1、蛋白質復性方法及其留意事項蛋白前期預備（1）查閱目標蛋白相關文獻，了解其等電點，標簽等留意點。（2）假如目標蛋白易降解，可在純化時加1-2mMDTT，全程低溫，準時處理。（3）透析Buffer的選擇可參考文獻。蛋白復性包涵體：在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內，或被膜包裹或形成無膜暴露結構，這種水不溶性的結構稱為包涵體（Inclusion Bodies，IB）。在E.coli中累積的重組蛋白會快速地以包涵體形式被沉淀出來，這些包涵體蛋白是丟失生物活性的不行溶的錯誤折疊蛋白的聚集體。 包涵體的處理一般包括這么幾步：包涵體的洗滌、溶解、純化及復性。假如過表

2、達蛋白在包涵體中，那么通常有兩個選擇可以考慮：（1）退一步，優化表達條件；（2）接受包涵體并實行策略來將蛋白溶解以及復性。這里主要考慮其次種方案。包涵體的洗滌  裂開細胞都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致自然物質量的削減，加入蛋白酶抑制劑等，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質的提取。 洗滌Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP

3、。 超聲時用40-60ml裂解液,由于我們的超聲儀很適合用100ml小燒杯,裝40-60ml裂解液,這樣能讓超聲頭離液面不高不低,不會灑出來.菌多就延長超聲時間（全程冰?。?#160; 包涵體的溶解 1、對于尿素和鹽酸胍的選擇： 尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑，易經透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽，對重組蛋白質的氨基進行共價修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質復性后除去不會造成大量蛋白質沉淀以及溶解的包涵體可選

4、用多種色譜法純化等優點，故目前已被廣泛接受。 鹽酸胍溶解力量達95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產生沉淀、復性后除去可能造成大量蛋白質沉淀和對蛋白質離子交換色譜有干擾等缺點。   2、去垢劑：溫存去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。如強的陰離子去垢劑SDS，可以破壞蛋白內的疏水鍵，可以 增溶幾乎全部的蛋白。問題是由于SDS無法徹底的去除而不允許在制藥過程中使用。 包涵體的復性 1復性： 通過緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的完全伸展狀態恢復到正常的折疊結構，同時去除還原劑使二硫鍵正常形成。2復性的效率： 復性是

5、一個格外簡單的過程，蛋白質的復性效率在20%左右。影響復性效率的因素有蛋白質的復性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。4、復性中常接受的方法有： 稀釋復性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易把握。 透析復性：好處是不增加體積，通過漸漸降低外透液濃度來把握變性劑去除速度，缺點是易形成沉淀，且不適合大規模操作，無法應用到生產規模。 超濾復性：在生產中較多的使用，規模較大，易于對透析速度進行把握，缺點是不適合樣品量較少的狀況，且有些蛋白可能在超濾過程中不行逆的變性。 柱上復性：是最近爭辯較多并成

6、功的在生產中應用的一種復性方法，常用于復性的層析方法有SEC、HIC等。 復性方法優點缺點透析簡潔慢，使用大量緩沖液稀釋簡潔慢蛋白稀釋到很低濃度(1050 g/ml)分子篩層析（柱上）在一步操作中直接進行自動化復性并純化樣品體積受限離子交換層析（柱上）快速并且簡潔直接進行自動化應當避開使用與離子交換自相反電荷的添加劑復性的具體方法還要依據前期試驗及篩選來確定！ 包涵體的復性還要留意以下幾點： 1.首先要獲得較高純度的包涵體。 2.包涵體溶解要徹底，一般應使溶解液體量較大，不要怕蛋白被稀釋，要有助溶措施。 3.復性前后均要離心 4.復性不能太快. 5.純化的最佳條件要摸索和結合相關文獻。 6.變

7、性蛋白的濃度 濃度不要太高，一般0.4-0.5mg/ml 左右較適宜，若濃度高了，可稀釋至適宜濃度。有些蛋白可能更低，此時需要結合文獻和實踐，確定最佳濃度。要結合透析前后的濃度，假如透析液加入甘油，這需要結合濃縮比（10%甘油可濃縮20%左右）。 復性Buffer的選擇包涵體復性液配方 對于包涵體復性，一般在尿素濃度4M左右時復性過程開頭，到2M 左右時結束。對于鹽酸胍而言，可以從4M開頭，到1.5M 時復性過程已經結束。Tris系統和PBS系統都沒有明確的規定，這些需要你在試驗過程中不斷試驗，確定合適的緩沖系統；復性過程主要是留意以下幾個問題： （1）最適pH值范圍為8.0-9.0之間；(有

8、時需要過酸或過堿性) （2）溫度適宜選擇4； （3）復性過程蛋白濃度不宜過大；（小于0.5 mg/ml為宜） （4）復性時間一般為24-36小時； （5）低分子化合物 如L-Arg有助于增加復性中間產物的溶解度；脲、鹽酸胍等，在非變性濃度下是很有效的促進劑，都可阻擋蛋白聚集；Tris對蛋白質復性有促進作用。（6）氧化還原體系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG等。常用的氧化方法有：空氣氧化法：在堿性條件下通空氣，或者加入二價銅離子，能夠取得更好的效果，缺點是不易把握氧化還原電勢。 氧化還原電對（redox）：常接受GSSG/GSH（1:5-1:10），通過調整兩者的比例來把握較精確的氧化還原

9、電勢，也可以在添加了還原劑如DTT，如：5 mM GSSG/2 mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。 （7）復性過程的添加劑： 1、共溶劑：如PEG6000-20000，據說可以可逆的修飾折疊中間體的疏水集團，此外由于阻擋了蛋白質分子間的相互接觸的機會，也可能對復性效率的提高起作用。一般的使用濃度在0.1%左右，具體條件可依據試驗條件確定。 2、0.4-0.6 M L-Arg：促進蛋白溶解，（成功的應用于很多蛋白如t-PA的復性中，也可以抑制二聚體的形成。） 3、甘油等：增加黏度，削減分子碰撞機會，一般使用濃度在5%-30%。 4、肯定的鹽濃度，可能是為了降低某些帶電集團間的斥力，

10、有利于蛋白質的折疊。 5、幫助因子：添加蛋白質活性狀態必需的幫助因子如輔酶輔基等或蛋白配體等（如分子伴侶等）很多時候對蛋白質正確的折疊是有利的。6、特殊離子：如CaCl2，MgCl2等特殊的金屬離子，可參與蛋白質的正確折疊，促進活性的作用。（此時勿加入EDTA。）例如復性Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM CaCl2，0.4 M L-Arg, 2mM GSH/0.4mM GSSG,10%甘油。透析buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM CaCl2，2mM DTT, 10%甘油。復性中蛋白析出！ 消滅蛋白析出，確定是條件變化太猛烈。復性應當

11、實行復性液濃度和pH值漸漸變化的方法，例如依據包涵體的溶液成分，每隔1個pH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時必需濃度極低，條件溫存，使蛋白質能夠正確折疊。（1） 蛋白析出最大的可能性：蛋白濃度太高，建議稀釋以后再復性；（2）透析的鹽濃度（比如urea）要平緩降低：8M-6M-2M-PBS； (3）若加變性劑（尿素可加到2M，鹽酸胍可加到1-1.5M）；（4）另外可將甘油濃度增加（范圍可在30%），且在復性樣品中也可加適量甘油； （5）假如還不行，可以換新的復性緩沖液 ；（6）純度不夠！消滅純化的目標蛋白純度不夠時，可以先過分子篩再復性； 帶有二硫鍵蛋白的復性！假如蛋白中存在兩個以上的半胱氨酸，馬上形成正確的二硫鍵是不行能的。隨著二硫鍵的數目增加（分子間與分子內的），可能的組合數目也在猛烈上升（3個二硫鍵就是15種可能組合，4個對應105，5個對應945等等）。假如二硫鍵是正