1、大腸桿菌基因組DNA的提取一、傳統法提取大腸桿菌基因組DNA。1、試驗原理提取DNA的一般過程是將分散好的組織細胞在含十二烷基硫酸鈉（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分別蛋白質，得到的DNA溶液經乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。SDS的作用機理是由于其能結合蛋白，中和蛋白的電性，使蛋白質的非共價鍵受到破壞，失去二級結構，從而變形失活，蛋白酶K或鏈霉蛋白酶E均為光譜蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在的狀況下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應體系中，SDS可通過失活蛋白破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白和DNA分別；而蛋白酶K可將蛋白

2、質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分別出來。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白質，最終用無水乙醇沉淀DNA。為獲得高純度DNA，操作過程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，當降低溶液鹽濃度到肯定的程度（0.3 mol/L NaCl）時，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB-核酸的復合物與蛋白，多糖物質分開。最終通過乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去。2、試驗試劑與儀器1）試驗材料：大腸桿菌2）試驗試劑：LB液體培育基，TE溶液，10%SDS，蛋

3、白酶K，5mol/L NaCl，CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/異戊醇，異丙醇，70%乙醇3）試驗儀器：恒溫搖床、低溫離心機、微量移液器、水浴鍋3、溶液配制1）LB液體培育基：細菌培育用膠化蛋白胨10 g/L，細菌培育用酵母提取物5 g/L，NaCl 10g/L，去離子水。 (攪拌溶解后，用5mol/LNaOH調pH至7.0.用去離子水定容100ml，用20/50ml搖瓶分裝5瓶，包扎好，在121，1.034105 pa高壓下蒸汽滅菌20min.)2）TE緩沖液：1M Tris 溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加熱溶解）1M tris-HCl pH8.0 溶液（取

4、1M Tris 溶液160ml用分析純鹽酸調至Ph=8.0（需濃鹽酸約8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高壓滅菌備用）TE緩沖液（10 mM Tris-HCl 1Mm EDTA pH=8.0，1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml0.5M EDTA PH =8.0 1ml向燒杯中加入約400mldd H2O均勻混合;將溶液定容到500ml后，高溫高壓滅菌，室溫保存）3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml無菌雙蒸水，-20備用）4）CTAB/NaCl溶液：（5% w/v，5gCTAB溶于100ml 0.5M NaCl溶液中，需加熱到65使之溶解，然后室溫保存）

5、4、試驗方法步驟1、將大腸桿菌接種到滅菌好的LB培育基中，一級培育過夜，以10%的接種量進行二級培育，培育至對數期（4-6h）。2、取菌液1.5ml置于離心管中，以5000rpm冷凍離心1min，棄上清液3、加190 ul TE懸浮沉淀，并加10 ul 10%SDS,搖勻直至溶液變粘稠4、加入1ul蛋白酶K（20mg/ml），混勻，37保溫1小時。5、加30ul 5 mol/L NaCl,混勻。6、加30ul CTAB/NaCl溶液，混勻，65保溫20min7、加入300ul酚/氯仿/異戊醇抽提（25：24:1），5000rmp離心10min8、取上清液，加入300ul氯仿/異戊醇（24:1）

6、抽提，5000rmp離心10min9、取上清液，加入300ul的異丙醇，顛倒混勻，室溫下靜止10min，沉淀DNA，5000rmp離心10min10、加500ul 70%乙醇洗沉淀，5000rmp離心10min11、棄上清液，待酒精揮發盡后加30ulTE溶解12、溶解于20ul TE中，-20保存。二、試劑盒法提取大腸桿菌基因組DNA。細菌基因組DNA提取試劑盒：1、TGuide細菌基因組DNA提取試劑盒DP302-02 50次 420元2、TaKaRa細菌基因組DNA小量純化試劑盒TaKaRa DV810A 50 650元3、Biomiga 細菌基因組DNA提取試劑盒GD2411-01 Ba

7、cterial gDNA kit 50次 423元GD2411-02 Bacterial gDNA kit 250次 1798元4、Biospin 細菌基因組 DNA 提取試劑盒BSC12S1 50次 400元 BSC12M1 100次 750元5、OMEGA細菌基因組DNA提取試劑盒D3350-00 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 5 210元D3350-01 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 50 980 元D3350-02 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 200 3350元熒光定量PCR試驗（標準曲線法）定量試驗

8、是一種實時試驗，用于在聚合酶鏈反應 (PCR) 的每個擴增循環期間測定靶核苷酸序列 （靶）數量。其中靶可以是 DNA、 cDNA 或 RNA。【試驗原理】在實時定量試驗中，反應是在 PCR 產物的擴增達到固定熒光水平常的循環期間時間點來描述的，而不是在固定循環次數后累積的 PCR 產物最終數量來描述。擴增曲線以圖形形式顯示在執行的循環次數中檢測到的熒光。 在 PCR 的最初幾次循環中，熒光信號沒有明顯變化。該預定義的 PCR 循環范圍稱為基線。首先，軟件通過計算歸一化報告熒光信號強度 （與基線循環相對應的 Rn 值）的數學趨勢，生成一個基線簡化擴增曲線。然后，算法將搜尋擴增曲線上基線校準后歸一

9、化報告熒光信號強度 （ delta Rn Rn 值）與閾值交叉的點。 Rn 值與閾值交叉的分數循環定義為 CT。一、試驗設計使用StepOne軟件中的Design Wizard（設計導向）創建新試驗1、定義試驗屬性在 Experiment Properties （試驗屬性）屏幕上，輸入試驗的標識信息，然后選擇要設計的試驗類型。1）Experiment Name （試驗名稱）。2）Barcode （條碼），然后輸入您的 PCR 反應板上的條碼。（可不填）3）User Name （用戶名）。4）Comments （注釋）。（可不填）5）選擇 Quantitation （定量）試驗類型6）Next

10、（下一步）2、定義方法和材料在 Methods & Materials （方法和材料）屏幕上，選擇用于試驗的定量方法、試劑、升降溫速度和 PCR 模板。1）將 Standard Curve （標準曲線）選為定量方法。將 Standard Curve （標準曲線）選為定量方法。 標準曲線試驗確定樣本中靶序列的確定量。 從已知量的稀釋序列中構建的標準曲線用于歸檔結果。 當設置反應板時，標準曲線方法需要靶、標準品和樣本。用于標準曲線試驗的 PCR 反應包括以下組分： 樣本 其中靶數量未知的樣本。 標準品 數量已知的樣本。 標準品稀釋序列 一組用于構建標準曲線的標準品稀釋液 （例如，1:2、1:4、

11、1:8、 1:16、 1:32） 。 重復數 含有相同組分和量的相同反應數。 陰性對比 含有水或緩沖液的樣本，不含模板；也稱為 “無模板對比(NTC)”。陰性對比應不會擴增。2）為試劑選擇 TaqMan Reagents （ TaqMan 試劑）（包括兩個引物一個探針） 。假如使用 TaqMan 試劑以檢測擴增并定量樣本中靶的數量，則選擇TaqMan Reagents （ TaqMan 試劑） 。 TaqMan 試劑包括兩個引物和一個TaqMan 探針。 引物設計用于擴增靶。 TaqMan 探針設計用于雜交靶，并在擴增靶時產生熒光信號。切記！ Applied Biosystems 不建議將 T

12、AMRATM 染料隨 StepOneTM 系統用作熒光報告基團或淬火基團。假如使用 SYBR Green 試劑以檢測擴增并定量樣本中靶的數量，則選擇 SYBR Green Reagents （ SYBR Green 試劑）。 SYBR Green 試劑包括兩個引物和 SYBR Green 染料。 引物設計用于擴增靶。 SYBR Green 染料可在結合到雙鏈 DNA 時產生熒光信號。 SYBR Green 染料通常是添加到反應的SYBR Green 母液的一部分。 假如使用 SYBR Green 染料：選擇 Include Melt Curve （包括解鏈曲線）以執行擴增靶的解鏈曲線分析。將

13、Standard （標準）選為升降溫速度。 Applied Biosystems 不供應 SYBRGreen 試劑的 Fast 母液。3）為升降溫速度選擇 Standard (2 hours to complete a run) （標準 （約兩小時完成運行） 。 假如為 PCR 反應使用 Fast 試劑，則選擇 Fast (40 Minutes toComplete a Run) （快速 （約 40 分鐘完成運行） ）。 假如為 PCR 反應使用標準試劑 （包括 SYBR Green 試劑和 TaqMan 試劑） ，則選擇 Standard (2 Hours to Complete a Run

14、) （標準 （約 2 小時完成運行） 。4）為模板類型選擇 gDNA (genomic DNA) （ gDNA （基因組 DNA） ） 。5）Next （下一步） 。3、設置靶在 Targets （靶）屏幕上，輸入您想在 PCR 反應板中定量的靶數量，然后為每個靶設置檢測。1）單擊 How many targets do you want to quantify in the reaction plate? （您想在反應板中定量多少靶？）字段，然后輸入 1（依據需要填）。留意： 靶檢測表中的行數將以您輸入的數字更新。2）選擇 Set Up Standards （設置標準品）復選框，以為靶檢測設

15、置標準品。建議反應板中的每個靶檢測設置一條標準曲線。留意： Set Up Standards （設置標準品）復選框默認狀況下已選取。3）設置靶 1 檢測：a. 單擊 Enter Target Name （輸入靶名稱）單元格，然后輸入 RNase P（示例）。b. 從 Reporter （報告基團）下拉菜單中，選擇 FAM （默認） 。 假如要將 FAMTM 染料加在您用于檢測靶的 TaqMan 探針的 5 端，則選擇FAM。 假如要將 JOETM 染料加在您用于檢測靶的 TaqMan 探針的 5 端，則選擇JOE。 假如要將 VIC 染料加在您用于檢測靶的 TaqMan 探針的 5 端，則選擇

16、VIC。 假如您正使用 SYBR Green 染料以檢測雙鏈 DNA，則選擇 SYBR。c. 從 Quencher （淬火基團）下拉菜單中，選擇 NFQ-MGB （默認） 。 假如要將非熒光淬火基團小溝結合物加在您正用于檢測靶的 TaqMan 探針的 3 端，則選擇 NFQ-MGB。 假如您正使用 SYBR Green 染料，則選擇 None （無） 。4）Next （下一步） 。4、設置標準品在 Standards （標準品）屏幕上，為全部標準曲線輸入反應板中的點數和重復數。對于每條標準曲線，輸入起始量并選擇序列倍數。1）單擊 How many points do you need for

17、each standard curve? （每條標準曲線您需要多少個點？）字段，然后輸入 5。建議每條標準曲線應至少有五個稀釋點。2）單擊 How many replicates do you need for each point? （每個點您需要多少次重復反應？）字段，然后輸入 3。建議每個點三次重復反應。3）為 RNase P （示例）檢測定義標準品數量范圍：a. 單擊 Enter Starting Quantity （輸入起始量）字段，然后輸入 10000。由于標準品數量的范圍會影響擴增效率計算，因此應認真為您的檢測考慮標準品數量的適當范圍： 為了更精確地測量擴增效率，請使用大范圍的標

18、準品數量，擴大到 5 個至6 個對數級之間。 假如您為標準品指定大范圍的數量，您需使用 PCR 產物或高度濃縮的模板，如 cDNA 克隆。 假如您的 cDNA 模板數量有限且/或靶是低拷貝數轉錄物，或已知在給定范圍之內，則可能需要小范圍的標準品數量。b. 從 Select Serial Factor （選擇序列倍數）下列菜單中，選擇 1:2。序列倍數用于計算標準曲線全部點中的數量。 假如您的起始數量是最高數量，則選擇如 1:2、 1:3 之類的稀釋倍數。 假如您的起始數量是最低數量，則選擇如 2X、 3X 之類的濃縮倍數。4）查看 Standard Curve Preview （標準品曲線預覽

19、）窗格。 標準曲線應包含如下點：10000、 5000、 2500、 1250 和 625。5）Next （下一步） 。5、設置樣本在 Samples （樣本）屏幕上，輸入反應板中要包括的樣本、重復數和陰性對比數，然后選擇樣本/靶反應以進行設置。1）單擊 How many samples do you want to test in the reaction plate? （您想在反應板中檢測多少樣本？）字段，然后輸入 2。（依據需要填）2）單擊 How many replicates do you need? （您需要多少次重復反應？）字段，然后輸入 3。建議對每個樣本反應重復三次反應。3）

20、單擊 How many negative controls do you need for each target assay? （每個靶檢測您需要多少陰性對比？） ，然后輸入 3。建議對每個靶檢測進行三次陰性對比反應。4）4. 設置樣本 1：a. 單擊 Enter Sample Name （輸入樣本名）字段，然后輸入 pop1 （用于重復組 1） 。b. 保留 Color （顏色）字段中的默認設置。5）設置樣本 2：a. 單擊 Enter Sample Name （輸入樣本名）字段，然后輸入 pop2 （用于重復組 2） 。b. 保留 Color （顏色）字段中的默認設置。6）選擇 All

21、Sample/Target Reactions （全部樣本/靶反應）以檢測全部樣本中的全部靶。 選擇 All Sample/Target Reactions （全部樣本/靶反應）以檢測全部樣本中的全部靶。 選擇 Specify Sample/Target Reactions （指定樣本/靶反應）以指定每個樣本中要檢測的靶。7）在 Well Count （反應孔數）窗格中，確認存在： 6 個未知反應孔U 15 個標準品反應孔S 3 個陰性對比反應孔N 24 個空反應孔8）在 View Plate Layout （查看檢測板布局）選項卡上：a. 從 Arrange Plate by （反應板布局方

22、式）下拉菜單中，選擇 Rows （按行）（默認） 。b. 從 Place Negative Controls （放置陰性對比）下拉菜單中，選擇 Upper Left（左上角） （默認） 。9）Next （下一步） 。6、設置運行方式在 Run Method （運行方法）屏幕上，查看默認運行方法的反應體積和溫度變化過程設置。 若需要，您可調整默認運行方法或用 Run Method （運行方法）庫中的某種方法進行替換。1）單擊選擇 Graphical View （圖形視圖）選項卡 （默認）或 Tabular View （表格視圖）選項卡。2）單擊 Reaction Volume Per Well

23、（每個反應孔的反應體積）字段，然后輸入 25 L。為 “反應體積/反應孔”輸入介于 10 至 30 的值。 StepOne 系統支持 10 至30 L 之間的反應體積。3）確保溫度變化過程設置顯示保持和循環階段。 確保溫度變化過程設置適合試劑。 假如正執行一步法 RT-PCR 擴增，則包括一個反轉錄步驟。假照試驗需要一個不同的溫度變化過程設置，調整溫度變化過程設置或用Run Method （運行方法）庫中的某個溫度變化過程設置進行替換。 Run Method（運行方法）庫包括在 StepOne 軟件中。4）Next （下一步） 。7、查看反應設置在 Reaction Setup （反應設置）屏

24、幕上，選擇檢測類型 （假如使用 TaqMan 試劑），然后查看為預備 PCR 反應、標準稀釋序列和樣本稀釋而計算的劑量。 若需要，您可調整反應體積、額外反應體積、組分濃度、標準品濃度和/或稀釋后樣本濃度。切記！ 對反應板中的每個靶檢測執行這些步驟。完成 Reaction Mix Calculations （反應預混液計算）選項卡1）選擇 Reaction Mix Calculations （反應預混液計算）選項卡 （默認）。 2）從 Select Target （選擇靶）窗格中，選擇 RNase P。3）從 Assay Type （檢測類型）下拉菜單中，選擇 Inventoried/Made

25、to Order（庫存/定制） 。假如正使用 TaqMan 試劑，選擇所使用的檢測類型： 假如正使用 Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays （庫存/定制）或 Applied Biosystems Custom TaqMan Gene Expression Assays，則選擇 Inventoried/Made to Order （庫存/定制）。 假如正使用 Primer Express 軟件設計檢測，則選擇 Custom（定制）。4）確認 Reaction Volume Per Well （每個反應孔的反應體積）字段中顯示 25 L。

26、為 “反應體積/反應孔”輸入介于 10 至 30 的值。 StepOne 系統支持 10 至30 L 之間的反應體積。5）確認 Excess Reaction Volume （額外反應體積）字段中顯示 10%。包括額外反應體積以彌補移液過程中的損失。建議至少預備 10% 的額外反應體積。6）在 Reactions for RNase P （ RNase P 反應）窗格中：a. 確認 Master Mix Concentration （母液濃度）字段中顯示 2.0X。b. 確認 Assay Mix Concentration （檢測預混液濃度）字段中顯示 20.0X。c. 查看 PCR 反應的組

27、分和計算的劑量。7）在 Standard Dilution Series for RNase P （ RNase P 的標準品稀釋序列）窗格中：a. 單擊 Standard Concentration in Stock （儲液中標準品的濃度）字段，然后輸入 20000。b. 單擊 units （單位）字段，然后輸入 copies per L。c. 查看為預備標準品稀釋序列計算的劑量。完成 Sample Dilution Calculations （樣本稀釋計算）選項卡1）選擇 Sample Dilution Calculations （樣本稀釋計算）選項卡。2）單擊 Diluted Sampl

28、e Concentration (10X for Reaction Mix) （稀釋后樣本濃度）（對于反應預混液為 10X） ，然后輸入 6.6。3）從單位下拉菜單中，選擇 ng/L （默認） 。4）查看為樣本稀釋計算的劑量。8、試驗材料訂購在 Materials List （材料列表）屏幕上，查看建議用于預備 PCR 反應板的材料列表。或者，您可從 Applied Biosystems Store （ Applied Biosystems 產品倉庫）訂購所建議的材料。 創建購物籃，向購物列表中添加項目，然后登錄以提交您的訂單。 您必需具有不受限制的網絡連接才能訪問 Applied Biosy

29、stems Store （ AppliedBiosystems 產品倉庫） 。1）在 Applied Biosystems Store （ Applied Biosystems 產品倉庫）網站上查找靶檢測套件：a. 確保您的計算機已連接到因特網。b. 單擊 Enter Gene Name（輸入基因名）字段，輸入 RNase P，然后單擊 FindAssay （查找檢測套件） 。c. 在 Find Assay Results （發覺檢測套件結果）對話框中，選擇您的檢測套件。d. 單擊 Apply Assay Selection （應用檢測套件選擇） 。2）完成 Experiment Materi

30、als List （試驗材料列表）窗格：a. 從 Display （顯示）下拉菜單中，選擇 All Items （全部項） （默認） ，然后查看建議的材料。 若需要，使用右側的滾動條查看全部項。3）用于進行定量試驗的Inventoried/Made to Order 檢測設計用于協作以下 TaqMan 母液使用：TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2), No AmpErase UNG，250 次反應，編號4352042TaqMan 2 Universal PCR Master Mix， 200 次反應，編號4304437TaqMan 2 Univers

31、al PCR Master Mix， 2000 次反應，編號432670810 包裝 TaqMan 2 Universal PCR Master Mix，編號4305719TaqMan 2 Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG，200 次反應，編號4324018TaqMan 2 Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG，2000 次反應，編號432661410 包裝 TaqMan 2 Universal PCR Master Mix， No AmpEraseUNG，編號43240204）靶DNA 或 cDN

32、A有幾種 TaqMan 和 SYBR Green 試劑可用于定量試驗。a.TaqMan 試劑 TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2), NoAmpErase UNG， 250 次反應4352042TaqMan 2 Universal PCR Master Mix， 200 次反應，編號4304437TaqMan 2 Universal PCR Master Mix， 2000 次反應，編號432670810 包裝 TaqMan 2 Universal PCR Master Mix ，編號4305719TaqMan 2 Universal PCR Mas

33、ter Mix, No，AmpErase UNG， 200 次反應，編號4324018TaqMan 2 Universal PCR Master Mix, NoAmpErase UNG， 2000 次反應，編號432661410 包裝 TaqMan 2 Universal PCR Master Mix，No AmpErase UNG，編號4324020TaqMan PCR Core Reagents Kit， 200 次反應，編號N808-0228b.SYBR Green 試劑Power SYBR Green PCR Master Mix (1 mL)，40 次反應，編號4368577Powe

34、r SYBR Green PCR Master Mix (5-mL)，200 次反應，編號4367659Power SYBR Green PCR Master Mix(10 5-mL)， 2000 次反應，編號4368708Power SYBR Green PCR Master Mix (50 mL)，2000 次反應，編號4367660SYBR Green PCR Master Mix (1-mL)， 40 次反應，編號4344463SYBR Green PCR Master Mix (5-mL)， 200 次反應，編號4309155SYBR Green PCR Master Mix (50

35、-mL)， 2000 次反應，編號4334973SYBR Green PCR Core Reagents， 200 次反應，編號43048869、完成設計向導 要完成 Design Wizard （設計向導）工作流程，查看反應板布局，然后選擇一個退出選項。1）在 Review Plate for Experiment （查看試驗的反應板）窗口中，查看反應板布局。2）單擊 Save Experiment （保存試驗） 。3）在 Save Experiment （保存試驗）對話框中，單擊 Save （保存）以接受默認文件名和位置。 示例試驗被保存并關閉，并且您返回到 Home （主頁）屏幕。二、預

36、備反應工作如何為標準曲線試驗預備 PCR 反應。1、預備樣本稀釋在將樣本添加到最終反應預混液之前，執行樣本稀釋。接受 StepOneTM 軟件計算的劑量稀釋樣本。（樣本稀釋計算）依據儲液中的樣品濃度？ng/L，Stepone軟件計算出稀釋劑量。由于在 StepOne 軟件中，樣本量僅限于反應總量的 10%，因此需要進行樣本稀釋。 反應總量為每次反應 25 L，因此樣本量為每次反應 2.5 L。依據 “樣本稀釋計算”表稀釋樣本。1）所需材料 用于稀釋樣本的稀釋液（TE緩沖液或水）、樣本儲液 微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、試管振蕩器、離心機2）為每份擬稀釋樣本標記一個單獨的微量離心管：Popul

37、ation 1、 Population 2等3）將所需劑量的稀釋液添加到每個空反應管內。（14.2L）4）將所需劑量的樣本儲液添加到每個反應管內。（1L）5）振蕩每份稀釋的樣本 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應管。6）將稀釋后樣本置于冰上，直到預備好反應板。2、預備標準品稀釋序列 接受 StepOne 軟件計算的劑量預備標準品稀釋序列。（反應預混液計算）依據儲液中的標準品濃度？copies/L，Stepone軟件計算出劑量。1）所需材料用于稀釋標準品的稀釋液（TE緩沖液或水）、標準品儲液 微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、試管振蕩器、離心機2）為每份標準品標記一個單獨的微量離心管：Std. 1

38、、Std. 2、Std.3、Std. 4、Std. 5。3）將所需劑量的稀釋液添加到每個空反應管內：Std. 1（14.5L）、Std. 2（9.1L）、Std.3（9.1L）、Std. 4（9.1L）、Std. 5（9.1L）。4）在Std. 1 反應管中預備稀釋液 1：a. 振蕩儲液 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應管。b. 使用新的移液槍槍頭，將 3.6 L 儲液添加到Std. 1 反應管中。c. 振蕩 Std. 1 反應管 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應管。5） 在Std. 2 反應管中預備稀釋液 2：a. 使用新的移液槍槍頭，將 9.1 L 稀釋液 1 添加到Std. 2 反應

39、管中。b. 振蕩 Std. 2 反應管 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應管。6）在Std. 3 反應管中預備稀釋液 3：a. 使用新的移液槍槍頭，將 9.1 L 稀釋液 2 添加到Std. 3 反應管中。b. 振蕩 Std. 3 反應管 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應管。7）在Std. 4 反應管中預備稀釋液 4：a. 使用新的移液槍槍頭，將 9.1 L 稀釋液 3 添加到Std. 4 反應管中。b. 振蕩 Std. 4 反應管 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應管。8）在Std. 5 反應管中預備稀釋液 5：a. 使用新的移液槍槍頭，將 9.1 L 稀釋液 4 添加到Std. 5 反應

40、管中。b. 振蕩 Std. 5 反應管 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應管。9）將標準品置于冰上，直到預備好反應板。3、預備反應預混液使用 StepOne 軟件計算的組分和劑量預備反應預混液。（反應預混液計算）若試驗包括一個以上的靶檢測，則為每個靶檢測單獨預備反應預混液1）所需材料各反應預混液組分微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、離心機2）為反應預混液標記一個適當大小的反應管： Reaction Mix。3）將所需劑量的每種組分添加到反應管中：母液（2.0X）12.5L、檢測母液（20.0X）1.3L、水8.8L，總劑量22.6L，加上10%的超額量2.26L，共計24.86L，24次反應所需

41、劑量為596.6L留意：將檢測母液置于冰柜中避光儲存，直到預備使用。 過多暴露在光線下會影響熒光探針。計算中包括額外劑量，以便為試劑轉移期間發生的損失供應多余劑量。建議至少預備 10% 的超額量。4）用移液槍輕輕吸入并排出反應預混液使其混合，然后蓋上反應管蓋。5）短暫地離心反應管以除去氣泡。6）將反應預混液置于冰上，直到預備好反應板。留意：使用之前，請執行以下操作： 搖擺瓶子，徹底混合母液。 振蕩反應管以重新懸浮檢測母液，然后短暫地離心反應管。 將任何冷凍樣本置于冰上將其解凍。 解凍時，進行振蕩以重新懸浮樣本，然后短暫地離心反應管。4、預備反應板為每個重復組預備反應物，然后將它們轉移到反應板。

42、 接受 StepOne 軟件中顯示的反應板布局。 1）所需材料反應預混液Reaction Mix、標準品、樣本、水MicroAmpTM Fast Optical 48-Well Reaction Plate MicroAmpTM Optical 48-Well Adhesive Film微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、離心機2）預備靶陰性對比反應預混液：a. 向一個適當大小的反應管中，加入下面所列劑量的反應預混液和水。反應管反應預混液反應預混液劑量（L）水量（L）1Reaction mix74.68.3b. 用移液槍輕輕吸入并排出反應預混液使其混合，然后蓋上反應管蓋。c. 短暫地離心反應管以除

43、去氣泡。d. 向反應板的相應反應孔中分別加入 25 L 的陰性對比反應預混液。3）對于每個重復組，預備標準品反應預混液：a. 向適當大小的反應管中，加入下面所列劑量的反應預混液和標準品。反應管標準品反應預混液反應預混液反應預混液劑量(L)標準品標準品劑量(L)1Std 1Reaction mix74.6Std 18.32Std 2Reaction mix74.6Std 28.33Std 3Reaction mix74.6Std 38.34Std 4Reaction mix74.6Std 48.35Std 5Reaction mix74.6Std 58.3b. 用移液槍輕輕吸入并排出反應預混液使

44、其混合，然后蓋上各反應管蓋。c. 短暫地離心各反應管以除去氣泡。d. 向反應板的相應反應孔中加入 25 L 的標準品反應預混液。4）對于每個重復組，預備未知樣本的反應預混液：a. 向適當大小的反應管中，加入下面所列劑量的反應預混液和樣本。反應管未知樣本反應預混液反應預混液反應預混液劑量(L)樣本樣本劑量(L)1pop1Reaction mix74.6pop18.32Pop2Reaction mix74.6Pop28.3b. 用移液槍輕輕吸入并排出反應預混液使其混合，然后蓋上各反應管蓋。c. 短暫地離心各反應管以除去氣泡。d. 向反應板的相應反應孔中加入 25 L 的未知 （樣本）反應預混液。5

45、） 用孔板高透光度蓋膜密封反應板。6） 短暫地離心反應板以除去氣泡。7） 在您預備好運行試驗之前，將反應板置于陰暗處的冰上。留意：當您預備自己的標準曲線試驗時： 確保您使用適當的耗材。 確保 PCR 反應的支配與 StepOne 軟件中顯示的反應板布局全都。 您可以： 接受軟件自動生成的反應板布局。或 使用 Advanced Setup （高級設置）工作流程更改軟件中的反應板布局。三、運行試驗1、預備運行 打開試驗并將密封的 MicroAmpTM Fast Optical 48-Well Reaction Plate 裝載到StepOneTM 擴增儀以預備運行。 1） 打開設計的試驗a.打開S

46、tepOneb.從Home屏幕上，單擊Openc.在Open對話框中，導航到experiments文件夾（默認）d.找到創建的試驗設計，打開。2）裝載反應板（帶無粉手套）a.打開擴增儀抽屜b.將反應載體放置在樣本加熱塊中。反應板的方向取決于您所用耗材的類型： 若使用一個反應板，讓 A1 反應孔位于樣本加熱塊的左后角。 若使用反應管條帶，則將條帶置于樣本加熱塊中。c. 當心地關閉擴增儀抽屜。2、啟動運行若計算機已通過 StepOne 系統線纜直接連接到 StepOne 擴增儀，則執行下列步驟。（并置啟動）1）在 StepOne 軟件中，單擊 Temperature Plot （溫度曲線） 。2）

47、單擊 START RUN （啟動運行） 。3、監視運行 1）并置監視運行期間，定期查看 StepOne 軟件供應的全部三條曲線是否存在潛在問題。a.停止運行在 StepOne 軟件中，單擊 STOP RUN （停止運行）。對話框中包括： Stop Immediately （馬上停止）以馬上停止運行。 Stop after Current Cycle/Hold （當前循環 / 保持階段后停止）以在當前循環或保持階段之后停止運行。 Cancel （取消）以連續運行。b. 實時查看擴增數據Amplification Plot （擴增曲線）屏幕允許在 StepOne 擴增儀運行期間采集熒光數據時查看樣

48、本擴增。 若設置了某種方法以采集實時數據， Amplification Plot（擴增曲線）屏幕上會顯示在 View Plate Layout （查看反應板布局）選項卡中所選反應孔的數據。 擴增曲線將對比歸一化染料熒光 (Rn) 循環數。Amplification Plot （擴增曲線）屏幕對識別和檢查特別擴增格外有用。 特別擴增可能包括以下狀況： 陰性對比反應孔中熒光增加。 預期循環中不存在可檢測熒光 （在相同狀況下使用相同試劑從從前類似的試驗運行確定） 。c. 實時查看運行的溫度數據。運行期間， Temperature Plot （溫度曲線）屏幕上實時顯示樣本加熱塊、受熱護蓋門和樣本 （已

49、計算）的溫度。Temperature Plot （溫度曲線）屏幕對識別硬件故障格外有用。 當監視 TemperaturePlot （溫度曲線）屏幕時，觀看 Sample （樣本） 、 Heated Cover （受熱護蓋門）和 Sample Block （樣本加熱塊）曲線是否消滅特別狀況。 通常， Sample （樣本）和 Block （樣本加熱塊）曲線應大約相互對應。 兩條曲線存在顯著偏差可能表示存在問題。 Heated Cover （受熱護蓋門）曲線應保持方法中指定的常溫。 偏離全都溫度可能表示存在問題。d. 在 Run Method （運行方法）屏幕上查看運行進度開頭運行之后， Step

50、One 系統會在 Run Method （運行方法）屏幕上顯示運行進度。例如對于方法的溫度變化過程報告運行進度。更改運行方法 （添加循環、保持或解鏈曲線） 在導航窗格中，單擊 Run Method （運行方法） 。 在 Run Method （運行方法）屏幕上，執行以下任意操作 輸入要應用于 Cycling Stage （循環階段）的循環數。 若您想要將解鏈曲線階段添加到運行的末尾，則選擇Add Melt Curve Stage to End（將解鏈曲線階段添加到末尾） 。 若您想要將保持階段添加到運行的末尾，則選擇 AddHolding Stage to End （將保持階段添加到末尾）。

51、單擊 Send to Instrument （發送到擴增儀）e. 啟用/禁用通知設置。取或取消選取 Enable Notifications （啟用通知）復選框。2）遠程監視 若將您的 StepOne 擴增儀連接到網絡，您可使用 StepOne 軟件的遠程監視功能從網絡上的任何一臺計算機上實時查看運行進度。4、卸載反應板并傳輸數據當StepOne 擴增儀顯示 Run History （運行歷史）屏幕時，從 StepOne 擴增儀上卸載反應板，并將試驗數據傳輸到計算機以進行分析。當 StepOne 擴增儀完成一次運行時，系統會將運行詳情保存到運行歷史記錄，在擴增儀完成另一次運行之前，該運行歷史記

52、錄會保留在系統中。1）當 StepOne 擴增儀觸摸屏上顯示 Run Report （運行報告）屏幕時2）打開擴增儀抽屜。3）從樣本加熱塊中取出反應板。4） 當心地關閉擴增儀抽屜。切記！ 不要在運行后關閉 StepOne 擴增儀電源開關。 不使用時，擴增儀會自動進入休眠模式。并置數據的傳輸是自動傳輸。四、試驗分析StepOneTM 軟件使用標準曲線定量方法分析試驗數據。1、試驗數據打開StepOne，從Home屏幕上，單擊Open，在對話框中，導航到experiments文件夾，找到創建的試驗設計，打開試驗數據文件，單擊Analyze （分析） ， 軟件使用默認分析設置來分析數據。1）軟件元素

53、 a.Experiment Menu （試驗菜單）窗格 供應到以下軟件屏幕的鏈接： Setup （設置）屏幕 Run （運行）屏幕 Analysis （分析）屏幕：Amplification Plot （擴增曲線）Standard Curve （標準曲線）Multicomponent Plot （多組分曲線）Raw Data Plot （原始數據曲線）QC Summary （ QC 摘要）Multiple Plots View （多曲線視圖）b. Plot （曲線）窗格 為已打開的試驗顯示所選分析屏幕。c. View （視圖）選項卡 為已打開的試驗顯示反應板布局或反應孔表d. Experime

54、nt （試驗）選項卡 為每個打開的試驗顯示一個選項卡。2）如何選擇反應孔要在分析屏幕上顯示特定反應孔，在 View Plate Layout （查看反應板布局）選項卡上選擇相應的反應孔，操作如下：a. 要選擇某特定類型的反應孔，使用 Select Wells With （選擇反應孔類型）下拉菜單： 選擇 Sample （樣本） 、 Target （靶）或 Task （任務） ，然后選擇樣本、靶或任務名稱。b. 要選擇單個反應孔，在反應板布局中單擊該反應孔。c. 要選擇多個反應孔，按住 CTRL 鍵并單擊、或按住 Shift 鍵并單擊反應板布局中的某反應孔并拖移鼠標掩蓋所需的反應孔。d. 要選擇

55、全部 48個反應孔，單擊反應板布局的左上角。3）如何顯示多條曲線使用 Multiple Plots （多曲線）屏幕可同時顯示最多 4 條曲線。 要在 Multiple Plots（多曲線）屏幕內導航：a. 從 Experiment Menu （試驗菜單）窗格中，選擇 Analysis （分析）Multiple Plots View （多曲線視圖） 。b. 要顯示四條曲線，單擊 Show plots in a 2 2 matrix （以 22 窗格方式顯示曲線） 。c. 要在兩行中顯示兩條曲線，單擊 Show plots in two rows （以兩行顯示曲線） 。d. 要在兩列中顯示兩條曲線，單擊 Show plots in two columns （以兩列顯示曲線） 。e. 要顯示某特定曲線，從每條曲線顯示上方的下拉菜單中選擇該曲線。2、查看標準曲線Standard Curve （標準曲線）屏幕顯示指定為標準品的樣本的標準曲線。 StepOne軟件依據標準曲線計算未知靶的數量。在 Standard Curve （標準曲線）屏幕上檢查以下回歸系數值： Slope