1、重組DNA分子的酶切、連接、轉(zhuǎn)化和篩選摘 要：本實(shí)驗(yàn)利用酶切后的目的片段（500bp）與puc18為材料，運(yùn)用氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞和外源的重組體DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞，經(jīng)過篩選培養(yǎng)基篩選后得到重組子。關(guān)鍵詞：酶切 重組 篩選前 言 重組克隆是指含有外源DNA的細(xì)胞增殖而產(chǎn)生的細(xì)胞群體，或由其經(jīng)生長、發(fā)育和再生而形成的組織、器官、個體。重組克隆的篩選主要依靠DNA載體上的選擇標(biāo)記，加上合適的選擇（培養(yǎng)）條件來進(jìn)行。一是通過選擇培養(yǎng)基使只有帶外源DNA的細(xì)胞才能生長；二是根據(jù)選擇性遺傳標(biāo)記選擇帶有目的基因的細(xì)胞克隆。1材料與方法1.1材料質(zhì)粒DNA、目的DNA、E.coli受菌體、質(zhì)粒pUC18、

2、重組體DNA1.2方法1.2.1PCR法擴(kuò)增目的片段（CER3A）1.2.1.1 PCR反應(yīng)體系反應(yīng)物體積/ulPCR Taq mix12.5CER3Ar，CER3Af各1dd水9.5質(zhì)粒CER3A11.2.1.2 PCR擴(kuò)增條件 在PCR儀上設(shè)計945min，然后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)中第一步為9430s，第二步為58退火30s，第三步為72延伸1min，共進(jìn)行35次循環(huán)，然后再72延伸10min以提高產(chǎn)物的擴(kuò)增率，取出放在4條件下終止反應(yīng)。1.2.2目的片段的電泳 將10倍loading buffer 5ul和25ulPCR產(chǎn)物混勻，在1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳，分析。1.2.3目的片段的回收 通

3、過瓊脂糖電泳盡可能將目的DNA片段與其他片段分開，用干凈的手術(shù)刀，將含目的片段DNA的瓊脂糖凝膠塊切下，放入2ml離心管稱重。根據(jù)凝膠重量和濃度，按每100mg瓊脂糖加400ml的比例加bufferB2。將離心管置于50水浴510min，間或混勻，直至膠塊完全溶化。在酶切反應(yīng)體系中加入5倍bufferB2，混勻。將熔化好的溶液全都移到吸附柱，靜止2min，8000×g離心30s，倒掉收集管的液體，將吸附管放入同一收集管中。向吸附管中加入加入500ul Wash Solution，9000×g離心30s，倒掉收集管中的液體，將吸附管放在同一根收集管中。重復(fù)步驟（6）一次。將空

4、吸附柱和收集管放入離心機(jī)，12000×g離心2min，打開瓶蓋，放置25min，揮發(fā)酒精。換新的1.5ml離心管，在吸附膜中加入20ul dd水（pH8.0），溫室靜置5min，12000×g離心2min，將所得的DNA溶液置于-20保存或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)物體積/ul目的片段15Sad1.5Pst1.510×loading buffer10dd水72 1.2.4目的片段和pUC18質(zhì)粒的酶切1.2.4.1目的片段的酶切在37反應(yīng)12h。1.2.4.2 pUC18質(zhì)粒的酶切反應(yīng)物體積/ulpUC1815Sad1.5Pst1.510×loading buf

5、fer10dd水72在37反應(yīng)12h。然后將吸取2ul酶切產(chǎn)物，加入10×loading buffer 1ul和dd水7ul，在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察并分析結(jié)果。1.2.5 DNA片段與質(zhì)粒pUC18的連接（體積的量不確定）反應(yīng)物體積/ul目的片段5pUC1856×loading buffer1T4 ligase21.2.6重組體DNA遺傳轉(zhuǎn)化與克隆篩選1.2.6.1感受態(tài)細(xì)胞的制備 取對數(shù)生長期的大腸桿菌培養(yǎng)物1ml于離心管中7000r/min離心35min，傾去上清液后收集菌體置于冰浴中。用1ml預(yù)冷的0.05mol/L CaCl2懸浮菌體，于離心管中7000r

6、/min離心35min，傾去上清液后收集菌體置于冰浴中。再用1ml預(yù)冷的0.05mol/L CaCl2懸浮菌體，冰浴15min，7000r/min離心35min，傾去上清液后收集菌體置于冰浴中。加入100ul預(yù)冷0.05mol/L CaCl2懸浮后即為感受態(tài)細(xì)胞，可在4下保存一周。.2重組體DNA的遺傳轉(zhuǎn)化與克隆篩選 常溫下熔化感受態(tài)細(xì)胞，加入重組體DNA40ng左右，冰浴30min。42熱擊90s，冰浴5min，加入1mlLB培養(yǎng)基，37溫育1h。區(qū)230ul菌體懸浮培養(yǎng)物加入30ul IPTG和40ulX-gal，混合均勻后在氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上涂布均勻，注意不要劃破平板培養(yǎng)基

7、表面，于37溫育過夜。挑選重組體細(xì)胞克?。涸诠腆w培養(yǎng)基平板上的藍(lán)色菌落為帶質(zhì)粒但不含目的基因片段的克隆；白色菌落為帶有目的基因片段或外源DNA的重組克隆。各重組克隆可進(jìn)一步增殖，用于建立基因文庫，或進(jìn)行外源基因片段的序列分析。2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器設(shè)備2.1實(shí)驗(yàn)試劑電泳試劑 上樣緩沖液；TBE緩沖液； DNA內(nèi)切酶 EcoR試劑盒 T4DNA連接酶 T4DNA連接酶緩沖液 20mmol/L Tris-HCl（pH7.6），5mmol/LMgCl2，0.5mmol/L ATP，5mmol/L DTT和500ug/mL BSA溶于滅過菌的重蒸水中；標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品 DNA；DNA/EcoR；DNA/Hin

8、d ；含有EcoR和Hind 識別序列的質(zhì)粒DNA；目的DNA樣品；其他試劑 苯酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）；氯仿；異丙醇；乙醇；3mol/L NaAc；TE緩沖液；培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基；含100mg/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基； 0.05mol/L CaCl2，置于冰箱中預(yù)冷；2.1.11克隆試劑 28.2mg/mL IPTG（異丙基硫代半乳糖苷），配2mL；20mg/mL X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚品吡喃乳糖苷，溶于二甲基甲酰胺中，-20避光保存），配2mL。2.2實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備 高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋、移液器、紫外觀測儀、凝膠成像裝置、水平電泳槽、雙穩(wěn)電泳儀、低溫冰箱、

9、恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、分光光度計、高速冷凍離心機(jī)、離心管、微波爐、試管、培養(yǎng)皿、三角瓶150mL和500mL、燒杯、滅菌牙簽。3結(jié)果與分析（1） 目的片段的擴(kuò)增左圖為目的片段（500bp）PCR擴(kuò)增后的電泳圖，從圖中可以看到，PCR產(chǎn)物的質(zhì)量和數(shù)量，條帶清晰可見，亮度也很好，可以說PCR的產(chǎn)物其質(zhì)量很好，數(shù)量也是不少的，因此可以用此產(chǎn)物進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。 （2）目的片段的回收左圖為目的片段（500bp）自凝膠中回收后的電泳圖，從圖中可以看到條帶明亮且清晰，說明回收效果不錯，其質(zhì)量很好，數(shù)量不少，可以用此產(chǎn)物進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。 （3）目的片段與puc18的酶切左圖為目的片段與pu

10、c18酶切后的電泳圖，圖中較長的兩條條帶是500bp的，短的一條是puc18的條帶，可以看到條帶是比較清晰，有一定亮度，因此認(rèn)定此材料能繼續(xù)完成下一步的實(shí)驗(yàn)（4）藍(lán)白斑的篩選左圖為重組體DNA遺傳轉(zhuǎn)化與克隆后的篩選，圖中可以看到藍(lán)色斑的附近布滿了大大小小的白斑，而白斑的出現(xiàn)即說明了我們的重組體成功地轉(zhuǎn)化了，藍(lán)斑是沒有轉(zhuǎn)化的結(jié)果，而從圖中的右下角有一個比較大的白斑，此處為培養(yǎng)基污染了長菌，并不是白斑。（5）藍(lán)白斑的鑒定左圖為白斑的鑒定電泳圖，可從圖上看出，我們的條帶一致，進(jìn)過與MARK對比可知是目的產(chǎn)物，但第一條帶中有一些的拖尾現(xiàn)象，第二條帶亮度有點(diǎn)分散，不太凝聚，說明白斑的質(zhì)量不是非常的好，應(yīng)該還需要培養(yǎng)一下。4結(jié)論與討論（1）在電泳后回收片段的時候，切膠不能切太厚，因?yàn)橐皇沁@樣的話膠會溶解得比較慢，二是膠太多了，而我們加的試劑的量沒有變的情況下會影響整個回收的質(zhì)量。所以說，有時候雖然實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)上有明文寫出我們的用量，但在一定的情況下，我們可以根據(jù)試劑的情況適當(dāng)?shù)募恿炕蛘呤菧p量，不能一味的照本宣科。（2）因?yàn)榇藢?shí)驗(yàn)需要多次的電泳以確定我們產(chǎn)物的質(zhì)量，因此制膠的技術(shù)需要非常的熟練，另外因根據(jù)目的片段越小，膠越濃的原則來配膠。（3）在制作感受態(tài)細(xì)胞的過程中，因細(xì)胞處于脆弱狀態(tài)，我們的