1、醫學博士科研計劃書LncRNA-ANCR基因表達對大鼠退行性脊柱側凸影響的實驗研究退行性脊柱側凸 (degenerative scoliosis,DS)通常指機體骨骼成熟后出現的脊柱腰段的側凸 ,冠狀面 Cobb?角大于 10 °,同時可以存在矢狀面失衡與/或脊椎的旋轉異常。隨著全球人口老齡化及老年人生活方式轉變,DS 已成為導致脊柱畸形、影響生活質量的一種腰椎退行性疾病。由于DS 的具體病因還未明確解釋,當前關于DS 的研究絕大多數就是針對治療,涉及病因學方面的基礎研究很少。 因此 ,進一步研究 DS 的病因及發病機制具有非常重要的意義。長鏈非編碼 RNA(Long non-cod

2、ing RNA,LncRNA) 就是長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA 。研究表明 ,LncRNA 在調控表觀遺傳、細胞周期與細胞分化等細胞分化與個體發育的生命活動中發揮重要作用,并與人類疾病的發生密切相關,其中包括癌癥、退行性疾病在內的多種嚴重危害人類健康的重大疾病,成為當前研究熱點。其中 ,ANCR(anti-differentiation ncRNA, 抗分化 ncRNA) 為一個 855 bplncRNA, 在細胞分化期間下調。 ANCR 在包含祖細胞群體中的減少,沒有任何其她刺激 ,導致快速分化基因誘導。本研究正就是選擇LncRNA-ANCR 這一基因 ,旨在通過研究該基因與

3、大鼠DS 之間作用關系 ,為進一步從分子生物學水平研究DS 的發病機理 ,希望從發病的初始關鍵環節上預防該類型疾病發生。參考文獻(1)Dalle-Carbonare L,Innamorati G,Valanti MT.Transcription factor Runx2 and itsapplication to bone tissue engineeringJ.Stem Cell Rev,2012,8(3):891897、(2)Liu TM,IR EH Tran.scriptional regulatory cascades in Runx2 dependent bonedevelopmen

4、tJ.Tissue Eng Part B Rev,2013,19(3):254263、(3)Lin Zhu,Pei-Cheng Xu,Downregulated LncRNA-ANCR promotes osteoblast differentiation by targeting EZH2 and regulating Runx2 expressionJ,Biochemicaland Biophysical Research Communications 432 (2013) 612617、(4)Glass DA、 Canonical Wnt signaling in differentia

5、ted osteoblasts controlsosteoclast differentiationJ.Dev Cell,2010,104(9):1670216707、(5)劉錫梅 ,馬越鳴 ,丁伯平等 ,大鼠兩種骨質疏松模型的建立J、皖南醫學院學報 ,2001,20(1):4-5、(6)劉曉陽 ,邱貴興 ,翁習生等 ,長鏈非編碼 RNA 在青少年特發性脊柱側凸中的表達研究 J、中國骨與關節外科 ,2014,3(7):235-240、(7)Daffner SD,Vaccaro AR、 Adult degene rative lumbarscoliosis、 Am J Orthop,2003,3

6、2(2):77-82、(8)Kretz M , Webster DE , Flockhart RJ?etc, Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCRJ, Genes Dev、2012,26 (4) :338343、(9)李慧章 ,葉君健。骨形態發生蛋白在椎間盤退變中的研究J 、 福建醫科大學學報 ,2005,39(1):53-55、(10)Cui M;Wan Y;Anderson DG、 Mouse growth and differentiation factor-5 pro

7、tein and DNA therapy potentiates intervertebral disc cell aggregation and chondrogenic gene expressionJ、 Spine Journal,2008,8(2):287-295、創新點 :LncRNA 就是當前的研究熱點 ,在癌癥方面研究相對較多,本研究借此熱點探討LncRNA-ANCR 在大鼠 DS 發生發展過程中的作用。若探明 LncRNA-ANCR 與 DS 之間的作用關系 ,從而人為地調控LncRNA-ANCR的作用機制 ,從早期防治 DS,為防治 DS 開辟一個新思路。實驗設計與技術路線

8、:1.重組 LncRNA-ANCR 腺病毒表達載體的構建、鑒定 (1)根據 LncRNA-ANCR 前體序列應用 Primer premier 5 軟件設計引物。(2)利用 PCR 技術擴增出 LncRNA-ANCR 前體的 DNA 序列。(3)LncRNA-ANCR 前體的 DNA 序列重組入腺病毒miRNA 表達載體。(4)應用 Lipofeetamine 2000將重組 LncRNA-ANCR 腺病毒表達載體與輔助包裝質粒共轉染如 293T 細胞進行病毒包裝。(5)收集、濃縮、純化與滴定重組LncRNA-ANCR 腺病毒。2、 重組 LncRNA-ANCR 腺病毒表達載體轉染大鼠BMSC

9、s 的細胞學研究(1)大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)的分離、培養選取 2 月齡大鼠 ,無菌條件下獲取自體骨髓,用 Ficoll 淋巴細胞分離液梯度離心法進行分離、培養 ,獲得自體原代骨髓干細胞,傳代培養。應用 CD45、CD34、CD29、CD105 單克隆抗體 ,FACS(流式細胞儀 )檢測 BMSCs 表面抗原表達。細胞分組 :基因組 :LncRNA-ANCR 載體轉染的 BMSCs無關序列組 :無關序列載體轉染的BMSCs空載體組 :空載體的 BMSCs空白對照組 :無特殊處理的 BMSCs(3)檢測 BMSCs 分化指標TaqMan RT-PCR與 Western-blot 方法分

10、別檢測各組BMSCs 內 BMP7 mRNA 、Runx2 mRNA 與 GDF5 mRNA 以及相應蛋白表達3、 重組 LncRNA-ANCR 腺病毒表達載體對大鼠DS 的動物實驗研究(1)實驗動物 :剛斷乳的 SD 大鼠 50 只,分 5 組,每組 10 只。(2)實驗分組 :空白對照組 :無特殊處理模型組 :僅雙上肢截肢空載體組 :雙上肢截肢 +注射空載體轉染的BMSCs無關序列組 :雙上肢截肢 +注射無關序列載體轉染的BMSCs基因組 :雙上肢截肢 +注射 LncRNA-ANCR 載體轉染的 BMSCs(3)影像學觀察測量大鼠脊柱形態變化(4)病理學 :觀察椎體與椎間盤病理變化(5)基

11、因表達 :TaqMan RT-PCR檢測 BMP7 mRNA 、 Runx2 mRNA 與 GDF5 mRNA表達(6)蛋白表達 :Westernblot 檢測 BMP7、 Runx2 與 GDF5 蛋白表達預期目標與意義 :成功構建與鑒定重組LncRNA-ANCR 腺病毒載體。將重組 LncRNA-ANCR 腺病毒載體轉染到BMSCs 細胞中 ,阻斷或顯著抑制BMSCs 分化 ,最終導致大鼠發生DS。本研究如達到預期結果 ,可在國際核心學術期刊發表1-2 篇論文。課題研究的階段性安排 :(1)2016.01-2016.05 完成載體的構建。(2)2016.06-2016.12 完成細胞學實驗

12、及動物學實驗。(3)2017.01-2017.06 整理實驗數據 ,寫出論文總結 ,發表相關文章衛生管理制度1總則1.1為了加強公司的環境衛生管理，創造一個整潔、文明、溫馨的購物、辦公環境，根據公共場所衛生管理條例的要求，特制定本制度。1.2集團公司的衛生管理部門設在企管部，并負責將集團公司的衛生區域詳細劃分到各部室，各分公司所轄區域衛生由分公司客服部負責劃分，確保無遺漏。2衛生標準2.1室內衛生標準2.1.1地面、墻面：無灰塵、無紙屑、無痰跡、無泡泡糖等粘合物、無積水，墻角無灰吊、無蜘蛛網。2.1.2門、窗、玻璃、鏡子、柱子、電梯、樓梯、燈具等，做到明亮、無灰塵、無污跡、無粘合物，特別是玻璃

13、，要求兩面明亮。2.1.3柜臺、貨架：清潔干凈，貨架、柜臺底層及周圍無亂堆亂放現象、無灰塵、無粘合物，貨架頂部、背部和底部干凈，不存放雜物和私人物品。2.1.4購物車（筐）、直接接觸食品的售貨工具（包括刀、叉等） ：做到內外潔凈，無污垢和粘合物等。購物車（筐）要求每天營業前簡單清理，周五全面清理消毒；售貨工具要求每天消毒，并做好記錄。2.1.5商品及包裝：商品及外包裝清潔無灰塵（外包裝破損的或破舊的不得陳列）。2.1.6收款臺、服務臺、辦公櫥、存包柜：保持清潔、無灰塵，臺面和側面無灰塵、無灰吊和蜘蛛網。桌面上不得亂貼、亂畫、亂堆放物品，用具擺放有序且干凈，除當班的購物小票收款聯外，其它單據不得

14、存放在桌面上。2.1.7垃圾桶：桶內外干凈，要求營業時間隨時清理，不得溢出，每天下班前徹底清理，不得留有垃圾過夜。2.1.8窗簾：定期進行清理，要求干凈、無污漬。2.1.9吊飾：屋頂的吊飾要求無灰塵、無蜘蛛網，短期內不適用的吊飾及時清理徹底。 2.1.10內、外倉庫：半年徹底清理一次，無垃圾、無積塵、無蜘蛛網等。2.1.11室內其他附屬物及工作用具均以整潔為準，要求無灰塵、無粘合物等污垢。2.2室外衛生標準2.2.1門前衛生：地面每天班前清理，平時每一小時清理一次，每周四營業結束后有條件的用水沖洗地面（冬季可根據情況適當清理） ，墻面干凈且無亂貼亂畫。2.2.2院落衛生：院內地面衛生全天保潔，果皮箱、消防器械、護欄及配電箱等設施每周清理干凈。垃圾池周邊衛生清理徹底，不得有垃圾溢出。2.2.3綠化區衛生：做到無雜物、無紙屑、無塑料袋等垃圾。3清理程序3.1室內和門前院落等區域衛生： 每天營業前提前 10 分鐘把所管轄區域內衛生清理完畢，營業期間隨時保潔。下班后 5-10 分鐘清理桌面及衛生區域。3.2綠化區衛生：每周徹底清理一遍，隨時保持清潔無垃圾。4管理考核4