1、Q-PCR實驗流程一、實驗前準備，每天早上到實驗室后，先把超凈工作臺的紫外燈打開15-20分鐘。超凈臺前做實驗，需佩戴干凈的橡膠手套/ 一次性薄膜手套，RNA抽提需帶口罩。取EP管/槍頭時需用鑷子，不可以 用使用過的手套直接取用。取完 EP管/槍頭后，袋子及時封好。橡 膠手套須放入超凈臺照射紫外，實驗操作過程中不得帶出超凈臺，移 液器在一天工作結束后調至最大量程，并用75聽醇清潔移液器，槍頭盒及超凈臺面。實驗進行的過程中或觀看實驗時，沒有帶口罩不 要在超凈臺前講話。二、總RNA抽提1）細胞培養皿中細胞樣品用1*PBS洗兩次后，用1ml槍將PBS吸干凈，加入1ml Trizol（In vitro

2、ge n ）溶液，吹打混勻，并吸至 1.5ml RNasefree EP管中使細胞充分裂解，室溫靜置 5min；組織樣品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol（In vitroge n ）溶液，混勻，室溫放置5min使其充分裂解；（管蓋與管壁都需標記樣品名稱）2）加入200卩l氯仿，劇烈振蕩混勻30s，使水相和有機相充分接觸，室 溫靜置3-5min ；（離心時離心管按順序排放，離心完畢，離心管的順 序也按順序排好，與第一步的順序一致）3） 4 C下，14,000g離心15min,可見分為三層，RNA在上層水相，移至 另一個新的RNase free EP管；（用20-200ul的槍吸取上清，吸

3、上清時, 槍頭應沿著液面上層吸取上清，槍頭不可碰到、吸到中間層）4）沉淀RNA加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒 6-8次）（不 應用振蕩器混勻），室溫靜置 10min；5）4C下，14,000g離心10min,收集RNA沉淀（如離心后仍不見EP管底 部有沉淀，應將EP管放置在-80度冰箱過夜，繼續在4C下，14,000g離 心10min，收集RNA沉淀），去上清：6） 用75%乙醇洗滌兩次（12,000g離心5min）（加入乙醇后只需輕輕顛 倒EP管即可，不用振蕩器震蕩或槍頭吸打沉淀），超凈臺風干：沉淀不 能過干或過濕，過干則不易溶解，過濕則乙醇殘留。7）視沉淀量加入適量DEPC水 （至

4、少15ul ）溶解沉淀 三、去基因組使用RNase-free的DNase ? （Promega，按以下體系配置反應液,37C消化 30min，65C滅活 10min。RNA30卩lDNase ?20卩l10 x buffer10卩lH2O(RNase free)39.卩lRNasi n5卩l0.5總體積100卩l然后按以下步驟操作：1）加入等體積的苯酚/氯仿，上下顛倒混勻，室溫放置 5min，后 14,000rpm，離心 15mi n，取上清。2）加入等體積的氯仿，上下顛倒混勻，靜置分層后14,000rpm，離心15mi n，取上清。3）加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒6-8次），-20

5、 C靜置15min；4）4C下，14,000g離心15min,收集RNA沉淀，去上清；5）用75%乙醇洗滌兩次（12,000g離心5min）,超凈臺風干；6）加入適量DEPCK（至少15ul ）溶解沉淀。四、總RNA屯度和完整性檢測1）純度檢測：取1卩l RNA樣品50倍稀釋，在核酸蛋白檢測儀上測定 OD值， OD6/OD80的比值大于1.8，說明制備的RNA較純，無蛋白質污染。2）總RNA完整性檢測：取RNA羊品1卩l，1%瓊脂糖凝膠電泳80VX 20min, EB 染色10min,用凝膠成像系統觀察并拍照，總 RNA勺5s rRNA，18s rRNA和 28s rRNA條帶，三條條帶完整的

6、話即可證明總 RNA抽提比較完整。五、逆轉錄1. mRNA1）在RNase free的PCR管中配置下列溶液.Total RNA卩 gH2O1.0 卩 l總體積12 卩l打均勻，置85 CRNA變性。隨后以防止RNA復2）將上述溶液吹保溫 5min，使 立即冰上致冷， 性；3）在該PCR管中加入下列試劑（Promegaoligo (dT)0.5卩lRan dom primer0.5卩l10mM dNTP2.0卩lRNase in hibitor0.5卩l5 x buffer4.0卩lM-MLV0.5卩l總體積8.0卩l4) 將上述20卩l反應溶液30C保溫10min；5) 42 C 保溫 50

7、min；6) 85C保溫 10min；7) -20 C 保存。2. microRNA :2）將上述溶85 C孵打開RNAtotal RNAX個miR逆轉錄引物H2O1.00.5*X卩g卩l隨后立總體積12.5卩l上，以防使用莖環逆轉錄法，原理如下圖：1）在去RNase的 PCRt中配置以下溶液液混勻，育5min，以 二級結構。即置于冰止RNA復性再次恢復二級結構；3）在另一去RNase的PCRt中配置以下溶液:10mM dNTP (promega)2.0卩lRNase in hibitor (promega)0.5卩lU6逆轉錄引物0.5卩l5x buffer4.0卩lM-MLV (prome

8、ga)0.5卩l總體積7.5卩I4）將3）溶液加入到1）溶液中，混勻后30C保溫10min；5）42C 孵育 50min；6）85C孵育10min滅活逆轉錄酶。四、定量PCR僉測1.引物測試：根據mRN般計的引物正式實驗前需進行qPCRM試其特異性和擴增效率，具 體反應體系和反應條件如正式實驗，每對引物需做模板水對照。得到結果后，首先根據熔解曲線判斷引物特異性， 選擇標準為：單峰且峰形 偏窄、水對照無明顯引物二聚體熔解曲線峰。 若設計的多對引物熔解曲線均顯示 特異性良好，則應對比各引物的擴增曲線，優先選擇Ct值小、擴增效率高的引物進行正式實驗。2 確定上機內容后，首先在記錄本上編排好上機的樣品

9、排放順序。（1） 一個樣品的加樣盡可能安排在同一行（2）如正式實驗中三次重復不能安排在同一板上， 則需把三次重復中的實驗分開，但同一次重復的實驗不能分開兩板3 正式實驗：體系配制：H2O4ulSYBR Green PCR Master Mix10ul （TOYOBO）（使用前需振蕩均勻）上游引物0.5ul(10uM下游引物0.5ul(10uM總體積15ul計算好實驗中需用多少份體系，則按具體量配置。體系分裝會有損失，一 般多配0.5份-1份體系。總的體系配好后，在振蕩器中振蕩均勻或用槍吸打均勻， 然后15ul每管分 裝至8連管中。3. cDNA用滅菌純水稀釋適當的濃度，一般為 1:20稀釋，如

10、遇到基因表達低的 樣品，則適當降低稀釋比例至1:10或1:5。cDNA按一定順序排好后，即可加至 剛配好的反應體系中。加樣完畢，蓋好八連管蓋，并在八連管蓋最上沿的邊上標 記好1-12的順序（不可將標記寫在反應管的蓋子上，八連管蓋避免裸手觸摸中間透明的熒光采集區域， 且保證每孔均蓋緊， 否則影響重復性或可能出現熔解曲 線峰漂移。）4把各排八連管放在掌上離心機上離心數秒。五上機：5.1 先開電腦，進入 Windows界面。接著打開PCF儀電源開關。5.2 打開7500軟件，選擇“新建”，在“ Template”下拉菜單中選擇“ 60”或“65” （普通基因檢測為“ 60”，MicroRNA檢測為“ 65”）5.3 打開樣品架，放入八連管，關上樣品架，并在軟件上選擇已放反應管的孔 位，剔除無反應管的孔位。5.4 點擊File菜單中Save,輸入要保存結果的文件名，命名為日期-上機時間-客戶名字簡寫，如100830-1008-WL表示8月30日10點08分魏立的實驗。5.5 點擊 Start 鍵，開始運行程序。5.6 程序運行完畢后， 取出