋白質分子上的天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸等酸性氨基酸殘基帶負電荷，精氨酸、賴氨半胱氨酸等酸性氨基酸殘基帶負電荷，精氨酸、賴氨酸和組氨酸等堿性氨基酸帶正電荷酸和組氨酸等堿性氨基酸帶正電

4、荷nN末端氨基酸末端氨基酸-氨基帶正電荷，氨基帶正電荷，C末端氨基酸的羧基末端氨基酸的羧基帶負電荷帶負電荷n近距離上產生強烈的靜電引力近距離上產生強烈的靜電引力親和作用中的氫鍵作用親和作用中的氫鍵作用n親和作用的分子對的一個分子中含有氧原子或氮原親和作用的分子對的一個分子中含有氧原子或氮原子，結合部位之間形成子，結合部位之間形成O-H-O或或O-H-N的氫鍵作用的氫鍵作用n氧和氧或氮和氧原子需與氫原子基本排列在一條直氧和氧或氮和氧原子需與氫原子基本排列在一條直線上，且原子之間的距離達到一定程度線上，且原子之間的距離達到一定程度n氫鍵的產生與否受結合部位之間的位置關系的嚴格氫鍵的產生與否受結合部

5、位之間的位置關系的嚴格制約制約親和作用中的疏水性相互作用親和作用中的疏水性相互作用 如果親和作用的分子對的一個分子中含有芳如果親和作用的分子對的一個分子中含有芳香環或羥基鏈等疏水基，另一方的結合部位香環或羥基鏈等疏水基，另一方的結合部位上也含有疏水區，則兩者之間可發生疏水性上也含有疏水區，則兩者之間可發生疏水性相互作用相互作用 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸生物親和作用生物親和作用-親和作用中的相互作用力親和作用中的相互作用力n靜電作用靜電作用n氫鍵氫鍵n疏水性相互作用疏水性相互作用n配位鍵配位鍵n弱共價鍵弱共價鍵親和作用親和作用靜電作用靜電作用氫鍵氫鍵疏水性相互

6、作用疏水性相互作用配配位位鍵鍵弱共價鍵弱共價鍵除具備“鑰匙”和“鎖孔”的關系外，生物親和作用還需存在特殊的相互作用力，這也是親和作用特異性高的主要原因生物親和作用生物親和作用-影響親和作用的因素影響親和作用的因素n離子強度離子強度npHn抑制氫鍵形成的物質抑制氫鍵形成的物質n溫度溫度n離液離子離液離子n螯合劑螯合劑離子強度對親和作用的影響離子強度對親和作用的影響n親和作用主要源于靜電引力，提高離子強度親和作用主要源于靜電引力，提高離子強度會減弱或完全破壞親和作用；會減弱或完全破壞親和作用；n提高離子強度也會降低或消除氫鍵作用；提高離子強度也會降低或消除氫鍵作用；n當親和結合作用主要源于疏水性相

7、互作用，當親和結合作用主要源于疏水性相互作用，增大離子強度則可提高親和結合作用；增大離子強度則可提高親和結合作用；pH值對親和作用的影響值對親和作用的影響n作為兩性電解質的蛋白質含有多個解離基團，作為兩性電解質的蛋白質含有多個解離基團，不同解離基團具有不同的解離常數；不同解離基團具有不同的解離常數；n如果靜電引力對親和結合作用貢獻較大，如果靜電引力對親和結合作用貢獻較大，pH值會嚴重影響親和作用，即適當的值會嚴重影響親和作用，即適當的pH值下親值下親和結合作用較高，而在其他和結合作用較高，而在其他pH值下親和結合值下親和結合作用減弱直至消失；作用減弱直至消失；其它因素對親和作用的影響其它因素對

8、親和作用的影響n抑制氫鍵形成的物質抑制氫鍵形成的物質 如果親和結合作用中存在氫鍵，則加入脲或鹽酸胍可減弱親如果親和結合作用中存在氫鍵，則加入脲或鹽酸胍可減弱親和作用。和作用。n溫度溫度 溫度升高使分子和原子間熱運動加劇，減弱靜電作用、氫鍵溫度升高使分子和原子間熱運動加劇，減弱靜電作用、氫鍵和配位鍵；增強疏水性相互作用和配位鍵；增強疏水性相互作用n離液離子離液離子n螯合劑螯合劑 如果親和作用源于親和分子與金屬離子形成的配位鍵，加入如果親和作用源于親和分子與金屬離子形成的配位鍵，加入乙二胺四乙酸等螯合劑除去金屬離子會使親和作用消失乙二胺四乙酸等螯合劑除去金屬離子會使親和作用消失常見的親和作用體系常

9、見的親和作用體系特異性親和體系高特異性抗原-單克隆抗體荷爾蒙受體蛋白核酸互補堿基鏈段、核酸結合蛋白酶底物、產物、抑制劑群特異性免疫球蛋白A蛋白、G蛋白酶輔酶凝集素糖、糖蛋白、細胞、細胞表面受體酶、蛋白質-肝素酶、蛋白質-活性色素（染料）酶、蛋白質-過渡金屬離子（銅、鋅等）酶、蛋白質氨基酸（組氨酸等）親和純化親和純化定義 將具有親和作用的兩種分子中的一種分子與將具有親和作用的兩種分子中的一種分子與固體粒子或可溶性物質共價偶聯，可特異性固體粒子或可溶性物質共價偶聯，可特異性吸附或結合另一種分子，使另一種分子從混吸附或結合另一種分子，使另一種分子從混合物中得到選擇性分離純化的方法稱為親和合物中得到選

10、擇性分離純化的方法稱為親和純化。純化。 在親和純化中，一般將親和作用分子對中被固定的分子稱為親和結合對象的配基。 親和分配平衡親和分配平衡 n在親和作用體系中，如果用在親和作用體系中，如果用L L表示配基，表示配基，E E表示蛋白表示蛋白質，則配基和蛋白質之間的結合反應可表示為質，則配基和蛋白質之間的結合反應可表示為n結合常數結合常數eqKLELE LELEdK LELEeqK結合常數越大（或解離常數越小），表示親和結合作用越強。一般親和體系的結合常數為104108L/mol，最高可達到1015 L/mol，此時的親和結合基本上不可逆的。 親和親和色色譜譜原理原理-學習要點學習要點n理解：理解

11、：親和親和色色譜譜的原理與操作的原理與操作親和色譜定義 親和親和色色譜譜是利用親和吸附作用分離純化生物是利用親和吸附作用分離純化生物物質的液相物質的液相色色譜譜法。法。 親和色譜所用的固定相為鍵合親和配基的親和吸附介質（親和吸附劑）親和親和色色譜譜原理原理 親和親和色色譜譜操作與一般的固操作與一般的固定床吸附操作方式相似，定床吸附操作方式相似，多采用斷通式前端分析多采用斷通式前端分析法，分為進料、雜質清法，分為進料、雜質清洗、目標產物洗脫合層洗、目標產物洗脫合層析柱再生四步。析柱再生四步。親和親和色色譜譜原理原理n料液進料（料液進料（feedstock loadingfeedstock loa

12、ding） 含有目標產物的料液連續通入含有目標產物的料液連續通入色色譜譜柱，直至目標產柱，直至目標產物在物在色色譜譜柱出口穿透柱出口穿透n雜質清洗雜質清洗(contaminant washing) (contaminant washing) 利用與溶解原料的溶液組成相同的緩沖液為清洗液，利用與溶解原料的溶液組成相同的緩沖液為清洗液，清洗清洗色色譜譜柱除去不被吸附的雜質；柱除去不被吸附的雜質；n產物洗脫產物洗脫(target product elution) (target product elution) 利用可使目標產物與配基解離的溶液洗脫目標產物利用可使目標產物與配基解離的溶液洗脫目標產物

13、n柱再生（柱再生（column regeneration)column regeneration) 利用清洗液清洗再生利用清洗液清洗再生色色譜譜柱柱親和親和色色譜譜介質學習要點介質學習要點n理解理解：間隔臂的作用，常用親和配基種類：間隔臂的作用，常用親和配基種類n應用應用：了解親和配基的固定方法，應用實：了解親和配基的固定方法，應用實例以及親和吸附介質的要求例以及親和吸附介質的要求親和配基酶、抗體和蛋白親和配基酶、抗體和蛋白n酶的抑制劑酶的抑制劑 蛋白酶均存在抑制其活性的物質，稱為酶的抑制劑。它的分蛋白酶均存在抑制其活性的物質，稱為酶的抑制劑。它的分布很廣，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制劑

14、（結合常布很廣，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制劑（結合常數為數為109 L/mol），也有小分子化合物如氨基芐脒（結合常數），也有小分子化合物如氨基芐脒（結合常數為為4104 L/mol）。n抗體抗體 抗體和抗原之間具有高度特異性結合能力，結合常數在抗體和抗原之間具有高度特異性結合能力，結合常數在107 1012 L/moln蛋白蛋白A（或稱（或稱A蛋白）蛋白） A蛋白為分子量蛋白為分子量42 kDa的蛋白質，存在于金黃色葡萄球菌的細的蛋白質，存在于金黃色葡萄球菌的細胞壁中。它與動物免疫球蛋白胞壁中。它與動物免疫球蛋白G（IgG）具有很強的結合作用。）具有很強的結合作用。 親和配基凝集素和

15、色素親和配基凝集素和色素n凝集素凝集素 凝集素是與糖特異性結合的蛋白質的總稱。在這種蛋白質上凝集素是與糖特異性結合的蛋白質的總稱。在這種蛋白質上具有糖的結合位點。可作為多糖、糖蛋白等含糖生物分子的具有糖的結合位點。可作為多糖、糖蛋白等含糖生物分子的配基。配基。n輔酶和磷酸酰苷輔酶和磷酸酰苷 各類脫氫酶和激酶需要在輔酶存在下表現出其生物催化活性。各類脫氫酶和激酶需要在輔酶存在下表現出其生物催化活性。輔酶和脫氫酶之間有親和作用。輔酶和脫氫酶之間有親和作用。n三嗪類色素三嗪類色素 這類色素與這類色素與NAD的結合部位相同，具有抑制酶活性的作用，的結合部位相同，具有抑制酶活性的作用，能與脫氫酶、血清白

16、蛋白、干擾素、核酸酶、溶菌酶等發生能與脫氫酶、血清白蛋白、干擾素、核酸酶、溶菌酶等發生結合作用結合作用親和配基過渡金屬等親和配基過渡金屬等n過渡金屬離子過渡金屬離子 Cu2+等過渡金屬離子可與蛋白質表面的組氨酸的咪唑基發生等過渡金屬離子可與蛋白質表面的組氨酸的咪唑基發生親和結合作用。親和結合作用。Cu2+等過渡金屬離子與等過渡金屬離子與N、O和和S等供電原子等供電原子產生配位鍵。產生配位鍵。n組氨酸組氨酸n肝素肝素 肝素是存在于動物肝臟等器官中的酸性多糖類物質，分子量肝素是存在于動物肝臟等器官中的酸性多糖類物質，分子量為為5到到30kDa，它與凝血蛋白質、脂蛋白等有親和作用，它與凝血蛋白質、脂

17、蛋白等有親和作用。 親和親和色色譜譜-親和配基親和配基親和親和色色譜譜-親和親和色色譜譜介質應滿足條件介質應滿足條件n具有親水性多孔結構，無非特異性吸附；具有親水性多孔結構，無非特異性吸附；n物理和化學穩定性高，有較高的機械強度物理和化學穩定性高，有較高的機械強度n含有可活化的反應基團含有可活化的反應基團n粒徑均一的球形粒子粒徑均一的球形粒子親和親和色色譜譜-親和配基固定化親和配基固定化n親和配基的固定化方法親和配基的固定化方法n介質的活化介質的活化介質的活化方法溴化氰法介質的活化方法溴化氰法n溴化氰活化法用于親和溴化氰活化法用于親和色色譜譜介質連接含有氨基的配介質連接含有氨基的配基基n最初的

18、溴化氰活化法，需要加入最初的溴化氰活化法，需要加入NaOH至至pH為為11，成功地將配基連接到軟性介質上。但是，溴化氰是成功地將配基連接到軟性介質上。但是，溴化氰是劇毒試劑，并且具有揮發性。劇毒試劑，并且具有揮發性。n溴化氰活化介質后形成的氰氧基容易水解，而影響溴化氰活化介質后形成的氰氧基容易水解，而影響偶聯效率，活化后的介質帶有較強的電荷，導致非偶聯效率，活化后的介質帶有較強的電荷，導致非特異性吸附增加等。特異性吸附增加等。介質的活化方法環氧基法介質的活化方法環氧基法n環氧氯丙烷活化具有方便、快速、活化率高，毒性環氧氯丙烷活化具有方便、快速、活化率高，毒性低的特點，是目前廣泛采用的制備方法。

19、低的特點，是目前廣泛采用的制備方法。n活化方法：將介質用水沖洗后，加入環氧氯丙烷和活化方法：將介質用水沖洗后，加入環氧氯丙烷和適當濃度的適當濃度的NaOH，然后振蕩反應，然后振蕩反應2.5h左右。左右。n為了得到更高的活化效率，其中環氧氯丙烷和為了得到更高的活化效率，其中環氧氯丙烷和NaOH的用量，的用量，NaOH的濃度，反應時間都可以根的濃度，反應時間都可以根據具體實驗做出調整。據具體實驗做出調整。n由于環氧氯丙烷為油相，而由于環氧氯丙烷為油相，而NaOH溶液為水相，為溶液為水相，為了促進兩者反應的進行，通常在混合物中加入助溶了促進兩者反應的進行，通常在混合物中加入助溶劑二甲基亞砜（劑二甲基

20、亞砜（DMSO）。）。 介質的活化方法羰基二亞胺法介質的活化方法羰基二亞胺法親和親和色色譜譜-間隔臂的作用間隔臂的作用n當配基分子量較小時，為當配基分子量較小時，為了排除空間位阻作用，需了排除空間位阻作用，需要在配基和載體之間連接要在配基和載體之間連接一個一個“間隔臂間隔臂”n間隔臂的長度有一定限制，間隔臂的長度有一定限制，超過一定長度后，配基與超過一定長度后，配基與目標分子的親和力會減弱目標分子的親和力會減弱親和親和色色譜譜-影響親和吸附的因素影響親和吸附的因素n雜質的影響雜質的影響 料液中目標產物濃度很低，雜質很多，少量雜質料液中目標產物濃度很低，雜質很多，少量雜質的非特異性吸附，會大大降

21、低純化效果的非特異性吸附，會大大降低純化效果 雜質的非特異性吸附量與其濃度、性質、載體材雜質的非特異性吸附量與其濃度、性質、載體材料、配基固定化方法等眾多因素相關料、配基固定化方法等眾多因素相關n料液流速料液流速 流速的增大，分離速度加快，但柱效降低流速的增大，分離速度加快，但柱效降低親和親和色色譜譜-目標產物的特異性洗脫目標產物的特異性洗脫 特異性洗脫利用含有與特異性洗脫利用含有與親和配親和配基或目標產物具有親和結合作用的基或目標產物具有親和結合作用的小分子化合物小分子化合物為洗脫劑，通過與親為洗脫劑，通過與親和配基或目標產物的競爭性結合，和配基或目標產物的競爭性結合，脫附目標產物。脫附目標

22、產物。特異性洗脫條件溫特異性洗脫條件溫和，有利于保護目標產物的生物活和，有利于保護目標產物的生物活性性。另外，由于僅特異性洗脫目標。另外，由于僅特異性洗脫目標產物，對于特異性較低的親和體系產物，對于特異性較低的親和體系或非特異性吸附較為嚴重的物系，或非特異性吸附較為嚴重的物系，特異性洗脫有利于提高目標產物的特異性洗脫有利于提高目標產物的純度純度。 親和親和色色譜譜-目標產物的非特異性洗脫目標產物的非特異性洗脫 非特異性洗脫是提高洗脫液的非特異性洗脫是提高洗脫液的pH值、離子強值、離子強度、離子種類或溫度度、離子種類或溫度等理化性質降低目標產物的親等理化性質降低目標產物的親和吸附作用，是較多采用

23、的洗脫方法。當親和結合和吸附作用，是較多采用的洗脫方法。當親和結合力很大，利用通常的方法不能洗脫被吸附的目標產力很大，利用通常的方法不能洗脫被吸附的目標產物時，可利用脲或鹽酸胍等變性溶液使目標產物發物時，可利用脲或鹽酸胍等變性溶液使目標產物發生結構變化，失去與配基的親和結合作用。但這些生結構變化，失去與配基的親和結合作用。但這些變性劑容易使目標產物或固定化配基發生失活或不變性劑容易使目標產物或固定化配基發生失活或不可逆變性，需慎重使用。可逆變性，需慎重使用。親和膜親和膜-學習要點學習要點n理解：理解：親和膜原理和特點親和膜原理和特點 n應用：應用：了解親和膜的實際應用了解親和膜的實際應用 親和

24、膜親和膜-定義定義 親和膜是利用親和配基修飾的微濾膜親和膜是利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質親和純化目標蛋白質，為親和吸附介質親和純化目標蛋白質，是固定床親和層析的變型。是固定床親和層析的變型。親和膜親和膜-親和膜的提出親和膜的提出n固定床親和層析的缺陷固定床親和層析的缺陷 以多糖凝膠為固定相，機械強度低，流速受限以多糖凝膠為固定相，機械強度低，流速受限 放大困難（放大采用徑向放大）放大困難（放大采用徑向放大）n親和膜思路提出親和膜思路提出 “降低柱高、增大柱徑以降低壓降、提高流速降低柱高、增大柱徑以降低壓降、提高流速”親和膜親和膜-親和膜的原理親和膜的原理 親和配基固定在親和配基固定在

25、膜孔表面，流體在膜孔表面，流體在對流狀態下透過膜對流狀態下透過膜孔的過程中目標蛋孔的過程中目標蛋白與配基接觸而被白與配基接觸而被吸附吸附親和錯流過濾親和錯流過濾-學習要點學習要點n理解：親和錯流過濾原理和特點理解：親和錯流過濾原理和特點 n應用：了解親和錯流過濾的實際應用應用：了解親和錯流過濾的實際應用 親和錯流過濾親和錯流過濾-定義定義 親和錯流過濾是生物親和相互作用親和錯流過濾是生物親和相互作用與膜分離相結合的蛋白質類生物大分與膜分離相結合的蛋白質類生物大分子的分離純化技術子的分離純化技術親和錯流過濾親和錯流過濾-原理原理n傳統的膜過濾對蛋白質的分離是基于分子量傳統的膜過濾對蛋白質的分離是

26、基于分子量大小的差異；分子量相差大小的差異；分子量相差10倍以上的物質可倍以上的物質可得到分離，選擇性差；得到分離，選擇性差；n將親和配基固定于某些水溶性聚合物或不溶將親和配基固定于某些水溶性聚合物或不溶性微粒后，目標蛋白質將選擇性地吸附于這性微粒后，目標蛋白質將選擇性地吸附于這些修飾親和配基的材料上，從而在目標蛋白些修飾親和配基的材料上，從而在目標蛋白質與雜蛋白之間形成較大的尺寸差，提高膜質與雜蛋白之間形成較大的尺寸差，提高膜分離選擇性分離選擇性n目標產物被截留并經洗脫獲得純品目標產物被截留并經洗脫獲得純品親和錯流過濾親和錯流過濾-特點特點n優點優點吸收膜分離的優點，易于放大和連續操作吸收膜分離的優點，易于放大和連續操作吸收親和吸附高選擇性的特點吸收親和吸附高選擇性的特點親和載體無內擴散阻力，目標分子的親和結合速度快親和載體無內擴散阻力，目標分子的親和結合速度快n缺點缺點一級吸附平衡、一個理論板、效果差一級吸附平衡、一個理論板、效果差其他親和過程其他親和過程-學習要點學習要點n理解：理解：上述親和純化方法的原理和上述親和純化方法的原理和操作操作 n應用：應用：了解上