1、干細胞治療糖尿病的研究近況關鍵詞糖尿病干細胞胰島 健康訊：魏雪峰 史小林100054首都醫科大學生殖醫學研究中心【摘要】本文對本世紀以來干細胞治療糖尿病的若干研究，包括胰島的體內發育、分化及其標志物，以及應用胰導管干細胞和胚胎干細胞進行定向誘導分化為胰島對糖尿 病進行細胞治療的實驗進行了綜述。隨著干細胞技術的不斷完善，人類最終能治 愈糖尿病。 全球糖尿病（diabetes mellitus , DM患者約億（我國也已 達4000萬），預計2025年將達3億1,已成為嚴重危害人類健康的重大疾病 之一，特別是久病引發的多系統損害，及最終的腎功能衰竭。DM發病機制復雜，涉及遺傳、環境、免疫調控和化學

2、因子。自1922年發現了胰島素至今，DM勺治療以藥物和注射胰島素為主，目前，學者們開始關注經胰島移植恢復患 者體內代謝紊亂的方法，但因組織來源匱缺，制約了胰島移植研究的開展，因此 尋找合適的胰島移植物的研究便成為了當務之急。隨著分子、細胞和發育生物學 技術的進展，增加了干細胞定向誘導分化成胰島的可能性但由于這一技術還處于 實驗室的實驗階段，而且方法也并不統一，因此有必要將近期研究進行匯總，希望能對在這方面進行研究的同僚們有所幫助。1胰島體內的形成、發育、分化與鑒定胚胎胰島分化 胚胎胰島的分化分4個階段：（1）胚胎910周為零散的多激素細胞階段；（2）胚胎1115周為未成熟的多激素階段；（3）胚

3、胎 1619周為單激素核心胰島階段；（4）胚胎30周后為多形胰島階段（Bocian, Histochem Cell Biol , 1999）。在胰島形成過程中，內胚層細胞形成許多小導管， 其末端膨大部分的細胞團發育為外分泌腺泡，與此同時，一些細胞群或細胞索不出現管腔，卷曲成團并與其他細胞索分離開，分散在腺泡之間，內含豐富的毛細 血管，最后發育成具有內分泌功能的胰島。胰島細胞分化的調節Ferber 2認為胚胎發育早期的信號源于脊索，后期的信號源于問質，經誘導的胰管上皮細 胞增殖分化形成胰島細胞，但至今為止其誘導因素并無統一認識。PDX1l種同源框轉錄因子（homeoboxtran scripti

4、on factor ）,即胰十二指腸同源異 型盒基因（pa-ncreatic and duodenal homeobox1 ）,編碼胰腺十二指腸同源框 蛋白 1,又稱 IPF-1、IDX-1、IUF-1。Lu （Lu, Endocrinology , 1996）認為 PDX1 是胰腺發育及胰島素基因轉錄表達的關鍵性轉錄因子，即決定于胰腺前體細胞向 B、A、D細胞的分化。Mckinnon 3 認為PDX1 寸于腸內胚層背胰芽和腹胰芽的生長、分化起重要作用。Dutta 4 認為早期胰腺表達的PDX-1對胰腺 上皮的形成和分化是必需的。Gu 5 認為所有胰腺細胞均來源于PDX1表達 的前體細胞，是最

5、先發現的胰腺發育決定基因，隨著胰腺發育 PDX1的表達逐漸 減弱，如缺失將導致胰腺無法形成。 Docherty 6 的研究證實小鼠PDX1基 因的純合子缺失、突變會導致胰腺無法形成。ngn3:ngn3即神經元素3(neurogenin3 ),是胰腺發育過程中短暫表達的蛋白， 可能是胰腺內分泌細胞系 的定向因子，且在成熟胰島中不存在。用PDX1啟動子促進轉基因小鼠中早期胰腺前體細胞中ngn3表達，會導致內分泌細胞數增加，外分泌細胞數減少。ngn3缺失的純合子小鼠中胰島細胞和 nestin+胰島前體細胞在發育各階段都缺失6。Lee 7認為ngn3基因與胰島分化有密切關系，因為 ngn3基因缺陷小鼠

6、不能表達胰島其他特異性轉錄因子，包括islet1 、PAX4 PAX6而缺乏PAX6 Neu- roD1、或的動物胰腺中表達ngn3,表明ngn3位于這些因子的上游， 且對啟動內分泌細胞分化必不可少，而分化后期關閉。Gasa 8通過表達的腺病毒感染胰腺導管細胞，建立了體外調控分化模型，發現 ngn3和NeuroD1活 化胰島分化的基因并不重疊，表明這兩個bHLH蛋白在胰島發育活動中具有不同的功能。Mellitzer 9 通過將cDNA雨入至U前體細胞的3'端非翻譯區，通 過EYFPt位NGN-3s達，發現內分泌前體細胞在缺乏問充質信號刺激情況下， 可在體外擴增，向內分泌細胞分化為其默認

7、的途徑。Leon 10用抗新霉素基因篩選用含前體基因質粒轉染鼠胚胎干細胞。培養后用篩選陽性細胞，發現這些細胞分泌胰島素，注入糖尿病鼠體內可使其血糖恢復正常。Fox a 2:內分泌的關鍵調控基因是forkhead基因Fox a 2。Guo 11 誘導內胚層分化的研 究發現，Fox a 2可被Foxd3激活，而被Oct4抑制。內胚層分化可通過抑制 Oct4 表達實現。Fox a 2基因關鍵參與肺、肝、胰發育。缺乏 Fox a 2基因，鼠不能產 生前、中腸內胚層(Ang, Cell , 1994)。HNF:HNF參與肝、腸、胰分化，缺失可致年輕人成熟期發病的糖尿病( Maturity onset d

8、iabetes melli - tus in young, MODYt HNF1a (TCF1) HNF賊 Fox a 2 及 Pdx-1 雙雜合缺失，導致 0 細胞功能缺陷，提示這些基因構成B細胞發育的基因絡(Yamagata, Nature ,1996) 0HNF6-/-鼠，腹胰發育缺陷及膽管發育異常，該基因需ngn3激活(Yamagatq Nature , 1996)。HNF6®激活 Fox a 2a 基因。Pax:Pax-4 和 Pax-6 同屬 Pax基因家族，其在胰腺內分泌細胞分化中起關鍵作用。Sosa (Sosa, Nature , 1997) 將Lac-Z插入到Pax

9、基因中作標記，發現Pax-4失活的新生鼠經免疫組織化學法 顯示缺少B細胞和6細胞，a細胞排列不規整。Pax-6缺失，a細胞缺如， 而胰島素和生長抑素分泌細胞卻可出現(St-Onge, Nature , 997)。由此推斷出 Pax-6是a細胞發育所必需，而非B、6細胞發育所必需。Chiang 12為分析單個胰腺細胞的轉錄模式，改進了基于PCR勺cDNAT增方法，即將單個胰腺細胞中的cDNAf含有95個常見胰腺細胞表達基因的 DNA5片進行雜交，芯 片上的基因包括轉錄因子，信號傳導分子以及對照基因。研究者觀察了胚胎小鼠 的胰腺分離出的單個細胞中的基因表達模式。在這個時期上皮細胞的形態均一， 而基

10、因表達模式分析可分為6個不同的亞型。I型只表達Pdx1,和，II型還表 達P48, III型還表達ngn3。因為Pdx1是最早表達的胰腺臟細胞標記蛋白，因 此研究者認為I型細胞是最好的胰腺干細胞候選者。II型細胞表達的P48是外 分泌胰腺細胞的標記，而和是內分泌細胞分化所必須的。 研究者根據這些研究結 果推測出一個胰腺細胞分化的模型， 每一個階段都對應相應的基因表達模式。此外，成體的胰島內分泌細胞4050d更新一次，其過程包括細胞凋亡和胰導管干 細胞增殖分化成新的胰島細胞。給予葡萄糖或高血糖素樣肽( Glucagon-like peptied , GLP1等促胰島因子48h后，胰島細胞數量可增

11、加一倍，說明機體胰 島在一定的條件與需求下進行著不斷更新與增殖的(Rosenberg, Cell Transplant , 1995)。胰島前體細胞的標記 Jindal (Jindal ,Transplan ration Proceeding , 1997)認為胰臟的外分泌細胞和內分泌細胞都 來源于具有導管細胞特征的未分化上皮細胞， 提示胰導管細胞可能是胰島的前體 細胞。Berger 13也發現胰腺中存在干細胞，認為胰腺干細胞是胚胎發生中沒有進行終末分化的胰腺細胞，具有自我更新和分裂能力。應用HE染色顯示該細胞是一種嗜堿性的單核細胞， 直徑約8mi呈圓形，細胞核為圓形或腎形， 較大，多含2個核

12、仁，染色質細膩而分散，胞質中不含顆粒，在形態上與小淋巴 細胞極為相似。近年來的研究揭示了胰島前體細胞的特異性標記物，這對胰島前體細胞的提取將有很大的幫助，目前較為公認的特異性標記物有以下幾種， 還有很多標記物有待于發現。酪氨酸羥化酶(tyroxine hydroxy - lase , TH): 在大鼠胰腺發生中表現出發育依賴性變化。第16天胚胎的導管細胞可見TH的表 達，但成熟的內分泌細胞中卻難以檢測到 TH,胎兒和剛出生幼兒的胰島細胞和 一些導管細胞TH呈陽性。成年大鼠胰腺中，TH僅在B細胞中表達。TH的這種 表達模式可用于鑒別內分泌前體細胞14 o葡萄糖轉運子2 (glucosetrans

13、porter , Glu T-2 ):可在大鼠胚胎的背胰芽和腹胰芽細胞中檢出，并在胰 芽發育中持續表達。孕17d,可檢測到細胞內表達 GluT-2和胰島素，以后，這 些細胞聚集形成胰島的B細胞群，而那些將轉變成腺泡細胞的細胞不再表達 GluT-2 15。細胞角蛋白20 (cytokeratin , CK20 :CK20是成熟胰腺導管細胞的一個特異標志。在胎鼠和幼鼠的導管細胞和內分泌細胞中表達，而在成年動物的導管細胞中有CK20表達則提示能定向分化成內外分泌細胞的胰腺未分化 細胞。誘導與導管連接的B細胞再生時，CK2她可在內分泌細胞中表達，顯示了未分化細胞分化為內分泌細胞的過程15 °

14、PDX-1:是B細胞成熟的標志。在哺乳動物中，這種同源域蛋白(homeodomain protein )是一種調節胰島素和 抑生長素表達的轉錄因子，也作為胰島素啟動因子-1 (IPF-1)、抑生長素活化因 子-1 (STF-1)和胰島十二指腸同源域蛋白(IDX-1)而存在。PDX-1也可在尚未 形成胎兒胰腺上皮細胞的所有胰島素分泌細胞中短暫表達(Bouwens, 1998)。 Kit:Kit在胰島素細胞系中表達，認為在信號轉導方面起作用。胎鼠和成鼠的胰 島中均可檢測到Kit ,經Kit基因表達的標記物gal證實，Kit在胰島素細胞中 特異表達，在其他內分泌細胞和外分泌細胞中不表達16 o ng

15、n3:ngn3陽性細胞散在于胎鼠胰腺的導管細胞，胚胎達高峰，成熟胰島細胞則轉為陰性17o由于胰島激素或成熟內分泌細胞不表達 ngn3,因此ngn3陽性細胞可作為胰腺內分泌細胞的前體細胞的標記物18。波形蛋白(vimentin ) :Schmied 19將長期培養的胰島細胞去分化得到未分化的導管樣上皮細胞，這些細胞可分化成胰腺內外分泌細胞，并限制性表達波形蛋白， 所以波形蛋白可作為胰島祖細胞的分子標志。但在此需說明的是，最近研究人員用小鼠做了詳細的追蹤研究，Matthews 20通過孕鼠及乳鼠喂養不同劑量的維生素A,發現缺乏維生素A, B細胞數量和體積明顯下降。ChenY 21 等發現SOCS-

16、K-/-)鼠感染后外分泌部細胞死亡高于內分泌部，可能 T干擾 素或月中瘤壞死因子促進內分泌部增生分化。Gesina 22通過糖皮質激素治療通過轉基因技術使激素受體缺陷的鼠，發現胰島素分泌細胞減少是外分泌細胞的 2倍，提示糖皮質激素有利于向外分泌分化。表達 Pax-1, Pax-6,處下游調控序 列，而paf-1-p48和Hes-1的mRNAf高。選擇非活化激素受體基因，在鼠0細 胞無明顯效果。而對于缺乏糖皮質激素受體，且表達 Pdx-1則B細胞群增長加 倍。胰島細胞數量和體積均增大而a細胞除外。提示糖皮質激素在胰腺B細胞分化中具有重要作用。2誘導干細胞分化為胰島的研究近況應用生物工程技術獲取胰

17、島素分泌細胞可從以下幾個途徑：(1)胰導管干細胞；(2)胚胎干 細胞；(3)利用基因工程技術。但將這些細胞誘導成胰島，僅是實驗室研究的初 級階段，并不是最終的成果。胰導管干細胞應用(1) Peck 23和Ramiya 24 分離、提取出了存在于胰腺導管中的胰島干細胞，經體外誘導 培養形成了胰島樣細胞。(2) Bonner 25發現角質化細胞生長因子(keratinocyte growth factor , KGF 和煙堿(nicotine )對導管干細胞分化 為胰島產生作用。(3) Ramiya 26從胰腺導管上皮細胞誘導分化得到“產生胰島的干細胞(islet producing stem c

18、ells , IPSCs) ”，這些 IPSCs 呈較 典型的胰島樣結構，并對高濃度葡萄糖有胰島素釋放應答反應，免疫組織化學染色證實有胰島素和胰高糖素的表達，RT-PCF®示這些細胞能表達許多胰島細胞的標志性基因，如胰島素基因，胰高糖素，生長抑素，GLUT級谷氨酸脫竣酶等。 將分化成熟的胰島細胞移植到 NODI體內，可完全逆轉其DM犬態25。由 IPSCs可誘導分化得到“產生胰島的細胞” (islet producing cells , IPCs), IPCs可分化成有組織結構的胰島細胞團，包括A、B、D細胞，表達一系列胰島標志，分泌胰島素并受葡萄糖誘導。將這些細胞移植到NODS體內

19、，可穩定其血 糖水平。胚胎干細胞應用(1) Lumelsky 27采用胚胎干細胞體外擴增后，篩選巢蛋白(nestin )陽性細胞，加入堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor , bFGF及B27和尼可酰胺，誘導成為能分泌胰島素 的胰島樣結構，將其植入糖尿病鼠體內，可使血糖降低且有血管形成，只是胰島 素分泌量較低。(2) Assady 28 從ES細胞誘導分化得到可分泌胰島素的細 胞，他們的方法是先將 ES細胞在有白血病抑制因子(leukaemia inbibitory factor , LIF)存在，但無滋養層的條件下培養，此時有 PDX1 (pa

20、ncreatic and duodenal homeobox1)表達，然后在無LIF的條件下促進ES細胞增殖分化為擬 胚體(EmbryoBodys, EBs),再在無血清環境下培養，提高nestin+細胞的比例， 加入bFGF繼續培養，得到類胰島組織細胞。這些細胞表達145pgN g的鼠胰島素 I和H,而且其表達受葡萄糖誘導，還表達胰島淀粉多肽(isleta myloid polypep tide ) , GLUT冷胰島細胞標志。但將這些細胞移植入糖尿病小鼠后， 未能使其血糖正常化。(3) Sori a 29通過轉基因技術將基因插件插入到小 鼠胚胎干細胞中，經潮霉素(hygromycin )篩

21、選，獲得含上述基因插件的干細胞， 擴增后用G418篩選，從而獲得純化的胰島。參考文獻 1 Dochertyand development of theislets of Langerhans:implica tions for thetreatment of diabetes Opinionin Pharmacol。 gy, 20XX, 1:641-650.2Ferber S , Halkin , Cohen H, et and duodenal homeobox gene1in duce expression if insulin genes in liver and ameliorates

22、 strepto otoc ininduced , 20XX, 6:568-572.3 Mckinnon CM Docherty duodenal homeobox1PDX1 a- majorregulator of 0 cell function and , 20XX, 44:1203-1214.4Dutta S , Gannon M Peers B , et :PBX plexe sare required for normal proliferation of pancreatic cells during , 20XX, 98 (3) :1065-1070.5Gu G, Dubausk

23、aite J , Melton D evidence for the pancreatic lin eage:NGN3+cells are islet progenitors and are distinct from duct pro - , 20XX 129:2447-2457.6 Docherty and development of the isletsof Langerhans:implica tions for the treatment of diabetes Opinionin Pharmacolo - gy, 20XX, 1:641-650.7 Lee JC, SmithSB

24、, WatadaH et ulationof the pancreaticpro en - docrine gene , 20XX 0:928936.8 Gasa R,Mrejen C , Leachman N et genes coordinate the pancreatic islet differentiation program in Natl Acad Sci U S A, 20XX, 7101(36) :13245-13250.9 Mellitzer G, Martin M, Sidhoum-Jenny M, et isletpro genitor cells in Neurog

25、enin3-YFP knock-add- on En _ docrinol , 20XX 5.10 Leon-Quinto T , Jones J , Skoudy A, et vitro directeddifferenti ation of mouse embryonic stem cells into insulin- producing - betologia , 20XX, 29.11 GuoY, Costa R, RamseyH,et embryonic stem cell transcription factors Oct-4and FoxD3interact to regula

26、te endodermal-sp ecific pro moter Natl Acad Sci USA , 20XX 99:3663-3667.12 Chiang MK Melton transcript analysis of pancreas ,20XX, 4 (3):383-3.13 pancreatic stem cells can reverse diabetesin ,20XX, 320 (3) :736.14 G nterK , differentiation and growth of theendocrine pan - Arch , 20XX 436:527-538.15

27、Peters J , Jurgensen A ,Kloppel , differentiation and growth of the endocrine Arch, 20XX,436:527-538.16 Rachdi L , Ghazi LE , Bernex F , et of the receptortyrosine kinase KIT in mature cells and in the pancreas in betes , 20XX 50 (9) :2021-2028.17 Schwitzgebel VM ScheelDW； Conners J R, et ofneuro ge

28、nin3reveals an islet cell precurs or population in the opment, 20XX, 127:3533-3542.18 Gradwohl G, Dierich A, LeMeurM, et requiredfor the development of the four endocrine cell lineages of the Natl Acad Sci USA, 20XX, 97:1607-1611.19 Schmied BM, Liu GZ , Matsuzaki H, etof islet cells in long , 20XX,

29、20 (4) :337-347.20 Matthews KA, RhotenWB Driscoll HK , et A deficiency impairs fetal islet development and causes subsequent glucose intolerance in adult Nutr, 20XX 134(8) :1958-1963.21 ChenY, ChongMM Darwiche R, et pancreatitis withex ocrine destruction and increased islet neogenesis in mice with suppressor of cytokine J Pathol , 20XX, 165 (3) :913-921.22 GesinaE, Tronche F, Herrera P, et the role of glucocorti _ coids on pancreas , 2