1、primer 6.0 引物設(shè)計教程首先，需要知道基因序列，如，我們要設(shè)計rat的 CK18 mRNA檢測的引物，我們先到 這個網(wǎng)站查找CK18 mRNA的基因序列，首先選擇Nucleotide 然后在搜索欄輸入基因序列號（如果不知道基因序列號則輸入 rat CK18）如圖然后點(diǎn)擊搜索，就會出現(xiàn)rat CK18 mRNA的基因序列基因序列號現(xiàn)在，往下拉就會看到基因序列將這個序列復(fù)制到primer 6.0中就可以進(jìn)行引物設(shè)計，我們先打開peimer 6.0破解版打開會出現(xiàn)這個對話框，關(guān)閉即可點(diǎn)擊新建將序列復(fù)制至這個對話框點(diǎn)擊 Add點(diǎn)擊這個圖標(biāo)出現(xiàn)下面對話框，這里可以選擇引物在序列哪些地方設(shè)計引物

2、，我一般不更改，也就是引物可以設(shè)計在整個序列，你也可查一下序列有幾個區(qū)，一般引物應(yīng)該跨兩個區(qū)。之后點(diǎn)擊 primer Parameters這里可以設(shè)置退火溫度、引物長度、產(chǎn)物長度等，我一般只是更改產(chǎn)物長度，我一般設(shè)為100到300bp，因為如果產(chǎn)物太大，在染料法中會影響擴(kuò)增效率，之后點(diǎn)擊 Search 之后出現(xiàn)下面對話框點(diǎn)擊OK 出現(xiàn)下面引物序列這個時候引物設(shè)計完成，我們需要對引物進(jìn)行驗證，我一般到NCBI（）上驗證，進(jìn)去后點(diǎn)擊最下面菜單中的BLAST點(diǎn)擊這個圖標(biāo)點(diǎn)擊這個圖標(biāo)之后點(diǎn)擊Primer-BLAST將前引物復(fù)制到圖中位置在這輸入前引物將后引物復(fù)制（注復(fù)制前引物用 Copy Sense

3、Primer，復(fù)制后引物用Copy Anti-sence Primer 點(diǎn)擊右鍵即出現(xiàn)復(fù)制菜單）后引物放到下圖位置在這輸入后引物之后將圖中位置的homo sapiens 刪除后輸入rat出現(xiàn)上圖對話框時選擇Rattus（taxid：10114）之后點(diǎn)擊Get Primers點(diǎn)這里這時會出現(xiàn)下圖情況，因為服務(wù)器在國外，請耐心等待之后出現(xiàn)他能擴(kuò)增很多大鼠基因，如CK18 產(chǎn)物為126bp，Ahsg 產(chǎn)物795bp，但是除了CK18 其他基因擴(kuò)增是產(chǎn)物較大，而且有點(diǎn)突變，所以在PCR反應(yīng)時這些東西是擴(kuò)增不出來的，也就是說這個引物的特異性不錯，在擴(kuò)增時只會擴(kuò)增出我們需要的CK18這個基因，所以這個引物我們就可以訂出去，找公司合成。有的時候這樣的引物也不一定就可以用，所以當(dāng)我們收到合成好的引物后，可以做一下預(yù)實(shí)驗，看這個引物是否真的可以用，在需要引物時我們也可以到文獻(xiàn)中查找，一般發(fā)表在全球著名雜志中的外文文獻(xiàn)里的引物都是可以用