1、發酵過程控制發酵過程控制第八章第八章定定 義義發酵過程即發酵過程即細胞的生物反應過程細胞的生物反應過程，是指由生，是指由生長繁殖的長繁殖的細胞細胞所引起的所引起的生物反應生物反應過程。不僅過程。不僅包括了以往包括了以往“發酵發酵”的全部領域，而且還包的全部領域，而且還包括括固定化細胞的反應過程固定化細胞的反應過程、生物法廢水處理生物法廢水處理過程和細菌采礦等過程過程和細菌采礦等過程。研究發酵過程的意義研究發酵過程的意義發酵體系的特征發酵體系的特征內容內容發酵過程控制概述發酵過程控制概述溫度溫度對發酵的影響及其控制對發酵的影響及其控制pH 值值對發酵的影響和控制對發酵的影響和控制溶解氧溶解氧對發

2、酵的影響和控制對發酵的影響和控制CO2和呼吸商對和呼吸商對發酵的影響和控制發酵的影響和控制 基質濃度基質濃度對發酵的影響及其控制對發酵的影響及其控制 通氣攪拌通氣攪拌對發酵的影響及其控制對發酵的影響及其控制 泡沫泡沫對發酵的影響及其控制對發酵的影響及其控制 高密度發酵與過程控制高密度發酵與過程控制 發酵終點發酵終點的檢測與控制的檢測與控制 自動控制技術自動控制技術的應用的應用發酵過程控制概述發酵過程控制概述常規發酵工藝控制參數常規發酵工藝控制參數 直接狀態參數：溫度、直接狀態參數：溫度、pHpH值、攪拌轉值、攪拌轉速、液位、補料速率等速、液位、補料速率等 間接狀態參數：產物濃度、溶解氧、間接狀

3、態參數：產物濃度、溶解氧、溶解溶解CO2等等發酵過程優化控制步驟發酵過程優化控制步驟控制方式：控制方式： 一般檢控系統包括一般檢控系統包括3 3個部分個部分 發發 酵酵 控控 制制Fermentation Control Sample AnalysispHDOSugarAmmoniaPhosphateSulphateProductsPrecursorsContaminationPressure probeLevel probepH probeTemp. probeDO probeAntifoamAcid/BaseCoolingAir/agitationSugar/Oilfeed發酵過程參數檢測

4、發酵過程參數檢測 發酵過程發酵過程參數的檢測參數的檢測是控制發酵過程的重要依據是控制發酵過程的重要依據 檢測方法檢測方法 通過儀器通過儀器在線在線檢測檢測 發酵罐中發酵罐中取樣離線取樣離線檢測檢測 常用的檢測儀器常用的檢測儀器 在線檢測：傳感器在線檢測：傳感器 離線檢測：分光光度計、氣相和液相色譜儀等離線檢測：分光光度計、氣相和液相色譜儀等 直接狀態參數：直接反應發酵過程中直接狀態參數：直接反應發酵過程中微生物生理代微生物生理代謝狀況謝狀況的參數的參數 對傳感器的要求：對傳感器的要求：耐高溫、高壓；避免表面被微生耐高溫、高壓；避免表面被微生物堵塞物堵塞 有價值的狀態參數：有價值的狀態參數：尾氣

5、分析和空氣流量的檢測尾氣分析和空氣流量的檢測 間接狀態參數：采用直接狀態參數計算得到的參數間接狀態參數：采用直接狀態參數計算得到的參數 離線發酵分析法離線發酵分析法 沒有一種可在線監測培養基成分和代謝產沒有一種可在線監測培養基成分和代謝產物的傳感器物的傳感器 發酵液的基質、前體、代謝產物和菌量的發酵液的基質、前體、代謝產物和菌量的監測通過人工取樣和離線分析監測通過人工取樣和離線分析 缺點：缺點：不連貫性和滯后性不連貫性和滯后性發酵過程的代謝控制發酵過程的代謝控制 調節營養物質調節營養物質通過細胞膜進入細胞的能力通過細胞膜進入細胞的能力 調節代謝流調節代謝流 調節調節酶的合成量酶的合成量 調節調

6、節酶的催化活力酶的催化活力發酵過程檢測控制的主要發酵過程檢測控制的主要的參數的參數-物理參數物理參數檢測參數檢測參數檢測方法檢測方法 單位單位 影響影響溫度溫度鉑電阻鉑電阻 熱敏電阻熱敏電阻 qP c*罐壓罐壓(0.20.5105Pa)隔膜傳感器隔膜傳感器壓敏電阻壓敏電阻Pa保持正壓，防止染菌保持正壓，防止染菌O2 及及 CO2 的溶解度的溶解度 攪拌轉數攪拌轉數頻率計數器頻率計數器 r/min Kla 發酵液的均勻性發酵液的均勻性 攪拌功率攪拌功率(2 -4KW/m3)功率計功率計kWKla 空氣流量空氣流量浮子流量計浮子流量計 孔板差壓計孔板差壓計 m3 h-1vvm Kla 粘度粘度旋轉

7、粘度計旋轉粘度計 Pa s Kla 濁度濁度濁度計濁度計%反映單細胞的生長反映單細胞的生長 料液的流量料液的流量蠕動泵蠕動泵 荷重傳感器荷重傳感器量筒量筒 L h-1 S 發酵過程檢測控制的主要的參數發酵過程檢測控制的主要的參數-化學參數化學參數檢測參數檢測參數檢測方法檢測方法 單位單位 影響及作用影響及作用pH復合玻璃電極復合玻璃電極 菌體和產物合成速度菌體和產物合成速度酶促反應的方向酶促反應的方向基質濃度基質濃度產物濃度產物濃度HPLC 離子選擇電極離子選擇電極 生物傳感器生物傳感器 取樣取樣g L-1 qP發酵周期的長短發酵周期的長短氧化還原電位氧化還原電位氧化還原電位電極氧化還原電位電

8、極 mV 生長和生化活性生長和生化活性溶氧濃度溶氧濃度覆膜氧電極覆膜氧電極 % qo2氣相氣相O2含量含量 順磁氧分析儀順磁氧分析儀 Pa反映反映OUR 和和 Kla 氣相氣相CO2含量含量 紅外氣體分析儀紅外氣體分析儀 %反映反映OUR 和和 Kla 發酵過程檢測控制的主要的參數發酵過程檢測控制的主要的參數-生物參數生物參數檢測參數檢測參數檢測方法檢測方法 單位單位 影響影響菌絲形態菌絲形態攝像顯微鏡攝像顯微鏡 取樣鏡檢取樣鏡檢 反映菌體發育階反映菌體發育階段和正常與否段和正常與否菌體濃度菌體濃度取樣取樣 ：干重、濁：干重、濁度、活菌計數、度、活菌計數、離心沉降離心沉降g g L L-1-1

9、 影響菌體的生化影響菌體的生化反應反應K Klala一一 、溫度對發酵的影響及控制、溫度對發酵的影響及控制1 1 影響發酵溫度的因素：發酵熱影響發酵溫度的因素：發酵熱 產熱因素產熱因素 生物熱生物熱 通氣熱通氣熱 攪拌熱攪拌熱 散熱因素散熱因素 蒸發熱蒸發熱 輻射熱輻射熱1.1 1.1 發酵熱發酵熱發酵熱就是發酵過程中釋放出來的凈熱量。發酵熱就是發酵過程中釋放出來的凈熱量。 Q發酵發酵=Q生物生物+Q攪拌攪拌+Q通氣通氣-Q蒸發蒸發-Q輻射輻射發酵熱的測定發酵熱的測定方法一方法一： 通過測定一定時間內冷卻水的流量和冷卻水的進出口溫度，通過測定一定時間內冷卻水的流量和冷卻水的進出口溫度，由下式求

10、得這段時間內的發酵熱：由下式求得這段時間內的發酵熱： Q發酵發酵 = GC (t2- t1) / V (J / m3 h) G - 冷卻水流量，冷卻水流量，kg/h C - 水的比熱，水的比熱， J/kg t1、t2 - 進、出口的冷卻水溫度，進、出口的冷卻水溫度， V - 發酵液體積發酵液體積 ， m3方法二： 通過罐溫的自動控制，先使罐溫達到恒定，再關閉自動控制通過罐溫的自動控制，先使罐溫達到恒定，再關閉自動控制裝置測得溫度隨時間上升的速率裝置測得溫度隨時間上升的速率S, S, 按下式可求得發酵熱按下式可求得發酵熱 ： Q 發酵發酵 = K SS - S - 溫度隨時間上升的速率，溫度隨時

11、間上升的速率，/h/hK - K - 總參數，代表系統的熱容量，總參數，代表系統的熱容量，J/LJ/LK K值可由下式求得：值可由下式求得： K = (MCp)發酵液發酵液 + (MCp)容器容器 + (MCp)附件附件M 以每升發酵液計的發酵液、容器、附件的重量以每升發酵液計的發酵液、容器、附件的重量Cp Cp 代表各自的比熱代表各自的比熱一般微生物發酵過程中的最大發酵熱約為一般微生物發酵過程中的最大發酵熱約為 4.186 (30008000) kJ / m3 h生物熱是生產菌在生長繁殖時產生的大量熱量。培生物熱是生產菌在生長繁殖時產生的大量熱量。培養基中碳水化合物、脂肪、蛋白質等物質被分解

12、為養基中碳水化合物、脂肪、蛋白質等物質被分解為CO2、NH3和水時釋放出的大量能量。和水時釋放出的大量能量。用途：合成高能化合物供微生物生命代謝活動用途：合成高能化合物供微生物生命代謝活動 合成產物合成產物 熱能散發熱能散發影響生物熱的因素影響生物熱的因素 生物熱隨菌株、培養基、發酵時期的不同而不同生物熱隨菌株、培養基、發酵時期的不同而不同對于某一種微生物，生物熱的產生具有強烈的時間性對于某一種微生物，生物熱的產生具有強烈的時間性 孢子發芽和生長初期，產生數量有限孢子發芽和生長初期，產生數量有限 進入進入對數生長期對數生長期后，大量產生，此后逐漸減少后，大量產生，此后逐漸減少生物熱的大小還與菌

13、體的生物熱的大小還與菌體的呼吸強度呼吸強度有對應關系有對應關系培養基成分培養基成分越豐富，菌體利用營養物質速率越大，生物熱越豐富，菌體利用營養物質速率越大，生物熱產生越多產生越多在四環素發酵在四環素發酵中，可看到當中，可看到當產生的產生的生物熱生物熱達到高峰時，達到高峰時，糖的利用速度糖的利用速度也最大。也最大。有人提出，可有人提出，可從菌體的耗氧從菌體的耗氧率來衡量生物率來衡量生物熱的大小。熱的大小。 四環素生物合成過程中系列參數的動態變化過程四環素生物合成過程中系列參數的動態變化過程1 1：效價；：效價；2 2：呼吸強度；：呼吸強度；3 3：生物熱；：生物熱；4 4：糖濃度：糖濃度 通風發

14、酵都有大功率攪拌，攪拌的機械運動造成液通風發酵都有大功率攪拌，攪拌的機械運動造成液體之間、液體與設備之間的體之間、液體與設備之間的摩擦而產生的熱摩擦而產生的熱 。 Q攪拌攪拌=3600（P/V） 3600：熱功當量（熱功當量（kJ/（kW.h） （P/V）：）：通氣條件下單位體積發酵液所消耗的功通氣條件下單位體積發酵液所消耗的功率（率（ kW/m3） 通入發酵罐的空氣，其溫度和濕度隨季節及控制通入發酵罐的空氣，其溫度和濕度隨季節及控制條件的不同而有所變化。條件的不同而有所變化?？諝膺M入發酵罐后，就空氣進入發酵罐后，就和發酵液廣泛接觸進行熱交換和發酵液廣泛接觸進行熱交換。必然會引起水分。必然會引

15、起水分的蒸發；蒸發所需的熱量即為蒸發熱。的蒸發；蒸發所需的熱量即為蒸發熱。 1.5 1.5 輻射熱：由于發酵罐內外溫度差，通過罐輻射熱：由于發酵罐內外溫度差，通過罐體向外輻射的熱量。體向外輻射的熱量。 輻射熱可通過罐內外的溫差求得，冬天影響大，輻射熱可通過罐內外的溫差求得，冬天影響大，夏天影響小一般不超過發酵熱的夏天影響小一般不超過發酵熱的5%。2 溫度控制溫度控制 在發酵罐上安裝夾套或盤管調節在發酵罐上安裝夾套或盤管調節 溫度高時，通過循環冷卻水控制溫度高時，通過循環冷卻水控制 溫度低時，通過加熱使夾套或盤管中水溫度低時，通過加熱使夾套或盤管中水的循環實現對溫度的控制的循環實現對溫度的控制3

16、 溫度對發酵的影響溫度對發酵的影響 影響各種酶的反應速率和蛋白質性質影響各種酶的反應速率和蛋白質性質 影響發酵液的物理性質：影響氧的溶解和傳影響發酵液的物理性質：影響氧的溶解和傳遞；影響對基質的分解和吸收速度遞；影響對基質的分解和吸收速度 影響生物合成的方向影響生物合成的方向溫度對微生物生長的影響溫度對微生物生長的影響 溫度直接影響溫度直接影響酶反應酶反應，從而影響著生物體的生命活動。，從而影響著生物體的生命活動。微生物的生長和產物的合成在酶的作用下進行微生物的生長和產物的合成在酶的作用下進行 微生物的生長是一系列復雜的生化反應的綜合結果，微生物的生長是一系列復雜的生化反應的綜合結果，反應速率

17、受到溫度的影響反應速率受到溫度的影響發酵過程，微生物生長速率變化發酵過程，微生物生長速率變化 dX/dt = X- X : 比生長速率比生長速率 ：比死亡速率比死亡速率 當處于生長狀態時，當處于生長狀態時， , 可忽略?？珊雎浴?與與 與溫度有關與溫度有關 根據根據ArrenhniusArrenhnius公式公式 = Ae = Ae-E/RT-E/RT = Ae = Ae-E/RT-E/RT 通常通常EE大于大于E E，所以所以 比比 對溫度變化對溫度變化更為敏感更為敏感 例：青霉菌生產青霉素例：青霉菌生產青霉素 青霉菌生長活化能青霉菌生長活化能E=34kJ/mol 青霉素合成活化能青霉素合成

18、活化能E=112kJ/mol 青霉素合成速率對溫度較敏感，溫度控青霉素合成速率對溫度較敏感，溫度控制相當重要。制相當重要。微生物的適宜溫度微生物的適宜溫度 多數微生物：多數微生物： 20C- 40C 嗜冷菌：嗜冷菌：20C 以下生長速率最大；以下生長速率最大； 嗜中溫菌：嗜中溫菌：30-35C 嗜熱菌：嗜熱菌：50C 以上生長以上生長 篩選高溫菌株具有重要的實踐意義篩選高溫菌株具有重要的實踐意義溫度對微生物生長的影響 嗜冷菌在溫度低于嗜冷菌在溫度低于2020下生長速率最大下生長速率最大 嗜中溫菌在嗜中溫菌在30-3530-35左右生長速率最大左右生長速率最大 嗜熱菌在嗜熱菌在5050以上生長速

19、率最大以上生長速率最大 曲線形狀相似；當溫度增曲線形狀相似；當溫度增加加1010，生長速率大致增長，生長速率大致增長一倍。一倍。 溫度超過最適生長溫度，溫度超過最適生長溫度，生長速率隨溫度增加而迅速生長速率隨溫度增加而迅速下降下降3.1 溫度對微生物生長的影響溫度對微生物生長的影響 在最適溫度范圍內在最適溫度范圍內 不同不同生長階段的微生物對溫度生長階段的微生物對溫度的反應不同的反應不同 延遲期延遲期：敏感：敏感 最適溫度最適溫度 對數生長期對數生長期：最適溫度范圍內提高溫度：最適溫度范圍內提高溫度 生長后期：取決于生長后期：取決于溶解氧濃度溶解氧濃度，提高通氣量，提高通氣量 溫度和微生物生長

20、的關系溫度和微生物生長的關系 一方面在其最適溫度范圍內，生長一方面在其最適溫度范圍內，生長速度速度隨溫度升高的增加隨溫度升高的增加； 另一方面，不同生長階段的微生物另一方面，不同生長階段的微生物對溫度的反應不同對溫度的反應不同 3.2 溫度對基質消耗的影響溫度對基質消耗的影響 溫度的變化影響溫度的變化影響基質消耗和比生長速率基質消耗和比生長速率 生產中，適當抑制生長生產中，適當抑制生長(菌體的過量生長菌體的過量生長導致群體的退化和產率降低）導致群體的退化和產率降低） 溫度對產物合成影響不大時溫度對產物合成影響不大時，適當提高，適當提高溫度抑制生長，有利于生產節能溫度抑制生長，有利于生產節能3.

21、3 溫度對產物合成的影響溫度對產物合成的影響 影響各種反應速率影響各種反應速率 改變發酵液的物理性質，影響產物的合成改變發酵液的物理性質，影響產物的合成 影響生物合成的方向影響生物合成的方向 對代謝有調節作用對代謝有調節作用 例如，四環素發酵中金色鏈霉菌同時能產生例如，四環素發酵中金色鏈霉菌同時能產生金霉素。在金霉素。在低于低于30 30 溫度溫度下，該菌種合成下，該菌種合成金金霉素能力較強霉素能力較強。當溫度提高，合成四環素的。當溫度提高，合成四環素的比例也提高。在溫度比例也提高。在溫度達達3535則只產生四環素則只產生四環素而金霉素合成幾乎停止。而金霉素合成幾乎停止。 低溫時，低溫時，氨基

22、酸合成氨基酸合成途徑的終產物對第一個途徑的終產物對第一個酶的反饋抑制比正常溫度時大，因此酶的反饋抑制比正常溫度時大，因此在抗生素發在抗生素發酵后期，降低溫度，使蛋白質和核酸的正常合成酵后期，降低溫度，使蛋白質和核酸的正常合成途徑關閉，轉向目的產物的合成途徑關閉，轉向目的產物的合成最適溫度是一種相對概念，是指在該溫度下最適于菌的生最適溫度是一種相對概念，是指在該溫度下最適于菌的生長或發酵產物的生成。長或發酵產物的生成。最適發酵溫度與最適發酵溫度與菌種、培養基成分、培養條件和菌體生長菌種、培養基成分、培養條件和菌體生長階段有關。階段有關。最適發酵溫度的選擇最適發酵溫度的選擇在發酵整個周期內僅選一個

23、最適培養溫度不一定好。在發酵整個周期內僅選一個最適培養溫度不一定好。溫度的選擇要參考其它發酵條件。溫度的選擇要參考其它發酵條件。溫度的選擇還應考慮培養基成分和濃度溫度的選擇還應考慮培養基成分和濃度最適溫度的確定最適溫度的確定最適溫度的選擇最適溫度的選擇1 1）根據）根據菌種及生長階段菌種及生長階段選擇選擇微生物種類不同，所具有的酶系及其性質不同，所要求的溫微生物種類不同，所具有的酶系及其性質不同，所要求的溫度范圍也不同。度范圍也不同。 如黑曲霉生長溫度為如黑曲霉生長溫度為370C， 谷氨酸產生菌棒狀桿菌的生長溫度為谷氨酸產生菌棒狀桿菌的生長溫度為30320C， 青霉菌生長溫度為青霉菌生長溫度為

24、300C。 前期菌量少，取稍高的溫度，使菌生長迅速；前期菌量少，取稍高的溫度，使菌生長迅速；中期中期菌量已達到合成產物的最適量，發酵需要延長中期，菌量已達到合成產物的最適量，發酵需要延長中期，從而提高產量，因此溫度要稍低一些，可以推遲衰老。因從而提高產量，因此溫度要稍低一些，可以推遲衰老。因為在稍低溫度下氨基酸合成蛋白質和核酸的正常途徑關閉為在稍低溫度下氨基酸合成蛋白質和核酸的正常途徑關閉得比較嚴密有利于產物合成。得比較嚴密有利于產物合成。后期后期產物合成能力降低，延長發酵周期沒有必要，提高溫產物合成能力降低，延長發酵周期沒有必要，提高溫度，刺激產物合成到放罐。度，刺激產物合成到放罐。如：如：

25、四環素生長階段四環素生長階段28C，合成期，合成期26C后期再升溫；后期再升溫；黑曲霉生長黑曲霉生長37C，產糖化酶，產糖化酶3234C。但也有的菌種產物形成比生長溫度高但也有的菌種產物形成比生長溫度高谷氨酸產谷氨酸產生菌生長生菌生長3032C，產酸，產酸3437C。最適溫度選擇要根據最適溫度選擇要根據菌種與發酵階段菌種與發酵階段做試驗。做試驗。二階段發酵二階段發酵菌體生長和產物合成所需菌體生長和產物合成所需的最適溫度不一定相同。的最適溫度不一定相同。變溫培養變溫培養 抗生素生產中，通過抗生素生產中，通過變溫培養變溫培養比恒溫比恒溫培養得到的產物多。培養得到的產物多。 最適溫度的選擇和控制，可

26、有效的提最適溫度的選擇和控制，可有效的提高產物的產率高產物的產率例如：例如： 青霉素產生菌的最適生長溫度是青霉素產生菌的最適生長溫度是3030，而最適于青，而最適于青霉素合成的溫度是霉素合成的溫度是2020。 發酵過程中，在生長初期抗生素還未開始合成，菌絲發酵過程中，在生長初期抗生素還未開始合成，菌絲還未長濃，這時的溫度應適于微生物的生長；還未長濃，這時的溫度應適于微生物的生長； 到抗生素分泌期，菌絲已長到一定濃度，積累抗生素到抗生素分泌期，菌絲已長到一定濃度，積累抗生素是重點考慮，此時應滿足生物合成的最適溫度。是重點考慮，此時應滿足生物合成的最適溫度。例：例：林可霉素發酵的變溫培養林可霉素發

27、酵的變溫培養問題的提出問題的提出接種后接種后10h10h左右已進入對數生長期，隨后是左右已進入對數生長期，隨后是10h10h左右的加速生長期，左右的加速生長期，在在40h40h左右對數生長期基本完成，在左右對數生長期基本完成，在50h50h左右轉入生產期左右轉入生產期主要問題：主要問題：如何維持適度的菌體濃度和延長分泌期？如何維持適度的菌體濃度和延長分泌期？適當降低培養溫度可以延緩菌體的衰老和維持相當數量適當降低培養溫度可以延緩菌體的衰老和維持相當數量的有強生產能力的菌絲體存在的有強生產能力的菌絲體存在變溫培養的正交設計變溫培養的正交設計結論：結論：前前60h60h按按3131控制，控制，縮短

28、了適應期縮短了適應期使發酵提前轉入生使發酵提前轉入生產階段，同時菌絲體已有相當量的積累，為大量分泌抗生產階段，同時菌絲體已有相當量的積累，為大量分泌抗生素提供了物質基礎素提供了物質基礎6060小時后將罐溫降至小時后將罐溫降至3O3O使與使與抗生素合成有關的酶的活性抗生素合成有關的酶的活性增強增強，抗生素分泌量有所增加，同時因分泌期的延長有利，抗生素分泌量有所增加，同時因分泌期的延長有利于進一步積累抗生素于進一步積累抗生素發酵進入后期罐溫再回升至發酵進入后期罐溫再回升至31 31 使生產菌在生命的最后階使生產菌在生命的最后階段段最大限度的合成和排出次級代謝產物最大限度的合成和排出次級代謝產物。2

29、 2）根據培養條件選擇）根據培養條件選擇溫度選擇還要根據溫度選擇還要根據培養條件培養條件綜合考慮，靈活選擇。綜合考慮，靈活選擇。通氣條件差時可適當通氣條件差時可適當降低溫度降低溫度，使菌呼吸速率降低些，使菌呼吸速率降低些，溶氧濃度也可高些。溶氧濃度也可高些。培養基稀薄時，培養基稀薄時，溫度也該低些溫度也該低些。因為溫度高營養利用快，。因為溫度高營養利用快，會使菌過早自溶。會使菌過早自溶。3 3）根據菌生長情況）根據菌生長情況菌生長快，維持在較高溫度時間菌生長快，維持在較高溫度時間要短要短些；菌生長慢，維些；菌生長慢，維持較高溫度時間持較高溫度時間可長可長些。培養條件適宜，如營養豐富，通些。培養

30、條件適宜，如營養豐富，通氣能滿足，前期溫度可高些，以利于菌的生長。氣能滿足，前期溫度可高些，以利于菌的生長。總的來說，溫度的選擇根據總的來說，溫度的選擇根據菌種生長階段及培養條件菌種生長階段及培養條件綜綜合考慮。要通過反復實踐來定出最適溫度。合考慮。要通過反復實踐來定出最適溫度。利用溫度控制提高產量的實例：熱沖擊處理技術提高發利用溫度控制提高產量的實例：熱沖擊處理技術提高發酵甘油的產量酵甘油的產量實驗：實驗：正交條件正交條件 A 沖擊溫度（沖擊溫度（0C） 40，45，50 B 開始時機（開始時機（h） 8，16，30 C 沖擊時間（分）沖擊時間（分） 15，30，60結果發酵結果發酵16小時

31、，小時，45 C沖擊沖擊30分鐘最佳，發酵分鐘最佳，發酵96小時后甘油濃度小時后甘油濃度提高提高32.6。（A）16h,45 C,30min（B）12h,45 C,30min 利用計算機模擬確定最佳發酵條件，正逐步利用計算機模擬確定最佳發酵條件，正逐步得到推廣應用。得到推廣應用。 根據模擬計算機對發酵溫度最佳點的計算，得到青根據模擬計算機對發酵溫度最佳點的計算，得到青霉素發酵的最適溫度是：霉素發酵的最適溫度是： 起初起初5h維持在維持在30；隨后降到；隨后降到25，培養，培養35h；再降；再降到到20培養培養85h；最后回升到；最后回升到25培養培養40h放罐。放罐。 采用這種變溫培養，比在采

32、用這種變溫培養，比在25恒溫培養青霉素產量提恒溫培養青霉素產量提高高15%。發酵溫度的控制發酵溫度的控制在發酵罐上安裝夾套和蛇罐，通過循環冷卻水控制。在發酵罐上安裝夾套和蛇罐，通過循環冷卻水控制。冷卻介質：深井水或冷凍水冷卻介質：深井水或冷凍水控制方式：手動控制或自動控制控制方式：手動控制或自動控制溫度計溫度計溫度控制器溫度控制器調節閥調節閥 二、二、 pH對發酵的影響及控制對發酵的影響及控制 發酵過程中培養液的發酵過程中培養液的pH值是微生物在一定環境條件下值是微生物在一定環境條件下代謝活動的綜合指標，是一重要發酵參數。對代謝活動的綜合指標，是一重要發酵參數。對菌體的菌體的生長和產品的積累生

33、長和產品的積累有很大影響。有很大影響。 因此，必須掌握發酵過程中因此，必須掌握發酵過程中pHpH的變化規律，及時監測的變化規律，及時監測并加以控制，使其處于最佳狀態。并加以控制，使其處于最佳狀態。 盡管多數微生物能在盡管多數微生物能在3434個個pHpH單位的單位的pHpH范圍內生長，范圍內生長，但是在發酵工藝中，為了達到高生長速率和最佳產物但是在發酵工藝中，為了達到高生長速率和最佳產物形成，必須使形成，必須使pHpH在在很窄的范圍內很窄的范圍內保持恒定。保持恒定。 不同種類微生物，對不同種類微生物，對pHpH要求不同；要求不同；酵酵 母：母：pH 3.8pH 3.86.06.0細細 菌：菌：

34、pH 6.5pH 6.57.57.5霉霉 菌：菌：pH 4.0pH 4.05.85.8放線菌：放線菌：pH 6.5pH 6.58.08.0 pHpH不同，微生物代謝產物不同。不同，微生物代謝產物不同。 黑曲霉黑曲霉pHpH：2 23 3，檸檬酸，檸檬酸 發酵發酵pHpH：7.07.0，草酸發酵，草酸發酵谷氨酸菌谷氨酸菌pHpH：7 78 8，GAGA發酵發酵pHpH：5.05.05.85.8，谷氨酰胺發酵，谷氨酰胺發酵釀酒酵母釀酒酵母pHpH：4.5-5.04.5-5.03 3，乙醇，乙醇 發酵發酵pHpH：8.08.0，甘油發酵，甘油發酵pHpH在微生物培養的不同階段有不同的影響在微生物培養

35、的不同階段有不同的影響 生長生長合合成成pH對菌體生長影響比產物合成影響小對菌體生長影響比產物合成影響小例例 青霉素：菌體生長最適青霉素：菌體生長最適pH3.56.0,產物合成最適產物合成最適pH7.27.4 四環素：菌體生長最適四環素：菌體生長最適pH6.06.8，產物合成最適，產物合成最適pH5.86.0XpH 微生物生長和發酵的最適宜微生物生長和發酵的最適宜pHpH可能不同?？赡懿煌?。丙酮丁醇菌丙酮丁醇菌生長：生長：pH 5.5pH 5.57.0;7.0;發酵：發酵：pH 4.3-5.3;pH 4.3-5.3;鏈霉素菌鏈霉素菌生長：生長： pH 6.3-6.9pH 6.3-6.9發酵：發

36、酵： pH 6.7-7.3pH 6.7-7.3青霉素菌青霉素菌生長：生長：pH 6.5-7.2pH 6.5-7.2發酵：發酵：pH 6.2-6.8pH 6.2-6.8pHpH值值變變化化的的原原因因 微生物代謝活動分微生物代謝活動分泌酸或堿性物質泌酸或堿性物質利用培養基中的生利用培養基中的生理酸性鹽或堿性鹽理酸性鹽或堿性鹽幾種抗生素合成的最適幾種抗生素合成的最適PH值值 鏈霉素、紅霉素：中偏堿性鏈霉素、紅霉素：中偏堿性6.8-7.4 金霉素、四環素：金霉素、四環素：5.9-6.33 青霉素：青霉素：6.5-6.8pHpH值對微生物的生長繁殖和產物合成的影響值對微生物的生長繁殖和產物合成的影響

37、pHpH影響酶的活性影響酶的活性 pHpH影響微生物細胞膜所帶電荷的狀態影響微生物細胞膜所帶電荷的狀態 pHpH影響培養基某些組分和中間代謝產物離解影響培養基某些組分和中間代謝產物離解 pHpH不同，往往引起菌體代謝過程的不同，使不同，往往引起菌體代謝過程的不同，使代謝產物的質量和比例發生改變代謝產物的質量和比例發生改變影響菌體原生質膜電荷的改變，引起膜影響菌體原生質膜電荷的改變，引起膜對離子的滲透作用，影響營養物的吸收對離子的滲透作用，影響營養物的吸收和代謝產物的分泌。和代謝產物的分泌。 例如：黑曲霉在例如：黑曲霉在pH2-3時，發酵產生檸檬酸，在時，發酵產生檸檬酸，在pH接近中性時，則產生

38、草酸。接近中性時，則產生草酸。 如：丙酮丁醇發酵中，發酵后期如：丙酮丁醇發酵中，發酵后期pH為為4.3-5.3時時積累丙酮丁醇，積累丙酮丁醇，pH升高則丙酮丁醇產量減少，而升高則丙酮丁醇產量減少，而丁酸、乙酸含量增加。丁酸、乙酸含量增加。舉例：舉例： 影響菌體的生長：影響菌體的生長：產黃曲霉的細胞壁的厚度就隨產黃曲霉的細胞壁的厚度就隨pH值的增值的增加而減?。浩渚z直徑在加而減小：其菌絲直徑在pH6.0時為時為23 m；pH7.4時為時為218 m，并呈膨脹酵母狀；，并呈膨脹酵母狀；pH值下降后菌絲形態又會值下降后菌絲形態又會恢復正常?；謴驼?。 影響產物合成：影響產物合成：合成青霉素的最適合

39、成青霉素的最適pH值范圍為值范圍為6.56.8。 影響產物穩定性影響產物穩定性：-內酰胺抗生素沙納霉素的發酵中，內酰胺抗生素沙納霉素的發酵中，pH在在6.77.5之間時抗生素的產量相近，高于或低于這個范之間時抗生素的產量相近，高于或低于這個范圍，合成受到抑制。在這個圍，合成受到抑制。在這個pH值范圍內，沙納霉素的穩定值范圍內，沙納霉素的穩定性未受到嚴重影響；但性未受到嚴重影響；但pH7.5時，穩定性下降，半衰期縮時，穩定性下降，半衰期縮短，發酵單位也下降。青霉素在堿性條件下發酵單位低，短，發酵單位也下降。青霉素在堿性條件下發酵單位低，也與青霉素的穩定性有關。也與青霉素的穩定性有關。發酵過程中發

40、酵過程中pHpH的變化及影響的變化及影響pHpH變化的因素變化的因素發酵過程中pH的變化1 1）生長階段）生長階段 pHpH有上升或下降趨勢（相對于接種后起始有上升或下降趨勢（相對于接種后起始pHpH而言）而言）如：如：利福霉素利福霉素B B發酵起始發酵起始pHpH為中性，但生長初期由于菌為中性，但生長初期由于菌體產生的體產生的蛋白酶水解蛋白胨而生成銨離子蛋白酶水解蛋白胨而生成銨離子，使，使pHpH上升至上升至堿性；堿性；隨著隨著銨離子的利用及葡萄糖利用銨離子的利用及葡萄糖利用過程中產生的有機酸使過程中產生的有機酸使pHpH下降到酸性范圍。下降到酸性范圍。2 2）生產階段）生產階段 在生產階段

41、，在生產階段，pHpH趨于穩定，維持在最適趨于穩定，維持在最適 產物合成的范圍產物合成的范圍3 3）自溶階段）自溶階段 菌絲自溶階段，隨著基質的耗盡，菌體蛋白酶活菌絲自溶階段，隨著基質的耗盡，菌體蛋白酶活 躍，培養液中躍，培養液中氨基氮增加氨基氮增加，致使，致使pHpH上升，此時菌上升，此時菌 絲趨于自溶而代謝活動終止。絲趨于自溶而代謝活動終止。培養基中營養物質的代謝引起培養基中營養物質的代謝引起pH的變化的變化 培養基培養基pHpH在發酵過程中能被菌體代謝所改變。在發酵過程中能被菌體代謝所改變。若陰離子氮源被利用后產生若陰離子氮源被利用后產生NHNH3 3，pHpH上升；有機上升；有機酸的積

42、累，使酸的積累，使pHpH下降。下降。 一般來說，一般來說，高碳源培養基傾向于向酸性高碳源培養基傾向于向酸性pHpH轉移轉移，高氮源培養基傾向于向堿性，高氮源培養基傾向于向堿性pHpH轉移，與轉移，與碳氮比直接有關。碳氮比直接有關。 生理酸性物質和生理堿性物質的消耗生理酸性物質和生理堿性物質的消耗2 2、引起發酵液中、引起發酵液中pHpH變化的因素變化的因素 發酵過程中發酵過程中pHpH的變化取決于的變化取決于微生物的種類、微生物的種類、培養基的組成和發酵條件培養基的組成和發酵條件。 在菌體代謝過程中，菌體本身有建成其生長在菌體代謝過程中，菌體本身有建成其生長最適最適pHpH的能力，但外界條件

43、發生較大變化時，的能力，但外界條件發生較大變化時，pHpH將會不斷波動。將會不斷波動。 以產生利福霉素以產生利福霉素SV的地中海諾卡菌進行發酵研究，采的地中海諾卡菌進行發酵研究，采用用pH值為值為6.0、6.8、7.5三個出發值，結果發現：三個出發值，結果發現： pH值在值在6.8、7.5時，最終發酵時，最終發酵pH值都達到值都達到7.5左右，菌絲左右，菌絲生長和發酵單位都達到正常水平；生長和發酵單位都達到正常水平； pH值為值為6.0時，發酵中期時，發酵中期pH值只達值只達4.5，菌濃僅為，菌濃僅為20，發酵單位為零。發酵單位為零。 這說明菌體僅有一定的自調能力。這說明菌體僅有一定的自調能力

44、。v碳源過量碳源過量v消泡油添加過量消泡油添加過量v生理酸性物質的存在生理酸性物質的存在引起引起pHpH下降的因素下降的因素v氮源過多氮源過多v生理堿性物質的存在生理堿性物質的存在v中間補料，堿性物質添加過多中間補料，堿性物質添加過多引起引起pHpH上升的因素上升的因素原則：有利于原則：有利于菌體生長和產物的合成菌體生長和產物的合成。一般根據實驗結果確定。一般根據實驗結果確定。最適最適pHpH與菌株、培養基組成、發酵工藝與菌株、培養基組成、發酵工藝有關。應按發酵過程的不同階段分別控有關。應按發酵過程的不同階段分別控制不同的制不同的pHpH范圍。范圍。最適最適pHpH的選擇的選擇 微生物微生物生

45、長階段和產物合成階段的最適生長階段和產物合成階段的最適pHpH往往不同往往不同，這不僅與菌種特性有關，也取決于產物的化學性質。這不僅與菌種特性有關，也取決于產物的化學性質。例如： 一般產生堿性抗生素的，如灰色鏈霉菌生產鏈霉一般產生堿性抗生素的，如灰色鏈霉菌生產鏈霉素、紅色鏈霉菌產生紅霉素，其合成產物的最適素、紅色鏈霉菌產生紅霉素，其合成產物的最適pHpH為為6.8-7.36.8-7.3，中性偏堿；而產生兩性抗生素的，如金色，中性偏堿；而產生兩性抗生素的，如金色鏈霉菌生產金霉素，其合成產物的最適鏈霉菌生產金霉素，其合成產物的最適pHpH為為5.9-6.3,5.9-6.3,弱酸性。弱酸性。 最適最

46、適pHpH與微生物生長，產物形成之間相互關系有四與微生物生長，產物形成之間相互關系有四種類型：種類型： 菌體比生長速率菌體比生長速率 和產物比生產速率和產物比生產速率Q QP P的最適的最適pHpH在一個相在一個相似的較寬的范圍內（比較容易控制）；似的較寬的范圍內（比較容易控制）； 較寬，較寬， Q Qp p范圍較窄，或范圍較窄，或 較窄，較窄， Q Qp p范圍較寬（難控制，范圍較寬（難控制，應嚴格控制）；應嚴格控制）； 和和 Q Qp p對對pHpH都很敏感，其最適都很敏感，其最適pHpH相同（應嚴格控制）；相同（應嚴格控制）； 更復雜，更復雜， 和和 Q Qp p對對pHpH都很敏感，并

47、有各自的最適都很敏感，并有各自的最適pHpH（難度難度最大）；最大）；v調節基礎培養基的配方調節基礎培養基的配方v調節碳氮比（調節碳氮比（C/NC/N）v添加緩沖劑添加緩沖劑v補料控制補料控制直接加酸加堿直接加酸加堿補加碳源或氮源補加碳源或氮源pHpH的控制的控制應應 用用青霉素發酵青霉素發酵 通過調節加糖速率來控制通過調節加糖速率來控制 pH值的方法，與值的方法，與恒速加糖和酸堿控制法相比，產量提高了恒速加糖和酸堿控制法相比，產量提高了1/4鏈霉素發酵鏈霉素發酵 補充氨控制補充氨控制pH值，控制的同時補充了產物值，控制的同時補充了產物合成所需的氨。合成所需的氨。pH的控制系統的控制系統pH電

48、極電極設定設定控制器控制器調節閥調節閥6.5pHUncontrolledControlled經消毒的經消毒的pHpH電極裝入發酵罐電極裝入發酵罐內，定時直接測定培養基的內，定時直接測定培養基的pHpH，同時還可以與控制儀表，同時還可以與控制儀表連接，通過回路系統控制閥連接，通過回路系統控制閥門或泵進行門或泵進行pHpH調節。調節。pH控制的常用方法控制的常用方法 配制合適的培養基配制合適的培養基 加入非營養基質的酸堿調節劑加入非營養基質的酸堿調節劑 加入基質性的酸堿調節劑加入基質性的酸堿調節劑 加入生理酸性鹽或堿性鹽基質加入生理酸性鹽或堿性鹽基質 把把pH的控制和代謝調節結合，通過補料控制的控

49、制和代謝調節結合，通過補料控制pH值的具體調節方法：值的具體調節方法： 1) 添加添加CaCO3。有機酸發酵時形成鈣鹽沉淀。有機酸發酵時形成鈣鹽沉淀。但是，碳酸鈣用量大，消毒困難，易堵塞管道，但是，碳酸鈣用量大，消毒困難，易堵塞管道，在操作上易引起染菌，而且對產物的提取有影在操作上易引起染菌，而且對產物的提取有影響。響。此法在工業上不使用。此法在工業上不使用。 2) 氨水流加法氨水流加法 3) 尿素流加法尿素流加法 尿素流加法：尿素流加法：味精廠多用。味精廠多用。 尿素首先被菌體尿酶分解成氨，氨進入發酵尿素首先被菌體尿酶分解成氨，氨進入發酵液，使液，使pHpH上升，當上升，當NHNH4 4+

50、+被菌體作為氮源消耗并形被菌體作為氮源消耗并形成有機酸時，發酵液成有機酸時，發酵液pHpH下降；下降； 隨著尿素的補加，氨進入發酵液，又使隨著尿素的補加，氨進入發酵液，又使發酵發酵液液pHpH上升及補充氮源上升及補充氮源，如此循環，致至發酵液中，如此循環，致至發酵液中碳源耗盡，完成發酵。碳源耗盡，完成發酵。 氨基酸發酵常用此法氨基酸發酵常用此法。這種方法既可以達到穩定。這種方法既可以達到穩定pH值的目的，又可以不斷補充營養物質，特別是能產值的目的，又可以不斷補充營養物質，特別是能產生阻遏作用的物質。生阻遏作用的物質。 少量多次補加還可解除對產物合成的阻遏作用少量多次補加還可解除對產物合成的阻遏

51、作用，提，提高產物產量。即采用補料的方法，可以同時實現高產物產量。即采用補料的方法，可以同時實現補充補充營養、延長發酵周期、調節營養、延長發酵周期、調節pH值和培養液的特性值和培養液的特性(如菌如菌濃等濃等)等幾個目的。等幾個目的。 在發酵過程中根據糖氮消耗需要進行補料。在補料與調在發酵過程中根據糖氮消耗需要進行補料。在補料與調pH沒有矛盾時沒有矛盾時采用補料調采用補料調pH，如，如 （1）調節補糖速率，調節空氣流量來調節）調節補糖速率，調節空氣流量來調節pH (2) 當當NH2-N低，低，pH低時補氨水；當低時補氨水；當NH2-N低，低，pH高時高時補補(NH4)2SO4 當補料與調當補料與

52、調pH發生矛盾時，加酸堿調發生矛盾時，加酸堿調pH 應急措施：應急措施：改變攪拌改變攪拌轉速或通氣轉速或通氣量，以改變溶解氧濃度，控制有量，以改變溶解氧濃度，控制有機酸的積累量及其代謝速度；機酸的積累量及其代謝速度；改變溫度改變溫度，以控制微生物代謝速度；，以控制微生物代謝速度；改變罐壓及通氣量改變罐壓及通氣量，降低，降低COCO2 2的溶解量；的溶解量；改變加油或加糖量改變加油或加糖量等，調節有機酸的積累量；等，調節有機酸的積累量； 分別在分別在4 4種緩沖介質中，于種緩沖介質中，于pH 6pH 65050一一9 95050測定天冬酰胺酶酶活力測定天冬酰胺酶酶活力1 1 甘氨酸介質甘氨酸介質

53、pH 8.00pH 8.00時酶活力最高；時酶活力最高；2 2 硼酸在硼酸在pH 8pH 85050，酶反應最快，酶反應最快3 3 磷酸磷酸在在pH 850，酶反應最快，酶反應最快4 Tris4 Tris在在pH 850，酶反應最快，酶反應最快酶活酶活1 12 24 43 3不同調不同調pHpH方法的影響方法的影響天冬酰胺酶天冬酰胺酶n大多數發酵過程是好氧的，因此需要供氧。如果考慮大多數發酵過程是好氧的，因此需要供氧。如果考慮呼吸的化學計量，則葡萄糖的氧化可由下式表示：呼吸的化學計量，則葡萄糖的氧化可由下式表示： C6H 12O6 十十6O26H2O十十6CO2 n只有當這只有當這兩種反應物均

54、溶于水后，才對菌體有用兩種反應物均溶于水后，才對菌體有用。n氧在水中的溶解度比葡萄糖要小約氧在水中的溶解度比葡萄糖要小約6000倍左右倍左右(氧在水氧在水中的飽和度約為中的飽和度約為l0mg/L) 。許多發酵的生產能力受到許多發酵的生產能力受到氧利用限制，因此氧利用限制，因此氧成為影響發酵效率的重要因素。氧成為影響發酵效率的重要因素。三三 、氧對發酵的影響、氧對發酵的影響溶解氧的高低溶解氧的高低 供氧效率供氧效率 微生物細胞耗氧狀況微生物細胞耗氧狀況 在線監測發酵液中溶解氧的濃度，了在線監測發酵液中溶解氧的濃度，了解氧的解氧的供需規律及其對微生物生長和產供需規律及其對微生物生長和產物合成的影響

55、。物合成的影響。 在發酵罐內安裝在發酵罐內安裝溶氧電極溶氧電極測定測定 電極的要求電極的要求 耐高溫、高壓、長時間滅菌以及具有長耐高溫、高壓、長時間滅菌以及具有長期的穩定性，精度和準確度期的穩定性，精度和準確度3%左右左右菌體的代謝是受菌體的代謝是受發酵液中發酵液中溶氧濃度溶氧濃度的影響，依據總的影響，依據總需求來供氧是欠妥的。溶需求來供氧是欠妥的。溶氧濃度對比攝氧率氧濃度對比攝氧率( (Q QO2O2每每克干菌體每小時所消耗的克干菌體每小時所消耗的氧的毫摩爾數氧的毫摩爾數) )用米氏型曲用米氏型曲線表示。線表示。 Dissolved Oxygen ConcentrationQO2Ccriti

56、cal發酵過程的溶氧變化發酵過程的溶氧變化 發酵前期菌絲體大量繁殖，需氧量大于供氧，溶氧出現發酵前期菌絲體大量繁殖，需氧量大于供氧，溶氧出現一個低峰。一個低峰。 在生長階段，產物合成期，需氧量減少，溶氧穩定，但在生長階段，產物合成期，需氧量減少，溶氧穩定，但受補料、加油等條件大影響。受補料、加油等條件大影響。 補糖后，攝氧率就會增加，引起溶氧濃度的下降，經過補糖后，攝氧率就會增加，引起溶氧濃度的下降，經過一段時間以后又逐步回升并接近原來的溶解氧濃度。如一段時間以后又逐步回升并接近原來的溶解氧濃度。如繼續補糖，又會繼續下降，甚至引起生產受到限制。繼續補糖，又會繼續下降，甚至引起生產受到限制。 發

57、酵后期，由于菌體衰老，呼吸減弱，溶氧濃度上升，發酵后期，由于菌體衰老，呼吸減弱，溶氧濃度上升，一旦菌體自溶，溶氧濃度會明顯上升一旦菌體自溶，溶氧濃度會明顯上升發酵中溶氧異常下降的原因：發酵中溶氧異常下降的原因： 1 污染好氣性雜菌，大量溶氧被消耗掉污染好氣性雜菌，大量溶氧被消耗掉 2 菌體異常代謝菌體異常代謝 3 設備或者工藝控制發生故障，攪拌速度明顯下設備或者工藝控制發生故障，攪拌速度明顯下降、加消泡劑過多，引起溶氧下降。降、加消泡劑過多，引起溶氧下降。 發酵中溶氧異常上升的原因發酵中溶氧異常上升的原因 菌體異常代謝，污染烈性噬菌體，菌體破菌體異常代謝，污染烈性噬菌體，菌體破裂后完全失去呼吸

58、能力，溶氧就直接上升。裂后完全失去呼吸能力，溶氧就直接上升。 臨界氧濃度臨界氧濃度（C臨臨）：指不影響菌體呼吸所）：指不影響菌體呼吸所允許的最低氧濃度，或微生物對發酵液中溶允許的最低氧濃度，或微生物對發酵液中溶解氧濃度的最低要求。解氧濃度的最低要求。 可通過尾氣中氧氣含量的變化和通氣量共同可通過尾氣中氧氣含量的變化和通氣量共同測定，也可用測定，也可用溶氧電極測定溶氧電極測定 在發酵過程中加強通氣攪拌，使溶氧在發酵過程中加強通氣攪拌，使溶氧(DO)(DO)盡可能達到最大，停止通氣，繼續攪拌，盡可能達到最大，停止通氣，繼續攪拌，在罐頂部空間充氮，溶氧迅速下降，直線在罐頂部空間充氮，溶氧迅速下降，直線斜率絕對值開始減小時所處的溶氧值即為斜率絕對值開始減小時所處的溶氧值即為臨界氧濃度臨界氧濃度 發酵工業一般用空氣飽和度（發酵工業一般用空氣飽和度（% %）表示）表示DODO含含量的單位量的單位 某些微生物的臨界氧濃度某些微生物的臨界氧濃度微微 生生 物物 溫度（溫度（C）臨界氧濃度臨界氧濃度（mmol/L）固固