1、的 , 不是在實驗室侵染所致 。 經初步試驗觀察 , 分生孢子在老葉上雖然能較好地萌發 , 但不能形成附著 胞 , 所以 , 不能侵染老葉 , 茶園中老葉上的病斑一般 都是由成葉上病斑遺留下來的 。 3. 3 綜合治理根據試驗結果和病原菌的生物學特性 1, 8, 結 合當前的無公害茶葉生產考慮 , 對于該病的防治應 采用控制病原菌為主的措施 。 最好在深秋除去茶樹 老葉中的病葉 , 并清理茶園中的落葉 , 旨在控制越冬 菌源 。 春季的定期采摘對控制該病的流行具有明顯 的作用 。 病害特別嚴重的茶園可在深秋封園時 , 在 采用上述措施的基礎上 , 每隔 23年噴 1次石硫合 劑或波爾多液 9。

2、參考文獻1 陳宗懋 , 陳雪芬 . 茶樹病害的診斷和防治 M .上海 :上海科技出版社 ,1990.2 安徽農學院 . 茶樹病蟲害 M .北京 :農業出版社 ,1993. 3 高旭暉 . 茶樹病害研究法 J.茶業通報 , 1993(2 :26228. 4 方中達 . 植病研究法 M .北京 :中國農業出版社 ,1997. 5 Matosupono M. Some factors influenced t he tea resistance toblister blight C Proceedings of t he International Symposium on Tea Science.

3、 1991,Shizouka , J apan :The Organizing Com 2mittee of ISTS , 1992:6512654.6 Bajit G B. Relationship between morphological characteristicsand varietal resistance of sweet potato to scab infection caused by S p haceloma batatas J.Annals of Tropical Research , 1987(9 :75283.7南京 農學院 . 田間試驗 和統計方 法 M .北

4、京 :農 業 出 版社 ,1979.8 譚濟才 , 葉恭銀 , 高旭暉 , 等 . 茶樹病蟲防治學 M .北京 :中國農業出版社 ,2002.9 陳雪芬 , 陳宗懋 . 茶園農藥應用技術 M .北京 :化學工業出版社 ,2001.收稿日期 : 2007208201 修訂日期 : 2007210212基金項目 : 重慶市煙草公司資助項目 3通訊作者 E 2mail :chgxiao . cn青 枯 菌 無 致 病 枯 病 的研 究1, 肖崇剛 13, 鄒 陽 2, 袁希雷 1(1. 西南大學植物保護學院 , 重慶 400716; 2. 云南省楚雄州煙草公司武定縣分公司 651600

5、摘要 從茄子 、 番茄 、 辣椒 、 煙草青枯病株中分離出 116株無致病力青枯菌 , 室內平板噴霧法拮抗試驗結果表明 , 有21株菌在 NA 培養基上可明顯抑制青枯菌 TbRs 的生長 ; 煙草 MSK326品種溫室盆栽控病試驗表明 , Tmjd123和 Aujd82221兩株菌具有較好控病效果 ,20d 后的相對防效分別為 58. 4%和 97%。關鍵詞 煙草 ; 青枯病菌 ; 無致病力菌株 ; 防效 中圖分類號 S 435. 72; S 476. 1A preliminary study on the control of tobacco bacterial wilt by avirul

6、entstrains of Ralstonia sol a nacea r umXiao Tian 1, Xiao Chonggang 1, Z ou Yang 2, Yuan Xilei 1(1. College of Plant Protection , S outhwest Universit y , Chongqing 400716, China; 2. Chux iong Tobacco Com pany W uding B ranch , Yunnan 651600, China Abstract A total of 116avirulent strains of Ralston

7、ia solanacearum were obtained f rom the stems of eggplants , to 2matos , capsicum and tobacco that were affected by this pathogen. I n vit ro antagonistic assay by spraying indicated that 21of the strains significantly inhibited the growth of R. solanacearum TbRs on NA media. In a disease 2control e

8、xperiment with tobacco MSK326carried out in greenhouses , two isolates (Tmjd123and Aujd82221 gave satisfacto 2ry results , with 58. 4%and 97%relative control rates , respectively. K ey w ords tobacco ; Ralstonia solanacearum ; avirulent strain ; efficacy 煙草青枯病是由勞爾氏菌屬的茄假單胞桿菌(R alstoni a sol anacearum

9、 引起的熱帶 、 亞熱帶地區97 研 究 報 告 第 34卷第 2期 (2008PLAN T PRO TECTION Vol. 34No. 2(2008 煙草的重要病害 , 是一種典型的維管束病害 , 一旦 發病即可造成全株死亡 , 對煙草的產量和質量影響 極大 , 是煙草上一大毀滅性病害 1。目前對煙草青 枯病的防治 , 仍無十分有效的措施 2。生物防治具 有無公害 、 無環境污染和防治作用專化性等優點 , Okabe 在 1954年首次發現青枯菌株之間有拮抗作 用后 , 國內外許多學者開展了利用無致病力青枯菌 防治植物青枯病的研究工作 3。 A. Trigalet 等發 現誘變產生的無致病

10、力青枯菌突變株 GM I1229能 在番茄莖 、 葉部定殖 , 可阻止致病菌的增殖 , 并表 現有一定誘導抗性 , 具有較好的生物防治前景 4。 陳慶河用紫外誘變法獲得兩株無致病力菌株 , 研究 發現這兩株菌也能在番茄體內定殖 , 經盆栽試驗表 明 ,20d 后對番茄青枯病防效可達 50%以上 5。 本文探索了從 4種茄科植物上分離得到的無致病 力青枯菌株對煙草青枯病的生防潛能 。1 材料與方法1. 1 供試材料試驗煙草品種 ,提供。 指示菌 TbRs , 由本實驗室提 供。 固體培養基為 NA , 致病性測定培養基為 TTC , 液 體培養基為 NB , 配方詳見 植病研究方法 第 3版 6

11、。 1. 2 青枯菌的采集和分離在重慶北碚區 , 江津市 , 涪陵縣等地采集番茄 、 茄 、 辣椒 、 煙草青枯病病株 。兩種分離方法 , 具體參照文獻 7。青枯致病菌 株和無致病力菌株的區別參照方中達的方法 6。純 化后 , 將長出的單菌落用移植環蘸取放入盛有無菌 水 的 試 管 , 采 用 比 濁 法 使 菌 懸 液 的 濃 度 達 到 3×108cf u/mL , 加塞放于 25 條件下保存 。 1. 3 無致病力菌株的鑒定通過鞭毛染色鑒定 , 準備干凈光滑無痕紋的載 玻片 , 用新鮮制備的 NA 培養基活化菌株 , 制備染 劑 ,1824h 進行鞭毛染色并鏡檢 12。1. 4

12、 平板篩選試驗初篩 :采用噴霧法 8, 將指示菌 TbRs 涂在 NA 平 板上擴大培養 , 次日將獲得的無致病力菌株接種到 NA 平板上活化 , 然后每皿接菌 34位點 ,2次重復 , 培養 6h 后 , 將已培養好的指示菌配成 3×108cfu/mL 菌懸 液 , 裝入無菌的喉頭噴霧器中 , 將其均勻的噴在點接了 待測菌的平板上 , 每皿噴霧約 0. 2mL ,28 培養 ,48h 后觀察是否有抑菌圈形成 , 并記錄觀察結果。復篩 :方法與初篩相同 , 將初篩時有抑菌圈的菌 種接種到 NA 平板的中心位置 , 每個菌株 3次重復 , 方法同初篩 ,48h 后采用十字交叉法測量抑菌

13、帶寬 , 并記錄測量結果 。含菌培養基法 9:將復篩出的抑菌帶寬 1cm 的菌株采用噴霧法與含菌培養基法進行平板篩選比 較 。 噴霧法同初篩 。 將指示菌 TbRs 及待測菌株轉 移到 NA 平板上活化 , 并擴大培養 , TbRs 配成 3×108cf u/mL 的菌懸液 , 與約 45 的 NA 培養基按 1 10混合 ,1h 后在平板中心接入待測菌株 , 每個菌 株 3次重復 ,28 培養 ,48h 后測量抑菌帶寬 , 方法 同復篩 , 并記錄測量結果 。1. 57:NA 平 , 配成 3×108cf u/mL 菌懸液 , 3片葉齡的煙草苗從土壤中撥出 , 洗凈根部土

14、 壤 , 分別浸泡在相應的菌懸液中 , 對照浸水 , 浸泡 2h , 每處理 12株 , 然后移栽到塑料缽 。 15d 后傷根 灌接活性菌株發酵液 , 濃度調整為 3×108cf u/mL , 每株苗灌 5mL ,48h 后再灌 1次 ,48h 后同法接種 指示菌 TbRs 菌懸液 , 設置 3個對照 ,C K 空 灌無菌 水 ,C K Rs 灌指示菌 , C K X 灌待測菌株發酵液 。放于 28 的溫室中 , 在接種后 3d 開始觀察并記錄結果 。 復測 10:將初測防治效果好的菌株進行復測 。 方法與初測類似 , 煙草苗菌懸液浸根后移栽 , 每處理 10株 ,3次重復 。待煙苗

15、生長 20d 后 , 傷根灌接復 測菌株發酵液 , 每株 5mL ,5d 后再灌 1次 , 第 2次 處理 48h 后 , 同法接種指示菌 TbRs , 放于 28 的 溫室中 , 出現病株后連續觀察 , 并記錄結果 。病情分級標準為 11:0級為無癥狀 ;1級為植株 開始出現萎蔫癥狀 , 莖部出現短條黑斑 ;2級為植物 50%的葉片萎蔫 , 莖部有較大黑斑 ;3級為煙株葉片 除頂葉 23片葉外 , 全部萎蔫 , 莖部黑斑長而寬 ;4級為全株葉片萎蔫 , 莖大部變黑 。2 結果與分析2. 1 無致病力菌株鑒定結果鏡檢觀察結果表明 (圖 1 , 試驗中篩選出菌株 菌體短桿狀 , 兩端鈍圓 , 單

16、極鞭毛 13根 , 與青枯菌 0 8 第 34卷第 2期 (2008PLAN T PRO TECTION Vol. 34No. 2(2008研 究 報 告菌體形態描述相符 。 圖 1 青枯菌無致病力菌株鞭毛染色結果2. 2 無致病力菌株平板篩選結果據方中達的方法區分青枯致病菌株和無致病力 菌株 6, 從采集的 184份樣本上直接分離得到菌株 138株 , 其中無致病力菌株 116株 , 致病菌株 22株 ,將無致病力菌株進行平板篩選 , 菌活性的菌株共 63株 。 抑菌帶寬 >1株 , 抑菌帶寬最大是 TbW1, 23為 1. 38cm , ; 0. 51cm 的菌株 12, <0

17、. 5cm 的菌株 30株如表 1。將抑菌帶寬 >1cm 的菌株 Tmjd123采用噴霧法和含菌培養基兩種篩選方法比較 , 結果 如圖 2。 對于同一個菌株 , 采用噴霧法得到的抑菌 帶寬普遍大于含菌培養基法得到的 , 只有 Tmt32221、 Tb YYk121兩個菌株是例外 , 說明這兩個菌株對指示菌可能具有溶菌作用 。從圖 3看出 , 噴霧法中部分菌株的抑菌帶寬小于 1cm , 與第 1次復篩的結 果不 一致 , 它們 是 Au00422、 Aujd522、 Tb YYk121、 TbW223、 TbW12721, 說明這些菌株的抑菌活性不穩定性 , 抑菌作用開始衰退 (圖 3 。

18、圖 2 青枯菌無致病力菌株平板篩選的 1. Tm00222; 2. Tm00222r ; 3. Tm22221; 4. Tm7; 5. Tm12; 6. Tmt32221;7. Tmjd123; 8. Au00421; 9. Au00422; 10. Au 2jd321; 11. Aujd522; 12. Aujd82221; 13. Aujd102221; 14. Au 2jd102222;15. Aujd112124;16. Ll124;17. L623;18. Tb YYk121;19. TbW223;20. TbW12721;21. TbW12722圖 3 Tmjd123菌株對煙草青枯

19、菌的抑制作用表 1 青枯菌無致病力菌株平板篩選結果抑菌帶寬度 /cm菌株數量 /株菌株名稱 >121T m00222、 T m22221、 T m7、 T m12、 T mt 32221、 T mjd123、 Au00421、 Au00422、 Aujd321、 Aujd522、 Aujd82221、 Aujd102221、 Aujd102222、 Aujd112123、 Aujd112124、 Ll124、 L623、 Tb YYk121、 TbW223、 TbW12721、 TbW12722;0. 5112Tm10、 Aujd322、 Aujd523、 Aujd112122、 Ll1

20、21、 L522、 L422、 Tb YY 1、 Tb YY 7Tb YYn2、 TbW324、 Tb YYk123; <0. 530Tm00221、 Tm00622、 Tm121、 Tm8、 Tm11、 Tm13、 Tmt12221、 Tmt12223、 Tmt32121、 Tmt32122、 Tmjd12721、 Tmjd12722、 Tmjd223、 Tmjd225、 Aul22121、 Aul22122、 Aul221、 Aujd121、 Aujd122、 Aujd421、 Aujd422、 Aujd521、 Aujd62222、 Aujd1021、 Aujd1122、 Tb Y

21、Y n121、 Tb YYk12221、 Tb YY k221、 Tb YYk2222. 3 溫室控病試驗結果將抑菌帶寬 >1cm 的菌株 (21株 進行溫室控 病試驗 , 在初次測定的結果中 , 測定的大部分菌株能 夠推遲 7d 左右發病 , C K X 只灌接待測菌株的煙草 苗未表現異常 。測定結果如表 2。 20d 后 16株的相對防效均大于 60%, 其中 Au00421、 Aujd82221、 Tmjd123、 L623、 Tb YYk121的相對防效大于 80%,1株的相對防效為 40%60%, 只有 4株的相對防效 小于 40%。 根據菌株在 NA 培養基上的生長勢及 溫室

22、控病試驗初測結果 , 將 Tmjd123、 Aujd82221兩18 研 究 報 告 第 34卷第 2期 (2008PLAN T PRO TECTION Vol. 34No. 2(2008 個菌株進行溫室控病復測 , 結果如表 3。 20d 后 Tmjd123對煙草青枯病的相對防效為 58. 4%,Au 2jd82221的為 97%。表 2 青枯菌無致病力菌株溫室控病 20d 后的初測結果防效 /%菌株數量 /株編號 <404T m22221、 T m12、 TbW223、 TbW1272140601Tm00222r >6016Au00421、 Au00422、 Aujd321、

23、Aujd522、Aujd82221、 Aujd102221、 Aujd102222、 T mt 32221、 Aujd112124、 T mjd123、 T m7、 T m00222、 Ll124、 L623、 TbYYk121、 TbW12722表 3 青枯菌無致病力菌株溫室控病 20d 后的復測結果 1處理發病數/株病株率/%病情 指數相對防 效 /%CK 空 0000CK Rs 30100. 050. 00Tmjd123933. 320. 858. 4Aujd82221310. 02. 597. 1 各處理供試盆栽植株均為 30株。3 討論, 從 198株中 篩選到防效較好的 2株菌72

24、8, 本試驗采用青枯菌不同寄主分離篩選對煙草青枯菌有防效的無致病力菌 株 , 從 116株中篩到 2株理想菌 , 相對比較容易獲得 理想菌株 , 原因可能是來自不同寄主的無致病力菌 株 , 與原寄主在協同進化過程中 , 產生了相關物質 , 而這些物質對煙草青枯菌可能具有更強的抑制作 用 。 試驗中對平板篩選出的抑菌效果較好的菌株進 行了兩種平板篩選方法的比較 , 噴霧法抑菌帶寬普 遍大于含菌培養基法 。究其原因 , 可能主要由于噴 霧法先接種活性菌 , 有利于抑制煙草青枯菌的活性 物質的產生和積累 , 而含菌培養基法同時接種活性 菌及煙草青枯菌 , 活性物質的產生和積累比噴霧法 相對滯后 。

25、有兩個菌株的情況相反 , 說明它們對煙 草青枯菌可能還具有溶菌作用 。 通過兩種方法的比 較 , 作者認為 , 噴霧法比含菌培養基法操作簡便 , 快 捷 , 適用于平板篩選試驗 。建議可在溫室控病試驗 后 , 再對最終篩選出防效較好的菌株進行含菌培養 基法等相關平板抑菌試驗 , 以便為探討活性菌株的 控病作用機制提供更多依據 。試驗結果表明 , 對煙草青枯菌平板抑菌作用強 的菌株 , 溫室控病效果不一定好 , TbW12721的平板 抑菌作用最強 , 但是溫室控病效果不理想 , 初測 7d 后相對防效為 50%, 20d 后無防效 。 Tmjd123和 Aujd82221平板抑菌作用幾乎無差別

26、 , 但是溫室控病作用差異大 , 說明無致病力菌株對煙草青枯菌的平 板抑菌作用強弱與溫室控病效果好壞不存在正相 關 , 這與前人研究的結果相同 7。說明無致病力菌 株對煙草青枯菌的控病作用 , 除了與菌株本身產生 的抑菌活性物質相關外 , 還與菌株是否能在寄主上 定殖 , 與致病菌位點競爭能力以及是否誘導寄主抗 性等因素相聯系 。 本試驗中篩選出溫室控病防效較 好的菌株 , 對于其具體的控病作用機制 , 以及其他無 體外抑菌活性的菌株 , , 。1 朱賢朝 , 王彥亭 , 王智法 . 中國煙草病蟲害防治手冊 M .北京 :中國農業出版社 ,2003.2 孔凡玉 . 煙草青枯病的綜合防治 J.煙草科技 ,2003,