1、安徽農業科學,JournalofAnhuiAgri.Sci.2006,34(23):6145-6147,6150責任編輯孫紅忠責任校對孫紅忠日本百脈根牛兒基牛兒基氫化酶的電子克隆及進化分析李曉曉,李蕊,李雅軒,蔡民華,胡英考3(首都師范大學生命科學學院,北京100037)摘要根據物種間同源基因相對保守的特點,利用生物信息學的方法,以擬南芥牛兒基牛兒基氫化酶(GGH)基因cDNA序列為信息探針,搜索GenBank中的HTGs數據庫,找到一個與之高度匹配的日本百脈根基因組DNA序列LJT46M09,用GENSCAN軟件分析該序列得到一個包含2個外顯子和1個內含子的基因。以此基因序列BLAST檢索G

2、enBank中的est2others數據庫獲得了同源的EST片段。進行EST拼接后得到該基因的cDNA序列,GenBank登錄號為DQ013361,由1389bp核苷酸組成,具有完整的開放閱讀框架(ORF),推測編碼蛋白為462個氨基酸。推導的氨基酸序列與大豆、截形苜蓿、煙草、擬南芥、小麥、水稻的牛兒基牛兒基氫化酶基因氨基酸序列的一致率分別為91%、89%、84%、81%、73%、74%。該基因與葉綠素等的生物合成有關。關鍵詞日本百脈根;牛兒基牛兒基氫化酶(GGH);電子克隆;EST中圖分類號Q55文獻標識碼A文章編號0517-6611(2006)23-6145-03InSilicoCloni

3、ngandEvolutionAnalysisofGeranylgeranylHydrogenaseGenefromLotuscorniculatusvar.Japonicus(LiXiao2xiaoetalCollegeofLifeScience,CapitalNormalUniversity,Beijing100037)AbstractWiththedevelopmentofESTprojectsandbio2informatics,insilicocloninghasbeenanewstrategyofgenecloning.WithArabidopsisthalianaGGHcDNAse

4、quenceasaqueryingprobetosearchtheLotuscorniculatusvar.japonicusHTGsdatabase,ahighlyhomologousDNAsequence,whichwasreferredasLjT46M09clone,wasobtained.TheresultofgenepredictionwithperformingGENSCANprogramshowedthatthisgenecontained2exonsand1intron.WiththispredictedsequencetoBLASTGenBankest2othersdatab

5、ase,manyhomologousESTsequences,whichcanbeeditedauniquesequence,wasobtained,whichwasthesameasthepredictedsequencefromgenomicDNA.Thefull2lengthgeneof1389bpcontainedacompleteORF,encoding462aminoacids.ItsGenBankaccessionnumberwasDQ013361.Thededucedaminoacidshowed91%,89%,%,81%,73%and74%homologywithGGHfro

6、mGlycinemax,Medicagotruncatula,Nicotianatabacum,ArabidopsisandTriticum,respectively.ThiscDNAsequencewasconfirmedwithESTsequences.KeywordsLotuscorniculatusvar.japonicus;Geranylgeranylhydrogenase(GGH);電子克隆(insilicocloning),又稱虛(cloning),F預測基因可能的開放閱讀框架。利用軟件進行EST序列拼接。用DNAMAN軟件進行不同物的巨大運算能力,通過對EST,獲得目的基因cD

7、NA序列。在人類基因組計劃圖譜公布之后,已有很多學者利用電子克隆的方法克隆了很多人的功能基因。但是由于受到序列資料豐富度的限制,電子克隆方法在植物以及其他物種的應用尚少。隨著EST和基因組數據庫的不斷豐富和完善,利用生物信息學的方法進行植物基因的電子克隆已經成為可能。牛兒基牛兒基氫化酶(GGH),是一種存在于光合器官中的依賴NADPH的還原酶。在植物中能夠將牛兒基牛兒基二磷酸還原為葉綠醇,而葉綠醇不僅是葉綠素、生育酚和質體醌的側鏈,并且對它們結合到質體膜上起重要作用。筆者采用電子克隆的方法,以擬南芥GGH基因的cDNA序列(GenBank登錄號:BT000656)為信息探針,BLAST檢索Ge

8、nBank中的HTGs數據庫,找到與之高度同源的基因組序種間氨基酸序列比對,分析其同源性進而繪制系統發育樹。1.2電子克隆的路線和方法在GenBank的nr數據庫中檢索植物GGH基因,獲得擬南芥GGH基因cDNA序列(GenBank登錄號:BT000656)。以此為信息探針,運行BLAST程序搜索百脈根HTGs數據庫,找到一個同源性很高的百脈根基因組DNA序列。通過GENSCAN軟件對該DNA序列進行基因預測,將推測到的外顯子進行人工序列拼接,然后用此序列BLASTest2others數據庫,獲得同源的EST片段,進行EST拼接。用ORFFinder程序分析其中的開放閱讀框架,推測其編碼的氨基

9、酸序列,并與其他物種同源基因的氨基酸序列進行比較分析。2結果與分析2.1日本百脈根GGH基因序列的預測以擬南芥GGH基因cDNA序列為信息探針,通過運行BLAST程序搜索百脈根HTGs數據庫,獲得一個同源性很高的百脈根基因組DNA序列,該序列是位于百脈根第4條染色體上的克隆LJT46M09。用GENSCAN軟件對該DNA序列進行結構預測,列。通過GENSCAN軟件分析和BioEdit軟件進行序列拼接后,得到長度為1389bp的白脈根GGH基因的cDNA序列,從而成功地電子克隆了白脈根的GGH基因,該序列已在Gen2Bank中注冊,注冊號為:DQ013361。1材料與方法1.1數據庫和生物軟件美

10、國國家生物信息技術中心(NCBI)提供并維護的nr,HTGs及EST數據庫。用于分析基找到一個包含2個外顯子和1個內含子的基因(圖1),其外顯子和內含子連接區完全符合經典剪拼序列的GT.AG規則,并且在17901795bp位點存在一個AATAAA的PolyA加尾信號。預測結果還發現在89458984位存在一個可能性為100%的啟動子序列。將預測的外顯子進行拼接,用ORFFinder軟件對拼接好的序列進行分析,發現其只有一個完整的開放閱讀框架,即包含2個外顯子在內。此開放閱讀框架為1389bp,起始密碼子在1位,終止密碼子在1389位,推測其編碼的蛋白含有462個氨基酸(圖2)。由于該基因具有啟

11、動子、加尾信號等,因而認為該基因是一個客觀存在的基因。因結構的GENSCAN軟件。基金項目北京市教委科技發展計劃項目基金(200310028112)資助。作者簡介李曉曉(1980-),女,河南洛陽人,碩士研究生,研究方向:植物轉基因。3通訊作者,yingkaohu。收稿日期2006207212© 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 6146安徽農業科學2006年子克隆所得到的基因是客觀存在并且真實表達的。圖1推測的日本百脈根GGH的基因結構圖3日本百脈根G

12、GH基因的cDNA序列拼接示意2.3不同物種間GGH基因蛋白同源性比較將日本百脈根GGH基因與大豆(Glycinemax,AAD28640),截形苜蓿(Medicagotruncatula,AAX6388),煙草(Nicotianatabacum,CAA07683),擬南芥(Arabidopsisthaliana,AAN31803),小麥(Ttiticumaestivum,AAZ67145),水稻(Oryzasativa,XP2467759)6種植物進行同源性比較,發現在氨基酸水平上有很高的一致性,其中與大豆、苜蓿的一致性最高,分別達到91%和89%,這顯示了同種植物之間的親緣關系;與煙草、擬

13、南芥的一致性分別為84%和81%;與小麥、水稻的一致性略低,但也分別達到73%和74%(圖4)。利用ANGGH系統發育樹(5),大豆和截形,禾本科的小麥、水稻,十的第4分支。系統發育樹顯示該基因的同源性在親緣關系近的物種間很高,即使不同物種間該基因的同源性也是很高的,這說明GGH基因在不同物種間具有很強的保守性,它們所對應的蛋白屬于同一個蛋白家族。通過比較也可以看出它們在傳統分類和在系統發育樹上的分類基本一致。3討論隨著人類基因組計劃的深入進行,采用cDNA文庫大規模測序的策略能獲得大量表達序列標簽(EST)和較長的cDNA序列,但全長cDNA序列的獲得一直是制約新基因發現的瓶頸。采用差異顯示

14、PCR,代表性差異顯示(RDA)等技術已經發現大量具有潛在應用價值的新基因片段,但同樣面臨著全長cDNA序列難以獲得的問題。在實驗方面,或者通過篩選cDNA文庫,或者通過RACE實驗等去獲得新基因的全長cDNA序列均需要投入較大的精力,這樣利用基圖2日本百脈根GGH基因的cDNA序列與其表達的蛋白序列2.2日本百脈根GGH基因的EST拼接利用上述得到的因組資料或EST資料的電子克隆就成為功能基因克隆的新途徑。電子克隆與傳統的基因克隆方法相比因具有速度快,設備簡單,技術要求不高,針對性強等優點而日益受到關注。但在實際操作中要注意探針基因的物種與目的基因的物種親緣關系不宜太遠,否則可能給基因組結構

15、分析帶來困難。另外利用基因組信息的電子克隆有時還難以確定5和3的非編碼區,因為非編碼區往往保守性較低,有時要日本百脈根GGH基因序列作為探針對GenBank中的est2oth2ers數據庫進行BLAST檢索獲得了與之同源的18條EST,從獲得的EST中選取與探針序列同源性較高或有部分重疊的百脈根EST序列進行拼接組裝。該研究選取的是登錄號為BP046190,BP050715,CN825181,AV425826,CB829561共5個EST序列(圖3)。將前3個序列與后2個序列分別利用BioEdit軟件進行序列拼接,然后用所得的2個新序列與探靠EST數據來補充。由于受到基因組數據庫和EST數據庫

16、數量和質量的限制,電子克隆目前只能應用于基因組或EST資料非常豐富的模式植物如人、鼠和水稻等。針序列進行比對,發現相似性很高,只存在幾個堿基的不同。但探針序列的733764位,大約31個堿基在2個新序列中找不到與之對應的部分,也就是說在CN825181和AV425826兩個EST序列之間存在著一個31bp的間隙。分GGH參與生育酚(TP),葉綠醌(PQ),葉綠素(CHL)的合成途徑。TP、PQ均為抗氧化劑,能使植物抗老化和避免受到光氧化作用。而GGH作為影響TP、PQ合成的關鍵基因,可成為利用基因調控提高植物中這些化合物含量的一種有析認為這可能是由于現有的EST數據庫資料豐富度有限,沒有能夠完

17、全覆蓋該基因,但現有的EST資料足以說明電© 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 34卷23期李曉曉等日本百脈根牛兒基牛兒基氫化酶的電子克隆及進化分析6147用工具。GGH基因的表達與葉綠體的成熟程度和光合作用有關。接受光照及葉綠體含量豐富的組織該基因表達量升高;相反若將組織處于嚴寒或組織受病原菌侵染則其表達量明顯下降。編碼GGH的基因已在原核生物和一些草本植物如擬南芥和煙草中得到。圖4百脈根GGH基因蛋白序列與其他物種同源蛋白序列的比較由于受到EST數據

18、庫資料的限制,百脈根GGH基因通過EST拼接得到的序列與電子克隆的日本百脈根GGH基因cD2NA序列并未完全一致,存在31bp的缺失。但隨著EST數據庫資料的不斷豐富,完整的EST序列是可以得到的。參考文獻1GILLRW,SANSEAUP.Rapidinsilicocloningofgenesusingexpressedse2quencetags(ESTs)J.BiotechnolAnnuRev,2000,5:25-44.2OBRIENKP,TAPIA2PAEZ1,STAHLE2BACKDAHLM,etal.Characteriza2tionoffivenovelhumangenesinllq

19、132q22regionJ.BiochemBiophysResCommum,2000,273:90-94.3張德禮,孫曉靜,凌倫獎,等.人類SR蛋白超家族新成員SFRS12(SRrp508)的基因克隆和特性分析J.遺傳學報,2002,29(5):377-383.4黃驥,張紅生,曹雅君,等.一個新的水稻C2H2型鋅指蛋白cDNA的克隆與序列分析J.南京農業大學學報,2002,25(2):110-112.注:圖上線段表示進化距離。圖5植物GGH的系統發育樹該研究利用日本百脈根基因組資料并借助電子克隆技術,根據物種間同源基因的保守特性,以擬南芥的GGH基因cDNA序列為模板,對日本百脈根HTGs數據

20、庫進行同源檢索篩選并進行EST片段的拼接,從而成功獲得日本百脈根GGH基因序列。(下轉第6150頁)© 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 6150安徽農業科學2006年雙突變體根毛發育起始后經常破裂,增強了lrx1的表型,表明這2個基因在根毛發育過程中協同起作用。超微結構分析表明在雙突變體中ECM的結構受到強烈的影響,密度很低形狀不規則3。在野生型植株中過量表達AtLRX1的N端能夠引起明顯的根毛表型,這表明高度豐富的N端與內源的LRX1相互作用,產生可

21、觀察的表型。這一結論支持LRR結構域參與蛋白間相互作用的觀點。Bedinger等已經報道了番茄LePEX與1個快速堿化因子(rapidalkalinisationfactor,RALF)花粉中特異表達的LRX基因(PEX2)的T2DNA插入純合突變體,具有較明顯的表型,植株矮小,結種數量少,該基因確切的生物學功能有待進一步驗證。參考文獻1RUBINSTEINAL,BROADWATERAH,LOWREYKB,etal.PEX1,apollen2specificgenewithanextensin2likedomainJ.ProcNatlAcadSciUSA,1995,92:3086-3090.2

22、BAUMBERGERN,RINGLIC,KELLERB.Thechimericleucine2richrepeat/extensincellwallproteinLRX1isrequiredforroothairmorphogenesisinAra2bidopsisthalianaJ.GenesDev,2001,15:1128-1139.3BAUMBERGERN,STEINERM,RYSERU,etal.SynergisticinteractionofthetwoparalogousArabidopsisgenesLRX1andLRX2incellwallformationduringroot

23、hairdevelopmentJ.ThePlantJournal,2003,35:71-81.4NIELSENH,ENGELBRECHTJ,BRUNAKS,etal.AneuralnetworkmethodforidentificationofprokaryoticandeukaryoticpeptidesandpredictionoftheircleavagesitesJ.IntJNeuralSys,1997,8:581-599.5SHIUSH,BLEECKERAB.Receptor2likekinasesfromArabidopsisformamonophyleticgenefamilyr

24、elatedtoanimalreceptorkinasesJ.ProcNatlAcadSciUSA,2001,98:10763-10768.6CLARKSE,WILLIAMSRW,MEYEROWITZEM.TheCLAVATA1geneen2codesaputativereceptorkinasethatcontrolsshootandfloralmeristemsizeinArabidopsisJ.Cell,1997,89:575-585.7JIMMTL,STONEJM,WALKERJC.HAESA,anArabidopsisleucine2richrepeatreceptorkinase,

25、controlsfloralorganabscissionJ.GenesDev,2000,14:108-117.8CARPITANC,GIBEAUTDM.Smodelsofprimarycellwallsin:ofstructurewiththephysicalprop2J,1993,3:1-30.HQ,C.2richglycoproteinembryodevelopmentinArabidopsisJ.Plant161-1172.AL,BROADWATERAH,LOWERYKB,etal.PEX1,apollen2specificgenewithanextensin2likedomainJ.

26、ProcNatlAcadSciUSA,1995,92:3086-3090.11NICOLASBAUMBERGER,BRIGITTEDOESSEGER,ROMAINGUYOT,etal.Whole2genomecomparisonofleucine2richrepeatextensinsinAra2bidopsisandrice.aconservedfamilyofcellwallproteinsformavegetativeandareproductivecladeJ.PlantPhysiol,2003,131:1313-1326.12KAJAVAAV.Structuraldiversityo

27、fleucine2richrepeatproteinsJ.JMolBiol,1998,277:519-527.13PARAGEORGIOUSAC,SHAPIROR,ACHARYAKR.Molecularrecog2nitionofhumanangiogeninbyplacentralribonucleaseinhibitor:anX2raycrystallographicstudyat2.02angstromresolutionJ.EMBOJ,1997,16:5162-5177.14KOBEB,DEISENHOFERJ.Astructuralbasisoftheinteractionsbetw

28、eenleucine2richrepeatsandproteinligandsJ.Nature,1995,374:183-186.15KIELISZEWSKIMJ,LAMPORTDT.Extensin:repetitivemotifs,func2tionalsites,posttranslationalcodes,andphylogenyJ.PlantJ,1994,5:157-172.16CASSABGL.PlantcellproteinsJ.AnnuRevPlantPhysiol,1998,49:281-309.17ROBERTSK.IncreasedextensinlevelsinArab

29、idopsisaffectinflorescencestemthickeningandheightJ.JournalofExperimentalBotany,2006,57:537-545.18ARABIDOPSISGENOMEINITIATIVE.AnalysisofthegenomesequenceofthefloweringplantArabidopsisthalianaJ.Nature,2000,408:796-815.19RINGLIC.TheroleofextracellularLRXproteinincellwallformationJ.PlantBiosystem,2005,1

30、:32-35.20ANOUCKD.TheArabidopsisroothaircellwallformationmutantlrx1issuppressedbymutationsintheRHM1geneencodingaUDP2L2RhamnosesynthaseJ.PlantCellPhysiol,2004,45(6):734-741.蛋白相互作用。RALF蛋白是大約為5kDa大小的細胞外多肽,在激活番茄懸浮細胞快速堿化過程第1次被發現。因此,LeP2EX1可能是信號分子的受體19。鑒于LRX蛋白家族的保守作用,其他蛋白應該也有相似的功能,但有待于證明。瑞士蘇黎世大學的植物生物學研究室用E

31、MS誘變Atl2rx1突變體,鑒定了許多rol(Atlrx1抑制子)株系能夠克服LRX1缺失所造成的影響,產生野生型相同的表型。這種抑制子篩選方法可以很好的鑒定體內基因產物功能關系。目前在對rol突變體進行詳細分析并通過圖譜克隆來分離rol基因。用相同的方法也鑒定了許多enl(Atlrx1增強子)株系,它們增強了Atlrx1表型20。比較玉米、番茄、煙草或擬南芥中的PEX,PEX用,的作用。但LRX,因此細胞基質不同LRX可能具有不同的功能。除了在細胞增大中起作用,LRX可能在分化過程中修飾所處的細胞壁區域,例如,AtL2RX3和AtLRX4在維管組織里表達,可能與木質部導管的成熟有關,也就是

32、與木質部導管兩端細胞壁消失有關。5小結筆者簡要介紹了擬南芥LRX家族基因表達的組織特異性及其轉錄產物的特性及最近研究狀況。通過LRX1發現其直接參與了細胞壁的形成;通過Zmpex1發現在花粉中PEX蛋白也有作為與雌蕊結合子相互作用的識別因子。但目前還不知道LRX蛋白是通過調節酶活性還是通過轉導信號來參與細胞壁的形成,是否建立細胞質膜和細胞壁統一體的集聯,是否所有的LRX蛋白都定位在細胞壁一個特別的位置,與他們相互作用的分子是什么?有許多問題有待進一步研究。目前,瑞士蘇黎世大學的植物生物學研究室正在進行一些擬南芥LRX基因功能、與LRX蛋白相互作用的蛋白及其作用途徑的研究,研究主要集中在營養器官表達特別是在根中特異表達的LRX基因功能方面;筆者已得到擬南芥(上接第6147頁)5唐向榮,吳昊,賈明,等.水稻雙鏈RNA結合蛋白同源基因OsRBP的克隆及其表達的分析J.植物生理與分子生物學學報,2002,28(1):41-45.6BOLLIVARDW,WA