1、河南省科技攻關計劃項目申 請 書姓 名： JiangDongbao 項目名稱： FGFR4表達對結直腸癌細胞株生物學行為的影響及作用機制的研究 單 位： 鄭州大學 聯系電話： 填 報 說 明 請根據自己的專業及研究方向，針對某具體臨床問題，結合所學習臨床科研方法的一種或幾種寫出一份科研設計。完成后，文件以個人姓名命名，發至：1736601711。考核成績依設計書優略評定。截至日期2013年11月8日。一、項目的立項依據和意義（說明國內外相關領域技術發展水平和趨勢等） 結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是起源于結直腸黏膜上皮的惡性腫瘤，是臨床最常見的惡性腫瘤之一。我國每年結直

2、腸癌新發病例超過25萬，死亡病例約14萬，新發與死亡病例均占全世界同期結直腸癌病例的20%1。局部進展期結直腸癌5年癌癥相關生存率為70%，而發生遠處轉移的晚期結直腸癌5年生存率僅為12%，且生活質量低。目前結直腸癌新輔助化療、輔助化療、姑息化療方案很多，如ECF、DCF、奧沙利鉑+氟尿嘧啶、順鉑+氟尿嘧啶等，但其最核心的藥物是氟尿嘧啶，在此基礎上聯合其他化療藥物。近年來，靶向藥物在結直腸癌治療領域的研究和應用成為一大熱點，作用于EGFR的愛必妥、作用于VEGF的貝伐單抗、針對Her-2的赫賽汀等已進入胃癌治療的臨床實驗中。 成纖維生長因子受體（FGFRs）是一個多基因家族,屬免疫球蛋白基因超

3、家族成員,是分布在多種細胞上的膜蛋白，FGFR家族成員有FGFR1、FGFR2、FGFR3以及FGFR4。它們的特點是在胞膜外含有3個免疫球蛋白樣結構域，一個疏水的跨膜結構，胞漿內含有兩個呈串聯結構的酪氨酸激酶功能區。FGFR13在體內是廣泛分布的,而FGFR4主要在發育早期大量表達,而且主要分布在視網膜和腎臟。編碼FGFR4蛋白的FGFR4基因位于5號染色體，5q35.1-qter，基因編號為2264。FGFR4蛋白是一類具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受體中的一種,在胚胎發育、組織修復和血管形成等進程中起著十分重要的作用2,3。但FGFR4在惡性腫瘤中的研究相對較少，Pubmed檢索該分

4、子在胃癌中的研究僅見幾篇報道，而且研究尚不深入。但有學者認為，FGFR家族是在惡性腫瘤診治方面是一個新興的領域，有廣闊的應用前景4。FGFR4在常見的惡性腫瘤如乳腺癌、胰腺癌、橫紋肌肉瘤及腎細胞癌中均呈高表達5-7。Meijer D等報道FGFR4表達是復發性乳腺癌患者的獨立的預后因素8；Milano等研究亦認為FGFR4可以預測三苯氧胺治療乳腺癌的療效9。Gowardhan等10 研究報道，與良性增生相比，FGFR4在前列腺癌中的表達顯著上調；FGFR4的表達與Gleason評分相關；生存分析顯示，FGFR4過表達與較差的預后相關，無病生存期縮短。Ho HK等對57對肝細胞肝癌組織及對應的正

5、常組織進行real time PCR定量檢測FGFR4在mRNA水平的表達，統計結果顯示，FGFR4的表達與患者的主要臨床病理資料無相關性，可能是由于樣本量較小11。Streit等12通過免疫組化技術對137例惡性黑色素瘤組織標本進行FGFR4蛋白水平表達進行檢測，結果顯示，FGFR4在惡性黑色素瘤組織標本中的表達率為45%，FGFR4的表達與腫瘤臨床分期、微潰瘍形成、原發灶的數目、總生存期及無病生存期均有明顯相關性，作者認為FGFR4蛋白的表達可作為惡性黑色素瘤進展的潛在指標。自2002年，Bange等13發現了FGFR4 Gly388Arg這一胚系多態性后，該SNP現已成為了一個研究的熱點

6、。該SNP是位于FGFR4第9外顯子388密碼子上，堿基G轉變為A，導致了FGFR4的氨基酸序列發生了變化，即388位氨基酸由甘氨酸轉變為精氨酸，該位點位于FGFR4的高度保守序列中。據報道，FGFR4 Arg388基因型并不影響腫瘤的發生過程，因為在乳腺癌患者及正常對照中，該SNP在兩組中的分布比例大致相同，FGFR4 Arg388基因型均占50%左右。但在淋巴結陽性的乳腺癌患者中，FGFR4 Arg388基因型與更短的無病生存期和總生存期有關14。有報道顯示，攜帶有Arg388等位基因的肺癌患者腫瘤發病年齡更早，差的臨床分期的比例更高，生存期更短，所以FGFR4 Gly388Arg可能預測

7、肺癌的預后15。這些發現強調了該SNP位點具有臨床意義，這一推斷已在頭頸部癌、前列腺癌、肺癌等惡性腫瘤中得以證實3, 16-18。當然也有一些文獻認為該SNP無預后價值。近來，一項隨機的II期實驗研究中，257例T2-4/N0-2/M0原發性乳腺癌患者接受了阿霉素和環磷酰胺（AC）或阿霉素和培美曲唑（AP），序貫多西他賽（Doc）作為新輔助化療，多因素分析顯示，FGFR4 Arg388是AC-Doc作為乳腺癌患者新輔助治療方案病理性完全緩解的獨立預后因素19。Sugiyama等發現了MT1-MMP/FGFR4這個復合物，其中FGFR4 R388等位基因可通過減少溶酶體對MT1-MMP的降解而增

8、加對膠原蛋白的侵襲；通過siRNA下調MT1-MMP或FGFR4-R388均可阻止細胞侵襲和生長20。近來一項meta分析顯示，FGFR4 Gly388Arg多態性與前列腺癌的進展相關，可作為前列腺癌的進展的一個分子標記21。在目前發現的20余種成纖維生長因子（FGF）中，能與FGFR4結合的生長因子有FGF1, 2, 4, 6, 8, 9, 16, 17, 18 和 19。其中只有FGF19僅對FGFR4特異性結合22。且無論有無-Klotho存在，FGF19均可與FGFR4結合而引起后續的生物學效應23。FGFR4的激活是FGF19促進肝細胞增殖，誘導肝癌形成的機制24FGFR4在在結直腸

9、癌中的研究甚少，故而本課題重點探討了FGFR4的表達對結直腸癌細胞株的生物學行為的影響及作用機制。本研究為了解FGFR4對結直腸癌細胞株生物學特性的影響，進行了體外功能實驗，通過慢病毒轉染技術下調FGFR4的表達，然后進行了一系列功能實驗，包括增殖實驗、克隆實驗、侵襲實驗、劃痕實驗、流式細胞儀檢測細胞的凋亡和細胞周期的變化，western blot檢測凋亡及細胞周期相關蛋白在干擾前后的變化，初步探討FGFR4影響結直腸癌細胞株生物學行為的機制。1.International Agency for Research On Cancer. World Health Organization. GL

10、OBOCAN 2012: Estimated Cancer Incidence,Mortality and Prevalence Worldwide in 2012EB/OL 2014-12-5.2. Eswarakumar VP, Lax I, Schlessinger J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev 2005; 16:13949.3. Wang J, Stockton DW, Ittmann M. The fibroblast growth fac

11、tor receptor-4 Arg388 allele is associated with prostate cancer initiation and progression. Clin Cancer Res 2004;10:616978.4. Katoh M. Genetic alterations of FGF receptors: an emerging field in clinical cancer diagnostics and therapeutics. Expert Rev Anticancer Ther 2010;10:1375-9.5. Jacquemier J, A

12、delaide J, Parc P, et al.Expression of the FGFR1 gene in human breastcarcinoma cells. Int J Cancer 1994;59:373-86. Leung HY, Gullick WJ, Lemoine NR. Expression and functional activity of fibroblast growth factors and their receptors in human pancreatic cancer. Int J Cancer 1994;59:667-75.7. Takahash

13、i A, Sasaki H, Kim SJ, et al. Identification of receptor genes in renal cell carcinoma associated with angiogenesis by differential hybridization technique. Biochem Biophys Res Commun 1999;257:855-9. 8. Meijer D, Sieuwerts AM, Look MP, et al. Fibroblast growth factor receptor 4 predicts failure on t

14、amoxifen therapy in patients with recurrent breast cancer. Endocr Relat Cancer. 2008;15:101-11.9. Milano A, Dal Lago L, Sotiriou C, et al. What clinicians need to know about antioestrogen resistance in breast cancer therapy. European Journal of Cancer 2006 ;42:2692705.10. Gowardhan B, Douglas DA, Ma

15、thers ME, et al. Evaluation of the fibroblast growth factor system as a potential target for therapy in human prostate cancer. Br J Cancer. 2005;92:320-7.11. Ho HK, Pok S, Streit S, et al. Fibroblast growth factor receptor 4 regulates proliferation, anti-apoptosis and alpha-fetoprotein secretion dur

16、ing hepatocellular carcinoma progression and represents a potential target for therapeutic intervention. J Hepatol. 2009;50:118-27. 12. Streit S, Mestel DS, Schmidt M, FGFR4 Arg388 allele correlates with tumour thickness and FGFR4 protein expression with survival of melanoma patients.Br J Cancer. 20

17、06;94:1879-86.13. Bange J, Prechtl D, Cheburkin Y, et al. Cancer progression and tumor cell motility are associated with the FGFR4 Arg(388) allele. Cancer Res 2002; 62:840-47.14. Thussbas C, Nahrig J, Streit S,et al. FGFR4 Arg388 allele is associated with resistance to adjuvant therapy in primary br

18、east cancer.J Clin Oncol 2006;24:3747-55.15. Spinola M, Leoni V, Pignatiello C, et al. Functional FGFR4 Gly388Arg polymorphism predicts prognosis in lung adenocarcinoma patients. J Clin Oncol 2005; 23:7307-11.16. Ma Z, Tsuchiya N, Yuasa T, et al. Polymorphisms of fibroblast growth factor receptor 4

19、have association with the development of prostate cancer and benign prostatic hyperplasia and the progression of prostate cancer in a Japanese population.Int J Cancer 2008;123:2574-9.17. Falvella FS, Frullanti E, Galvan A, et al.FGFR4 Gly388Arg polymorphism may affect the clinical stage of patients

20、with lung cancer by modulating the transcriptional profile of normal lung.Int J Cancer 2009;124:2880-5.18. Tanuma J, Izumo T, Hirano M, et al. FGFR4 polymorphism, TP53 mutation, and their combinations are prognostic factors for oral squamous cell carcinoma. Oncol Rep 2010; 23:739-44.19. Marmé F

21、, Werft W, Benner A，et al. FGFR4 Arg388 genotype is associated with pathological complete response to neoadjuvant chemotherapy for primary breast cancer. Ann Oncol 2010 ;21:1636-42.20. Sugiyama N, Varjosalo M, Meller P,et al. Fibroblast growth factor receptor 4 regulates tumor invasion by coupling f

22、ibroblast growth factor signaling to extracellular matrix degradation. Cancer Res. 2010;70:7851-61.21. Xu B, Tong N, Chen SQ, et al. FGFR4 Gly388Arg polymorphism contributes to prostate cancer development and progression: A meta-analysis of 2618 cases and 2305 controls. BMC Cancer 2011; 1:84.22. Xie

23、 MH, Holcomb I, Deuel B, Dowd P, Huang A, Vagts A, Foster J, Liang J, Brush J, Gu Q, Hillan K, Goddard A, et al. FGF-19, a novel fibroblast growth factor with unique specificity for FGFR4. Cytokine 1999;11:72935.23.Wu X, Ge H, Lemon B, et al. Selective ac

24、tivation of FGFR4 by an FGF19 variant does not improve glucose metabolism in ob/ob mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Amer

25、ica 2009; 106:1437984. 24. Xinle Wu，Hongfei Ge，Bryan Lemon, et al.FGF19-induced Hepatocyte Proliferation Is Mediated through FGFR4 Activation. Journal of biological chemistry2010; 285:5165-70.二、項目創新點、主要研究開發內容及目標（實施方案、技術關鍵、技術路線和技術經濟指標等）1.實施方案（1）設計4個FGFR4RNAi靶點構建到慢病毒載體，進而小量包裝秤病毒顆粒。然后感染S

26、W620和HCT116結直腸癌，通過定量PCR和Western blot法檢測FGFR4在mRNA和蛋白水平的表達，篩選出干擾效果最佳的siRNA，進行大量包裝，形成FGFR4 siRNA穩定轉染的細胞株，FGFR4持續低表達；構建FGFR4過表達慢病毒載體，進而包裝成病毒顆粒, 然后感染結直腸癌細胞株，形成FGFR4 過表達細胞株，FGFR4持續高表達，以備后續功能實驗。2. 對FGFR4 siRNA穩轉細胞株和FGFR4 過表達細胞株，分別以各自未行處理的細胞株作為對照，進行一系列的體外功能實驗，以評價FGFR4的上調和下調對結直腸癌細胞生物學行為的影響，包括增殖實驗、克隆實驗、侵襲實驗、

27、凋亡實驗及細胞周期的變化；同時在分子水平進行Western blot檢測，以顯示不同處理后，細胞增殖、侵襲、凋亡及細胞周期相關蛋白表達的變化，如MMP-2、p27、CyclinD1及Bcl-xl等。3. 分別將FGFR4 siRNA穩轉細胞株、FGFR4 過表達細胞株和相應的未處理的結直腸癌細胞株皮下注射至裸小鼠（nu/nu）背部, 構建成裸小鼠結直腸癌模型。接種6-8周后，觀測不同處理組成瘤體積、大小等增殖指標的變化；對裸小鼠結直腸癌組織行免疫組化檢測，以了解不同處理組腫瘤細胞生物學特性相關分子表達的變化。2研究方法和研究手段：1.標本來源：結直腸癌細胞株HCT116、SW620、DLD1、

28、SW116、LS47等均購自上海中科院細胞所或ATCC，按說明書培養，利用DMEM培養基、Gibico美洲胎牛血清、100IU/ml青霉素及100ug/ml鏈霉素等培養細胞。BALB/c（nu-nu）裸小鼠擬購自中國科學院上海藥物研究所，合格證編號：滬動合證字122號；日齡：28-32天；體重16-20；飼養于SPF級環境中。用于FGFR4 RNAi和過表達實驗的慢病毒載體擬購自上海基凱公司。2利用軟件設計3-4個FGFR4 RNAi靶點，構建到慢病毒載體上，進而包裝成病毒顆粒，然后感染FGFR4高表達的結直腸癌細胞株，經RT-PCR和Western blot驗證干擾效率，制備成FGFR4 R

29、NAi穩轉細胞株。同樣，運用慢病毒載體構建FGFR4過表達結直腸癌細胞株。3.利用流式細胞儀、CCK-8及侵襲小室等對FGFR4 RNAi穩轉株和FGFR4過表達細胞株進行體外功能實驗，包括增殖實驗、克隆實驗、侵襲實驗、凋亡實驗及細胞周期的變化；同時在分子水平進行Western blot檢測結直腸癌生物特性相關分子表達的變化。4將FGFR4 RNAi穩轉株、FGFR4過表達細胞株及相應的未感染細胞株分別皮下注射入裸小鼠背部，構建成裸鼠結直腸癌模型，進行體內實驗。觀測成瘤體積等細胞增殖指標，利用免疫組化技術檢測FGFR4不同表達的裸鼠結直腸癌模型相關分子表達的變化。3.技術路線見圖一有效靶點大量

30、包裝設計4個FGFR4基因RNAi靶點構建到慢病毒載體載體小量包裝慢病毒顆粒感染HCT116、SW620結直腸癌細胞株FGFR4mRNA和蛋白質的表達干擾效率滿意FGFR4基因過表達慢病毒載體構建過表達載體小量包裝慢病毒顆粒感染結直腸癌細胞株FGFR4mRNA和蛋白的表達qPCR和WesternBlotFGFR4過表達滿意基因功能研究成瘤的體積、大小等增值指標的評價腫瘤組織MMP-2、p27、CyclinD1、BCL-xl表達的變化MMP-2、p27、CyclinD1、BCL-xl表達的變化增值、侵襲、凋亡、細胞周期變化等試驗In vivoIn vitro裸鼠結直腸癌模型的構建 圖一4.技術關

31、鍵本課題關鍵技術在于FGFR4 RNAi慢病毒載體的構建及FGFR4 RNAi穩轉結直腸癌細胞株的建立；FGFR4過表達慢病毒載體的構建及FGFR4 過表達結直腸癌細胞株的建立；FGFR4不同表達的裸小鼠結直腸癌模型的構建；一系列體外功能實驗、體內功能實驗及相關分子檢測，探討FGFR4在結直腸癌發生發展中的作用三、實施本項目已具備的條件（說明已具備的試驗手段、技術力量、前期科研基礎情況）（1）本課題申請人可獨立進行的實驗操作主要包括：新鮮標本DNA和RNA的抽提和測定；RT-PCR及real time PCR的操作和結果分析；免疫組化技術的操作和結果分析；細胞培養技術；蛋白抽提、濃度測定、we

32、stern blot檢測靶分子蛋白表達及結果分析；siRNA瞬時轉染技術及轉染效率測定；CCK-8法檢測細胞增殖實驗。流式細胞術的檢測，細胞免疫熒光技術在實驗室老師協助下完成。（2).慢病毒構建RNAi載體及過表達載體，是一些非常成熟的技術，FGFR4 RNAi穩轉株和FGFR4過表達細胞株的建立可請上海吉凱公司協助完成，而該公司為專業從事介導靶分子上調和下調病毒載體的制備和包裝，已和前期研究所在實驗室有過多次成功合作先例；而構建裸小鼠腫瘤模型亦是一項常用的研究技術，可請相關老師指導完成。（3）本課題在葉延偉老師的帶領下進行，葉老師在復旦大學附屬腫瘤醫院攻讀腫瘤學博士學位，期間在復旦大學實驗研

33、究中心進行了為期1年的博士課題實驗部分的研究，獨立完成了一系列實驗操作，實驗結果已經發表。碩博連讀期間以第一作者發表SCI論著5篇，最高IF為5.131分，累計IF達18分，分別發表于Cancer、Cancer letters、Annals of surgical oncology、Journal of surgical oncology、digestive surgery；此外，以共同作者發表國內外論著10余篇。鄭州大學附屬第一醫院重點實驗室韓超老師給予實驗技術方面的幫助，韓老師是鄭州大學的在職博士，實驗技術精湛，經驗豐富。（4）.鄭州大學第一附屬醫院重點實驗室實驗設備齊全，各個實驗領域均有

34、專業實驗指導員，為該研究順利實施提供了很好的平臺。四、項目的預期經濟、社會和環境效益FGFR4在結直腸癌中的研究很少，而且不夠深入。本課題利用慢病毒載體構建FGFR4 RNAi穩轉結直腸癌細胞株和FGFR4過表達細胞株，分別下調和上調FGFR4分子的表達，進行一系列的體內和體外功能實驗，從而更全面、多角度地闡述FGFR4在結直腸癌發生發展中的作用，為結直腸癌新的治療靶點的篩選提供一些依據，目前國內外文獻尚未見相關報道。五、項目實施的計劃進度1. 2016年1月-2016年6月：1） 結直腸癌細胞株的培養,包括HCT116、SW620及其他常見結直腸癌細胞株；篩選出FGFR4高表達和低表達結直腸癌細胞株。2） FGFR4 RNAi慢病毒載體的構建與包裝,結直腸癌細胞株SW620、HCT116的感染, qPCR和western blot反復檢測FGFR4 RNAi慢病毒感染的效率，制備FGFR4 RNAi穩轉結直腸癌細胞株。3）FGFR4過表達慢病毒載體的構建與包裝，慢病毒顆粒感染FGFR4低表達結直腸癌細胞株，制備FGFR4過表達結直腸癌細胞株。2. 2016年7月-2016年12月：1）以FGFR RNAi穩轉結直腸癌細胞株、FGFR4過表達結直腸癌細胞株和各自的未感染細胞株為研究對象，進行一系列的體