1、第一章實(shí)驗(yàn)室及基本操作第一節(jié)第一節(jié) 組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的建立組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的建立在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)工作之前，在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)工作之前，首先應(yīng)對(duì)工作中需要哪些最基本的設(shè)備條件有個(gè)全面的了解，首先應(yīng)對(duì)工作中需要哪些最基本的設(shè)備條件有個(gè)全面的了解，以便因地制宜地利用現(xiàn)有房屋，或新建、改建實(shí)驗(yàn)室。以便因地制宜地利用現(xiàn)有房屋，或新建、改建實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模 1. 以工廠化生產(chǎn)為目的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小，以工廠化生產(chǎn)為目的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小， 則會(huì)限制生產(chǎn)影響效率。則會(huì)限制生產(chǎn)影響效率。 2. 在設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來(lái)設(shè)計(jì)，在設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)

2、實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來(lái)設(shè)計(jì)， 避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。 植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格無(wú)菌的條件下進(jìn)行的，植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格無(wú)菌的條件下進(jìn)行的， 要做到無(wú)菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，要做到無(wú)菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具， 同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。一、組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求一、組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求 便于隔離便于隔離 便于操作便于操作 便于滅菌便于滅菌 便于觀察便于觀察二、構(gòu)成二、構(gòu)成 化學(xué)實(shí)驗(yàn)室（洗滌室）化學(xué)實(shí)驗(yàn)室（洗滌室） 接種室接種室 無(wú)菌培養(yǎng)室無(wú)

3、菌培養(yǎng)室 滅菌室滅菌室 細(xì)胞學(xué)觀測(cè)室（可以不設(shè)）細(xì)胞學(xué)觀測(cè)室（可以不設(shè)）三、主要單元功能介紹三、主要單元功能介紹接種室接種室(外設(shè)緩沖間外設(shè)緩沖間)無(wú)菌接種箱無(wú)菌接種箱1. 無(wú)菌操作室無(wú)菌操作室 材料的消毒、接種，繼代。材料的消毒、接種，繼代。 內(nèi)置超凈工作臺(tái)或接種箱。內(nèi)置超凈工作臺(tái)或接種箱。 外設(shè)緩沖間，外設(shè)緩沖間， 放置拖鞋、工作服、工作帽等。放置拖鞋、工作服、工作帽等。2. 培養(yǎng)室培養(yǎng)室滿足材料的生長(zhǎng)（光、熱、水、氣）。滿足材料的生長(zhǎng)（光、熱、水、氣）。 要求：要求： 保溫隔熱；保溫隔熱； 控溫、控光；控溫、控光； 暗室。暗室。 設(shè)備：培養(yǎng)架、設(shè)備：培養(yǎng)架、 加溫設(shè)備、降溫設(shè)備加溫設(shè)備、

4、降溫設(shè)備3. 化學(xué)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)實(shí)驗(yàn)室 器皿的洗滌、干燥、保存；器皿的洗滌、干燥、保存； 藥品稱量、溶解、培養(yǎng)基的配置；藥品稱量、溶解、培養(yǎng)基的配置； 植物材料預(yù)處理，培養(yǎng)材料的觀察分析。植物材料預(yù)處理，培養(yǎng)材料的觀察分析。 主要設(shè)備主要設(shè)備 工作臺(tái)、藥品柜、冰箱、烘箱、天平、蒸餾水器。工作臺(tái)、藥品柜、冰箱、烘箱、天平、蒸餾水器。 4. 滅菌室滅菌室 對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。 5. 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室 培養(yǎng)材料的分析照相，培養(yǎng)材料的分析照相， 設(shè)備：顯微鏡、解剖鏡、染色設(shè)備。設(shè)備：顯微鏡、解剖鏡、染色設(shè)備?；緦?shí)驗(yàn)室布局平面圖實(shí)驗(yàn)臺(tái)擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無(wú)菌臺(tái)無(wú)

5、菌臺(tái)擱架拉窗冰箱擱 架水槽電爐門準(zhǔn)備室準(zhǔn)備室緩沖室緩沖室無(wú)菌室無(wú)菌室培養(yǎng)室培養(yǎng)室四、常用儀器設(shè)備四、常用儀器設(shè)備（一）儀器（一）儀器 1. 天平天平 1/10、1/100藥物天平：大量元素、藥物天平：大量元素、 蔗糖、瓊脂。蔗糖、瓊脂。 1/10000分析天平：維生素、分析天平：維生素、 激素、微量元素、微量附加物。激素、微量元素、微量附加物。 2. 滅菌鍋滅菌鍋 3. 烘箱（干燥箱）烘箱（干燥箱） 80-100：烘干物品、測(cè)定植物組織干物質(zhì)重。：烘干物品、測(cè)定植物組織干物質(zhì)重。 150-160：干熱滅菌（不超過(guò)：干熱滅菌（不超過(guò)175）；）；4. 冰箱冰箱 有機(jī)試劑和母液的儲(chǔ)藏；有機(jī)試劑和母

6、液的儲(chǔ)藏； 細(xì)胞及其他材料的冷藏保存；細(xì)胞及其他材料的冷藏保存； 植物材料的處理（低植物材料的處理（低 溫打破休眠）。溫打破休眠）。5. 酸度計(jì)酸度計(jì) 對(duì)培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)基pH值進(jìn)行調(diào)整。值進(jìn)行調(diào)整。 （一般用（一般用pH4-7的精密試紙代替）的精密試紙代替）6. 雙筒實(shí)體顯微鏡（解剖鏡）雙筒實(shí)體顯微鏡（解剖鏡） 莖尖的剝?nèi)。ǚ稚M織）；莖尖的剝?nèi)。ǚ稚M織）； 對(duì)植物材料的隔瓶觀測(cè)。對(duì)植物材料的隔瓶觀測(cè)。7. 蒸餾水器蒸餾水器 減小實(shí)驗(yàn)中的偶然因素。減小實(shí)驗(yàn)中的偶然因素。8. 空調(diào)空調(diào) 溫度變化差異不大。溫度變化差異不大。蒸餾水器蒸餾水器9. 震蕩培養(yǎng)機(jī)和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)機(jī)震蕩培養(yǎng)機(jī)和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)機(jī) 液體培

7、養(yǎng)。液體培養(yǎng)。10. 培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱搖床搖床光照培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)箱l1. 玻璃器皿玻璃器皿l 培養(yǎng)器皿培養(yǎng)器皿 原則：無(wú)毒透光；原則：無(wú)毒透光；l 試管：試管：215，2.515，315。l 三角瓶：三角瓶：50ml，100ml，150ml，200ml。（主要用于繼代培養(yǎng)）。（主要用于繼代培養(yǎng)）l 培養(yǎng)皿：培養(yǎng)皿：原生質(zhì)體、游離細(xì)胞、花藥等的培養(yǎng)；原生質(zhì)體、游離細(xì)胞、花藥等的培養(yǎng)；l 無(wú)菌種子的萌發(fā)；無(wú)菌種子的萌發(fā)；l 材料的分離；材料的分離；l 無(wú)菌濾紙的消毒滅菌無(wú)菌濾紙的消毒滅菌l l 封閉物防止培養(yǎng)基干燥和杜絕污染、無(wú)毒透氣（棉塞、菌膜）封閉物防止培養(yǎng)基干燥和杜絕污染、無(wú)毒透氣（棉塞、菌膜）

8、（二）必要器皿（二）必要器皿l盛裝器皿盛裝器皿l 燒杯、試劑瓶，燒杯、試劑瓶，l 藥品的溶解和儲(chǔ)存。藥品的溶解和儲(chǔ)存。l計(jì)量器皿計(jì)量器皿l 量筒：量筒： 10ml、25ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml。l 容量瓶：容量瓶：25ml，50ml，100ml，250ml，500ml，1000ml。l 移液管：，移液管：，1ml，2ml，5ml，10ml。l其他其他l 漏斗漏斗l 玻棒玻棒l 滴瓶滴瓶2. 金屬器皿金屬器皿 鑷子：鑷子： 剪刀：剪刀： 分離器械：手術(shù)刀、芽接刀分離器械：手術(shù)刀、芽接刀 l大量元素；大量元素；l微量元素；微量元素；l維生素、氨基酸等（有機(jī)附

9、加物）。維生素、氨基酸等（有機(jī)附加物）。l糖類：蔗糖、葡萄糖等。糖類：蔗糖、葡萄糖等。l凝固劑：瓊脂等。凝固劑：瓊脂等。l激素激素l生長(zhǎng)素類：生長(zhǎng)素類：IAA、IBA、NAA、2，4-D。l細(xì)胞分裂素類：細(xì)胞分裂素類：6-BA、KT、ZTl赤霉素類：赤霉素類：GA3（三）常備藥品（三）常備藥品一、培養(yǎng)基及其配制一、培養(yǎng)基及其配制（一）概念（一）概念MS + NAA 0.2 + 6-BA 2 + 蔗糖蔗糖 第二節(jié)第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)的一般技術(shù)植物組織培養(yǎng)的一般技術(shù)單位：?jiǎn)挝唬簃g/LMSmg/L2、根據(jù)成分、根據(jù)成分天然培養(yǎng)基：動(dòng)、植物的組織或組織的汁配成的培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：動(dòng)、植物的組織或組

10、織的汁配成的培養(yǎng)基。化學(xué)成分還不清楚或不恒定。化學(xué)成分還不清楚或不恒定。4、根據(jù)功能、根據(jù)功能 愈傷組織培養(yǎng)基、花粉培養(yǎng)基、莖尖培養(yǎng)基、愈傷組織培養(yǎng)基、花粉培養(yǎng)基、莖尖培養(yǎng)基、 脫分化培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基。脫分化培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基。1）脫分化培養(yǎng)基）脫分化培養(yǎng)基 （mg/L）高濃度生長(zhǎng)素高濃度生長(zhǎng)素 煙草：煙草：MS + 水解蛋白水解蛋白 500 + 2,4-D 1-2。 水稻：水稻：MS + 2,4-D 1。多量生長(zhǎng)素多量生長(zhǎng)素 + 少量細(xì)胞分裂素少量細(xì)胞分裂素 煙葉：煙葉：MS + 水解蛋白水解蛋白 哈密瓜：哈密瓜：多量細(xì)胞分裂素多量細(xì)胞分裂素 + 少量生長(zhǎng)素少量生長(zhǎng)

11、素 天竺葵：天竺葵：MS + NAA 0.2 + 6-BA 22）繼代培養(yǎng)基）繼代培養(yǎng)基在脫分化培養(yǎng)基上降低生長(zhǎng)素的量、在脫分化培養(yǎng)基上降低生長(zhǎng)素的量、或用原脫分化培養(yǎng)基?；蛴迷摲只囵B(yǎng)基。（三）培養(yǎng)基成分（三）培養(yǎng)基成分功能功能 組成各種化合物，參與機(jī)體的建成，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)。組成各種化合物，參與機(jī)體的建成，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)。 構(gòu)成一些生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝。構(gòu)成一些生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝。 元素之間互相協(xié)調(diào)，元素之間互相協(xié)調(diào)， 以維持離子濃度的平衡、膠體穩(wěn)定、電化學(xué)平衡等作用。以維持離子濃度的平衡、膠體穩(wěn)定、電化學(xué)平衡等作用。注：不同器官的發(fā)生，需要營(yíng)養(yǎng)元素的濃度不同。注：

12、不同器官的發(fā)生，需要營(yíng)養(yǎng)元素的濃度不同。1. 無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽大量元素：碳、氫、氧、氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫、硅大量元素：碳、氫、氧、氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫、硅（-） 。 3+7種，種， 干重干重0.01-10%微量元素：鐵、硼、錳、鋅、銅、鉬、氯、鎳微量元素：鐵、硼、錳、鋅、銅、鉬、氯、鎳（-） 、鈉、鈉（-） 。 9種，種， 干重干重0.00001-0.01% I（+） 、 Co（+）。必需元素的生理作用，必需元素的生理作用， 略。略。2. 有機(jī)物有機(jī)物1）維生素：）維生素：B1（鹽酸硫胺素）、（鹽酸硫胺素）、B3（煙酸）、（煙酸）、B6（鹽酸吡哆醇）。（鹽酸吡哆醇）。維生素主要是以各種輔酶的形

13、式參加酶的形成，維生素主要是以各種輔酶的形式參加酶的形成， 以及蛋白質(zhì)、脂肪的代謝等重要生命活動(dòng)。以及蛋白質(zhì)、脂肪的代謝等重要生命活動(dòng)。 對(duì)生長(zhǎng)和分化有促進(jìn)作用。對(duì)生長(zhǎng)和分化有促進(jìn)作用。雖然大多數(shù)的植物細(xì)胞在培養(yǎng)中都能合成所必需的維生素，雖然大多數(shù)的植物細(xì)胞在培養(yǎng)中都能合成所必需的維生素，但在數(shù)量上還明顯不足，但在數(shù)量上還明顯不足，通常需加入通常需加入1至數(shù)種維生素，以便獲良好的生長(zhǎng)至數(shù)種維生素，以便獲良好的生長(zhǎng).。2）氨基酸）氨基酸 氨基酸是蛋白質(zhì)的組成成分，氨基酸是蛋白質(zhì)的組成成分， 也是一種有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用也是一種有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用 。 常用的有甘氨酸、精氨酸、

14、谷氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、丙氨酸常用的有甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、丙氨酸 以及酰胺類物質(zhì)（如天門冬酰胺）以及酰胺類物質(zhì)（如天門冬酰胺） 和多種氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白等）。和多種氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白等）。 用酶法等加工牛乳的水解產(chǎn)物，由于營(yíng)養(yǎng)豐富，極易引起污染。用酶法等加工牛乳的水解產(chǎn)物，由于營(yíng)養(yǎng)豐富，極易引起污染。 如在培養(yǎng)中無(wú)特別需要，以不用為宜。如在培養(yǎng)中無(wú)特別需要，以不用為宜。3）肌醇）肌醇 肌醇具有幫助活性物質(zhì)（肌醇具有幫助活性物質(zhì)（VB1）發(fā)揮作用的效果，能使培養(yǎng)物快速生長(zhǎng)，）發(fā)揮作用的效果，能使培養(yǎng)物快速生長(zhǎng)，對(duì)胚狀體和芽的形成

15、有良好的促進(jìn)作用。對(duì)胚狀體和芽的形成有良好的促進(jìn)作用。4）天然有機(jī)附加物）天然有機(jī)附加物大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。它對(duì)細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用，它對(duì)細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用，但對(duì)器官的分化作用不明顯。但對(duì)器官的分化作用不明顯。它的成分大多不清楚，與其成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大，它的成分大多不清楚，與其成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大，所以一般應(yīng)盡量避免使用。所以一般應(yīng)盡量避免使用。 椰乳：是使用最多、效果最好的一種天然復(fù)合物。椰乳：是使用最多、效果最好的一種天然復(fù)合物。 它在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn)作用。它在愈傷組織和細(xì)胞培

16、養(yǎng)中有促進(jìn)作用。 在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進(jìn)作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進(jìn)作用。香蕉：用黃熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?，?duì)香蕉：用黃熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?，?duì)pH值的緩沖作用大。值的緩沖作用大。 主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用。馬鈴薯：去掉皮和芽后，加水煮，再經(jīng)過(guò)過(guò)濾，取其濾液使用。馬鈴薯：去掉皮和芽后，加水煮，再經(jīng)過(guò)過(guò)濾，取其濾液使用。 對(duì)對(duì)pH值緩沖作用也大。值緩沖作用也大。酵母提取液：主要成分為氨基酸和維生素類。酵母提取液：主要成分為氨基酸和維生素類。其他，麥芽提取液、蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實(shí)、未

17、熟玉米的胚乳等。其他，麥芽提取液、蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實(shí)、未熟玉米的胚乳等。 遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時(shí)使用，有時(shí)有效。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時(shí)使用，有時(shí)有效。 3. 碳源碳源為細(xì)胞提供合成新化合物的碳骨架，為細(xì)胞提供合成新化合物的碳骨架，為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物與能源，為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物與能源，還可以維持一定的滲透壓。還可以維持一定的滲透壓。最常用的碳源是蔗糖。最常用的碳源是蔗糖。葡萄糖和果糖也是較好的碳源，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。濃度：濃度：2%-4%，最常用，最常用

18、3% 。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用食用的白糖代替。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用食用的白糖代替。4. 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑1）生長(zhǎng)素類）生長(zhǎng)素類 誘導(dǎo)細(xì)胞脫分化，促進(jìn)愈傷組織的形成；誘導(dǎo)細(xì)胞脫分化，促進(jìn)愈傷組織的形成； 促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂；促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂； 促進(jìn)生根。促進(jìn)生根。吲哚乙酸：激素，有利于根形成，吲哚乙酸：激素，有利于根形成， 但是它容易被氧化和光解，組織培養(yǎng)中通常使用合成的生長(zhǎng)素。但是它容易被氧化和光解，組織培養(yǎng)中通常使用合成的生長(zhǎng)素。吲哚丁酸：誘導(dǎo)許多植物生根。吲哚丁酸：誘導(dǎo)許多植物生根。萘乙酸：最適宜誘導(dǎo)愈傷組織或誘導(dǎo)某些外植體生根。萘乙酸：最適宜誘導(dǎo)愈傷組織或誘導(dǎo)

19、某些外植體生根。二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2,4-D）：引起脫分化。）：引起脫分化。 能夠引起染色體變異，因此使用時(shí)必須格外小心。能夠引起染色體變異，因此使用時(shí)必須格外小心。作用效力作用效力吲哚乙酸（吲哚乙酸（IAA）吲哚丁酸（吲哚丁酸（IBA）萘乙酸萘乙酸（NAA）二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2,4-D）2）細(xì)胞分裂素類）細(xì)胞分裂素類 促進(jìn)細(xì)胞分化；促進(jìn)細(xì)胞分化； 有利于細(xì)胞分裂和愈傷組織的形成；有利于細(xì)胞分裂和愈傷組織的形成； 促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，可使莖增粗，而抑制莖的伸長(zhǎng)；促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，可使莖增粗，而抑制莖的伸長(zhǎng)； 誘導(dǎo)芽的分化，促進(jìn)側(cè)芽發(fā)生。誘導(dǎo)芽的分化，促進(jìn)側(cè)芽發(fā)生。激動(dòng)素：

20、最主要的用途是誘導(dǎo)芽的形成。激動(dòng)素：最主要的用途是誘導(dǎo)芽的形成。 玉米素：是一種天然激素，價(jià)格昂貴，其作用稍差于芐氨基嘌呤。玉米素：是一種天然激素，價(jià)格昂貴，其作用稍差于芐氨基嘌呤。6-芐氨基腺嘌呤（芐氨基腺嘌呤（6-BA）：具有高效、穩(wěn)定、廉價(jià)和易于使用等特點(diǎn)，）：具有高效、穩(wěn)定、廉價(jià)和易于使用等特點(diǎn)， 是組織培養(yǎng)最常用細(xì)胞分裂素類。是組織培養(yǎng)最常用細(xì)胞分裂素類。 主要作用是促進(jìn)芽的形成，也可以誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生。主要作用是促進(jìn)芽的形成，也可以誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生。作用效力作用效力玉米素玉米素ZT6-芐氨基腺嘌呤芐氨基腺嘌呤6-BA激動(dòng)素激動(dòng)素KT腺嘌呤腺嘌呤3）赤霉素）赤霉素 赤霉素有赤霉素有1

21、27種，種，生理活性及作用的種類、部位、效應(yīng)等各有不同，生理活性及作用的種類、部位、效應(yīng)等各有不同，培養(yǎng)基中添加的是培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于促進(jìn)幼苗莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，主要用于促進(jìn)幼苗莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)， 促進(jìn)胚狀體發(fā)育成小植株。促進(jìn)胚狀體發(fā)育成小植株。5. 培養(yǎng)材料的支持物培養(yǎng)材料的支持物 瓊脂瓊脂固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。瓊脂的用量在瓊脂的用量在0.8-1.0%之間之間 。凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外， 還與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間和還與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間和pH值等因素有關(guān)。值等因素有關(guān)。其它：玻璃纖維、濾紙

22、橋、海綿、卡拉膠等。其它：玻璃纖維、濾紙橋、海綿、卡拉膠等。6、其他成分、其他成分抗生素物質(zhì)：有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等抗生素物質(zhì)：有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等, 可防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失?？煞乐咕愇廴荆瑴p少培養(yǎng)中材料的損失。抗氧化劑：易褐化的材料?？寡趸瘎阂缀只牟牧稀；钚蕴浚夯钚蕴浚?莖尖初代培養(yǎng)，加入適量活性炭，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物；莖尖初代培養(yǎng)，加入適量活性炭，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物； 新梢增殖階段，活性炭可明顯促進(jìn)新梢的形成和伸長(zhǎng)；新梢增殖階段，活性炭可明顯促進(jìn)新梢的形成和伸長(zhǎng)； 活性炭在生根時(shí)有明顯的促進(jìn)作用?；钚蕴吭谏鶗r(shí)有明顯的促進(jìn)作用。

23、 7、pH值值喜光、耐旱、耐鹽堿：喜光、耐旱、耐鹽堿： pH值中性；值中性；喜濕、耐陰、喜酸：喜濕、耐陰、喜酸： pH值偏酸。值偏酸。 培養(yǎng)基滅菌后，培養(yǎng)基滅菌后， pH值一般下降。值一般下降。（四）培養(yǎng)基的選擇（四）培養(yǎng)基的選擇幾種基本培養(yǎng)基的特點(diǎn)幾種基本培養(yǎng)基的特點(diǎn)1）富集元素富集元素平衡培養(yǎng)基平衡培養(yǎng)基 - MS培養(yǎng)基（典型代表）培養(yǎng)基（典型代表） 無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽濃度高，元素間的比例較適合；濃度高，元素間的比例較適合； 緩沖緩沖性能好，某些元素略有損失不會(huì)影響離子平衡；性能好，某些元素略有損失不會(huì)影響離子平衡； 營(yíng)養(yǎng)豐富營(yíng)養(yǎng)豐富，不需再加入水解蛋白等有機(jī)成分；，不需再加入水解蛋白等有機(jī)成分

24、； 微量元素微量元素種類較全，濃度較高；種類較全，濃度較高； 適合多種植物，適合多種植物，用途廣泛用途廣泛。 與與MS相類似的培養(yǎng)基，相類似的培養(yǎng)基， LS、BL、BM、ER培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基等。2）硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基）硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基 硝酸鉀的含量高，硝酸鉀的含量高， 銨態(tài)氮的含量低，銨態(tài)氮的含量低， 含有較高的鹽酸硫胺素（含有較高的鹽酸硫胺素（VB1）。）。如，如，B5（水稻成熟胚愈傷組織分化時(shí)用其微量元素部分）（水稻成熟胚愈傷組織分化時(shí)用其微量元素部分）、 N6（禾谷類植物的花藥和花粉培養(yǎng)禾谷類植物的花藥和花粉培養(yǎng) ）、 SH培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。3）中等無(wú)機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基）中等無(wú)機(jī)鹽

25、含量的培養(yǎng)基大量元素?zé)o機(jī)鹽約為大量元素?zé)o機(jī)鹽約為MS的一半；的一半；微量元索種類減少而含量增高；微量元索種類減少而含量增高；2. 培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基選擇 1）背景調(diào)查）背景調(diào)查對(duì)該供試植物對(duì)該供試植物分類地位、生理特性、繁殖、栽培條件及品種類型等分類地位、生理特性、繁殖、栽培條件及品種類型等有充分的了解。有充分的了解。應(yīng)詳細(xì)查閱前人對(duì)該植物的研究工作，應(yīng)詳細(xì)查閱前人對(duì)該植物的研究工作，總結(jié)分析前人工作的成功和不足之處，總結(jié)分析前人工作的成功和不足之處，從而在此基礎(chǔ)上確定基本培養(yǎng)基類型。從而在此基礎(chǔ)上確定基本培養(yǎng)基類型。2）選擇原則）選擇原則l同一物種的不同亞種、品種間的基本培養(yǎng)基類型基本相同；同

26、一物種的不同亞種、品種間的基本培養(yǎng)基類型基本相同；l同一植物的不同組織、器官的基本培養(yǎng)基類型基本相同；同一植物的不同組織、器官的基本培養(yǎng)基類型基本相同；l營(yíng)養(yǎng)成分需求與田間栽培有相似性；營(yíng)養(yǎng)成分需求與田間栽培有相似性；l無(wú)機(jī)鹽濃度是基本培養(yǎng)基類型的重要因素，無(wú)機(jī)鹽濃度是基本培養(yǎng)基類型的重要因素， 應(yīng)該作為培養(yǎng)基選擇的重要參數(shù)；應(yīng)該作為培養(yǎng)基選擇的重要參數(shù)；l有機(jī)成分主要是種類的變化，每種成分含量的變化不大；有機(jī)成分主要是種類的變化，每種成分含量的變化不大；l在確定基本培養(yǎng)基類型后，研究最適的蔗糖濃度。在確定基本培養(yǎng)基類型后，研究最適的蔗糖濃度。3）激素的選擇原則）激素的選擇原則生長(zhǎng)素生長(zhǎng)素 主

27、要功能是促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)愈傷組織和生根等，主要功能是促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)愈傷組織和生根等， 各種生長(zhǎng)素的強(qiáng)度按以下排列而減弱：各種生長(zhǎng)素的強(qiáng)度按以下排列而減弱： 2,4-D、NAA、IBA和和IAA。 與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)莖的增殖。與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)莖的增殖。細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素 主要促進(jìn)細(xì)胞分裂，改變頂端優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)芽的分化等。主要促進(jìn)細(xì)胞分裂，改變頂端優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)芽的分化等。 常用幾種細(xì)胞分裂素的強(qiáng)度按以下排列減弱；常用幾種細(xì)胞分裂素的強(qiáng)度按以下排列減弱； ZT、6-BA、KT和腺嘌呤。和腺嘌呤。激素選擇原則激素選擇原則細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比例是激素使用的關(guān)鍵；細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比例是激素

28、使用的關(guān)鍵；細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的種類對(duì)不同植物的敏感性不同；細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的種類對(duì)不同植物的敏感性不同；同一植物的不同組織在愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化過(guò)程中對(duì)激素的要求不同。同一植物的不同組織在愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化過(guò)程中對(duì)激素的要求不同。4 4）總結(jié)）總結(jié)基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì) 糖糖 營(yíng)養(yǎng)元素營(yíng)養(yǎng)元素 天然附加物天然附加物 凝固劑凝固劑4）常用試驗(yàn)方法）常用試驗(yàn)方法單因子試驗(yàn)單因子試驗(yàn) 培養(yǎng)基中其他成分都不變，只變動(dòng)一個(gè)因子。培養(yǎng)基中其他成分都不變，只變動(dòng)一個(gè)因子。 就可以找出這一因子對(duì)試驗(yàn)的影響和影響的程度。就可以找出這一因子對(duì)試驗(yàn)的影響和影響的程度。多因子試驗(yàn)多因子試

29、驗(yàn) 對(duì)培養(yǎng)基中兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究。對(duì)培養(yǎng)基中兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究。 試驗(yàn)可采用完全試驗(yàn)方案、正交設(shè)計(jì)方案。試驗(yàn)可采用完全試驗(yàn)方案、正交設(shè)計(jì)方案。培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基配方試驗(yàn)試驗(yàn)（五）培養(yǎng)基的配制（五）培養(yǎng)基的配制1. 對(duì)藥品和水的要求對(duì)藥品和水的要求 選擇等級(jí)較高的藥品選擇等級(jí)較高的藥品; 同一試驗(yàn)要用同一批次的藥品同一試驗(yàn)要用同一批次的藥品; 原則上用純水。原則上用純水。藥品純度等級(jí)藥品純度等級(jí)1、工作基準(zhǔn)試劑（無(wú)簡(jiǎn)寫標(biāo)記，用漢語(yǔ)注明，綠色標(biāo)簽）：、工作基準(zhǔn)試劑（無(wú)簡(jiǎn)寫標(biāo)記，用漢語(yǔ)注明，綠色標(biāo)簽）： 作為基準(zhǔn)物質(zhì)，標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)溶液。作為基準(zhǔn)物質(zhì)，標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)溶液。 2、優(yōu)級(jí)純（、優(yōu)級(jí)純（G

30、R，綠色標(biāo)簽）：用于精確分析和研究工作，有的可作為基準(zhǔn)物質(zhì)。，綠色標(biāo)簽）：用于精確分析和研究工作，有的可作為基準(zhǔn)物質(zhì)。 3、分析純（、分析純（AR，紅色標(biāo)簽）：用于工業(yè)分析及化學(xué)實(shí)驗(yàn)，用得最多的等級(jí)。，紅色標(biāo)簽）：用于工業(yè)分析及化學(xué)實(shí)驗(yàn)，用得最多的等級(jí)。 4、化學(xué)純（、化學(xué)純（CP，藍(lán)色標(biāo)簽）：用于化學(xué)實(shí)驗(yàn)和合成制備。，藍(lán)色標(biāo)簽）：用于化學(xué)實(shí)驗(yàn)和合成制備。 5、實(shí)驗(yàn)試劑（、實(shí)驗(yàn)試劑（LR ，黃色標(biāo)簽）：用于一般化學(xué)實(shí)驗(yàn)和合成制備。，黃色標(biāo)簽）：用于一般化學(xué)實(shí)驗(yàn)和合成制備。 2. 母液配制母液配制1）優(yōu)點(diǎn)）優(yōu)點(diǎn) 減少工作量減少工作量; 減少多次稱量造成的誤差減少多次稱量造成的誤差; 便于微量元素

31、的稱量便于微量元素的稱量; 保證每一個(gè)材料的培養(yǎng)基有相同的成分。保證每一個(gè)材料的培養(yǎng)基有相同的成分。2）母液種類）母液種類 大量元素：大量元素：1050倍；倍； 微量元素：微量元素：100200倍；倍； Fe鹽：鹽： 100200倍（棕色瓶）；倍（棕色瓶）； 有機(jī)物：有機(jī)物： 20100倍；倍； 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液 （1mg/ml）。）。3）母液配制注意事項(xiàng)）母液配制注意事項(xiàng)l植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的溶解植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的溶解 生長(zhǎng)素類：堿溶；生長(zhǎng)素類：堿溶； 95%乙醇溶、蒸餾水定容。乙醇溶、蒸餾水定容。 細(xì)胞分裂素類：酸溶、蒸餾水定容。細(xì)胞分裂素類：酸溶、蒸餾水定容。 赤霉酸：熱水

32、溶，以赤霉酸：熱水溶，以95%乙醇配成原液。乙醇配成原液。Fe鹽制備：將兩物質(zhì)分別溶解在鹽制備：將兩物質(zhì)分別溶解在450ml水中，水中， 然后混合，然后混合， 定容。定容。配制好的母液分別貼上標(biāo)簽配制好的母液分別貼上標(biāo)簽MS MS 大量元素大量元素10 X 10 X 查仁明查仁明 04.04.0404.04.04貯存：溫度貯存：溫度2-4度，度， 一般無(wú)機(jī)物一般無(wú)機(jī)物3-6個(gè)月，個(gè)月， 有機(jī)物有機(jī)物3個(gè)月。個(gè)月。3、培養(yǎng)基配制、培養(yǎng)基配制 蒸餾水蒸餾水母液母液生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑瓊脂粉瓊脂粉蔗糖蔗糖 融化融化調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH分裝分裝滅菌滅菌冷卻冷卻二、無(wú)菌技術(shù)二、無(wú)菌技術(shù)有菌的范疇有菌的范疇凡

33、是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。至少它的表面都是有菌的，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。無(wú)菌的范疇無(wú)菌的范疇經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過(guò)后的物體，經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過(guò)后的物體，經(jīng)其他物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體，經(jīng)其他物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體，高層大氣、巖石內(nèi)部、高層大氣、巖石內(nèi)部、強(qiáng)酸強(qiáng)堿，化學(xué)元素滅菌劑等的表面和內(nèi)部等等都是無(wú)菌的。強(qiáng)酸強(qiáng)堿，化學(xué)元素滅菌劑等的表面和內(nèi)部等等都是無(wú)菌的。 污染污染 指在組織培養(yǎng)過(guò)程中由于真菌、細(xì)菌或病毒的侵染，

34、指在組織培養(yǎng)過(guò)程中由于真菌、細(xì)菌或病毒的侵染，而使培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，而使培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。直接侵入培養(yǎng)物中，殺死培養(yǎng)物；直接侵入培養(yǎng)物中，殺死培養(yǎng)物；向培養(yǎng)基分泌有毒物質(zhì)，毒死培養(yǎng)物；向培養(yǎng)基分泌有毒物質(zhì)，毒死培養(yǎng)物；競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)基養(yǎng)分使?fàn)I養(yǎng)耗盡，培養(yǎng)物饑餓而死。競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)基養(yǎng)分使?fàn)I養(yǎng)耗盡，培養(yǎng)物饑餓而死。污染所引起的危害污染所引起的危害污染引起的危害有的是極明顯的，污染引起的危害有的是極明顯的，如早期培養(yǎng)的失敗，增殖效率的降低，生長(zhǎng)減慢，玻璃苗增加，生長(zhǎng)的不均勻等；如早期培養(yǎng)的失敗，增殖效率的降低，生長(zhǎng)減慢，玻璃苗增加，生長(zhǎng)的不均勻等；而有的

35、影響可在以后的過(guò)程顯現(xiàn)，如移栽困難和苗的死亡，田間的不良表現(xiàn)。而有的影響可在以后的過(guò)程顯現(xiàn)，如移栽困難和苗的死亡，田間的不良表現(xiàn)。污染也會(huì)引起培養(yǎng)物的遺傳變異。污染也會(huì)引起培養(yǎng)物的遺傳變異。有些病原菌的存在（如國(guó)際上已發(fā)現(xiàn)的某些商業(yè)生產(chǎn)的試管苗有些病原菌的存在（如國(guó)際上已發(fā)現(xiàn)的某些商業(yè)生產(chǎn)的試管苗帶有胡蘿卜軟腐歐文氏菌），可以引起多種作物的病害；帶有胡蘿卜軟腐歐文氏菌），可以引起多種作物的病害；試管苗（在未進(jìn)行專門的病原體脫除和鑒定時(shí)）試管苗（在未進(jìn)行專門的病原體脫除和鑒定時(shí)）也常是很多致病的病毒、類病毒、類菌原體的攜帶者，也常是很多致病的病毒、類病毒、類菌原體的攜帶者，育目發(fā)展可能引起病毒大

36、規(guī)模的擴(kuò)散。育目發(fā)展可能引起病毒大規(guī)模的擴(kuò)散。（一）污染源及其表現(xiàn)特征（一）污染源及其表現(xiàn)特征1. 外植體外植體 表面帶菌：接種后很快長(zhǎng)出微生物菌落表面帶菌：接種后很快長(zhǎng)出微生物菌落; 內(nèi)生帶菌：接種后一定時(shí)間才表現(xiàn)出來(lái)。內(nèi)生帶菌：接種后一定時(shí)間才表現(xiàn)出來(lái)。 特征：靠近外植體培養(yǎng)基表面出現(xiàn)微生物菌落。特征：靠近外植體培養(yǎng)基表面出現(xiàn)微生物菌落。 2. 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 在培養(yǎng)基表層和深層同時(shí)出現(xiàn)點(diǎn)狀分布的菌落。在培養(yǎng)基表層和深層同時(shí)出現(xiàn)點(diǎn)狀分布的菌落。3. 培養(yǎng)器皿培養(yǎng)器皿 在培養(yǎng)基與容器接觸處在培養(yǎng)基與容器接觸處 或器壁上出現(xiàn)菌落。或器壁上出現(xiàn)菌落。4. 工作人員工作人員 在培養(yǎng)基表面在培養(yǎng)基表面

37、 或操作器械接觸處出現(xiàn)菌落?；虿僮髌餍到佑|處出現(xiàn)菌落。5. 空氣空氣 原因：超凈工作臺(tái)故障；原因：超凈工作臺(tái)故障； 瓶塞過(guò)松瓶塞過(guò)松 特征：在培養(yǎng)基表面靠近培養(yǎng)容器壁處出現(xiàn)菌落。特征：在培養(yǎng)基表面靠近培養(yǎng)容器壁處出現(xiàn)菌落。（二）常用的滅菌方法（二）常用的滅菌方法滅菌滅菌用物理或化學(xué)的方法，用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。消毒消毒殺死、消除或充分抑制部分微生物，殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。使之不再發(fā)生危害作用。1. 加熱滅菌加熱滅菌1）濕熱滅菌

38、）濕熱滅菌設(shè)備：高壓滅菌鍋設(shè)備：高壓滅菌鍋原理：通過(guò)蒸汽接觸材料表面原理：通過(guò)蒸汽接觸材料表面 冷凝時(shí)釋放熱能達(dá)到殺死微生物的目的。冷凝時(shí)釋放熱能達(dá)到殺死微生物的目的。工作條件：工作條件：1-1.2kg/2，20-30 min。 121 ，15 min。 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 滅菌前排盡冷空氣；滅菌前排盡冷空氣； 滅菌后壓力切勿降低太快。滅菌后壓力切勿降低太快。2 2）干熱滅菌）干熱滅菌灼燒灼燒 蘸蘸95%酒精燃燒器具。酒精燃燒器具。烘燒烘燒 設(shè)備：設(shè)備： 烘箱烘箱 工作條件：工作條件：140，4h 或或160-170，2-3h注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 要妥為包扎，以免滅菌后取用時(shí)重新污染；要妥為包扎，以免滅菌后取用時(shí)重新污染； 溫度一般勿超過(guò)溫度一般勿超過(guò)175 2. 化學(xué)滅菌化學(xué)滅菌 1）液體滅菌：酒精、升汞、雙氧水、次氯酸鈉等，適用于外植體表面滅菌。）液體滅菌：酒精、升汞、雙氧水、次氯酸鈉等，適用于外植體表面滅菌。 2）氣體滅菌：甲醛、乙二醇。）氣體滅菌：甲醛、乙二醇。 向甲醛內(nèi)加入高錳酸鉀，促進(jìn)甲醛的快速揮發(fā)而起到滅菌的作用。向甲醛內(nèi)加