1、第二章 基因工程制藥2.4 基因工程菌生長代謝的特點一、 比生長速率(h-1) 細胞生長速率rX ：單位時間內細胞濃度的變化（ g/Lh） 。 X為細胞濃度，通常用單位體積培養液中所含細胞（或稱菌體）的干燥質量（dry cell weight，DCW）表示（g/L, g DCW /L ）。 培養過程中，細胞的生長速率與細胞濃度成正比。XdtdXrx2g/L4g/L10g/L20g/L生長速率rX ：單位時間內細胞濃度的變化（ g/Lh） 2 g/Lh 10 g/Lh 1 h-1 1 h-11h為比生長速率(h-1) ，表示單位濃度細胞的生長速率。二、 乙酸的產生 大腸桿菌在較高的比生長速率下會

2、產生乙酸，高濃度的乙酸會抑制菌體生長和蛋白表達。 控制菌體生長可控制乙酸產生。XdtdXXrx2.5 基因工程菌的穩定性一、 質粒的不穩定性（1）分裂不穩定性 工程菌分裂時出現一定比例不含質粒的子代菌。 相關因素：n 質粒的丟失率（宿主菌、質粒特性和培養條件）n 含質粒菌與不含質粒菌的生長速度差異（2）結構不穩定 DNA從質粒上丟失、質粒上序列發生重排等。二、 提高質粒穩定性的方法1. 選擇合適的宿主菌株2. 選擇合適的載體 低拷貝數質粒丟失的頻率較大 含高拷貝數質粒的菌比生長速度明顯低于不含質粒菌。3. 加入抗生素二、 提高質粒穩定性的方法4. 分階段培養 表達水平越高，重組質粒越不穩定。

3、二階段培養： 第一階段 菌體生長 第二階段 誘導表達5. 控制培養條件 高比生長速率下質粒穩定性明顯增加。 培養基成分、溫度等培養條件對質粒穩定性也有影響。6. 固定化 固定化適用于分泌表達的蛋白，對非分泌表達蛋白難以大規模采用。2.6 基因工程菌的發酵一、 基因工程菌的培養方式1、分批培養（batch culture） 培養基和細胞一次性加入反應器進行培養。 細胞所處的培養環境時刻變化，細胞不是處在最優的培養條件下培養。 操作簡單。2、流加培養（補料分批培養，fed-batch culture） 在細胞分批培養的過程中補加培養基或營養物質的培養方式，培養結束后一齊取出。 可采用不同補料方式，

4、如恒速流加、變速流加、指數流加等。葡萄糖葡萄糖菌體濃度菌體濃度OD乙酸乙酸重組重組蛋白蛋白3、 連續培養（continuous culture） 培養開始時為分批培養，培養至一定程度后，連續不斷的補加新鮮培養基同時排出等量培養液。 一定時間后，細胞濃度和培養基中各種物質濃度均保持不變。 基因工程菌不穩定，很難連續培養。4、透析培養（dialysis culture） 通過透析除去乙酸。 E.coli HB101(pPAKS2)生產青霉素酰化酶提高11倍。5、 固定化培養（immobilized culture） 質粒穩定，便于連續，適用于分泌表達。二、 基因工程菌的培養工藝1、培養基的影響 碳

5、源：葡萄糖、甘油、乳糖、果糖等。 氮源、無機鹽等其他成分。 通過單因子實驗、正交設計等方法優化培養基組成，提高蛋白表達水平。2、接種量的影響 接種量小，延遲期長，菌容易老化，不利于蛋白表達。 較大的接種量延遲期短，適于蛋白表達。 接種量一般為515。3、溫度的影響 溫度對基因表達的調控機理很復雜，對不同蛋白，最佳的誘導表達溫度不同。4、溶氧（dissolved oxygen，DO ）的影響 較高水平的DO（大于1030）的有利于蛋白表達，供氧不足，產生乙酸。 加大攪拌、增加氣流、提高氧分壓、提高罐壓。 控制糖源的流加速度。 恒溶氧發酵：通過以上手段控制DO在一恒定值。5、pH的影響 流加酸、堿

6、調節pH。 pH一般控制在6.87.6，少數例外。6、誘導時機的影響 一般在對數生長期進行誘導表達。分批發酵不同生長階段加1mM IPTG誘導表達后的生長曲線正三角（對數早期） 倒三角（對數中期） 菱形（對數晚期） 圓形（不加誘導）對數早期對數早期對數中期對數中期對數晚期對數晚期不誘導不誘導三、高密度發酵 理論上計算大腸桿菌發酵所能達到的最高菌體密度（干重）為400g/L，一般認為最高的發酵密度（干重）為200g/L。 目前培養所達到的最高密度是175 g/L 。 高密度發酵的成功關鍵是補料策略。 乙酸的積累是高密度培養生產重組蛋白質的一個主要問題是。 三、高密度發酵 工藝上對策：工藝上對策：

7、 在發酵工藝上常通過改變培養基組成（以在發酵工藝上常通過改變培養基組成（以甘油甘油為初為初始碳源）始碳源） 降低培養溫度降低培養溫度 限制性流加葡萄糖限制性流加葡萄糖 提高供氧能力（加強攪拌、提高氧分壓、提高罐提高供氧能力（加強攪拌、提高氧分壓、提高罐壓）壓）三、高密度發酵 菌種上對策：菌種上對策：n阻斷E. coli乙酸產生：敲除磷酸轉乙酰酶基因（pta1）和乙酸激酶（ack）的基因；n改變代謝流方法：導入丙酮酸脫羧酶基因pdc1和乙醇脫氫酶adh2，丙酮酸生成乙醇；n限制葡萄糖攝取主要途徑（磷酸轉移系統），同時還需加強其他葡萄糖攝取途徑；n引入血紅蛋白基因2.7 基因工程藥物的分離純化一、

8、 分離純化的基本過程發酵液發酵液細胞細胞固固-液分離液分離溶液溶液細胞破碎細胞破碎包涵體包涵體溶解溶解復性復性濃縮濃縮粗分離粗分離純化與精制純化與精制制劑制劑產品產品胞外產物胞內產物固固-液分離液分離 溶液溶液 細胞碎片細胞碎片2.7 基因工程藥物的分離純化二、 建立分離純化工藝需了解的因素1、起始物料的特點、起始物料的特點 菌種類型、蛋白的表達部位、菌種類型、蛋白的表達部位、 產物濃度等。產物濃度等。2、目的產物特性（各種物理化學性質、穩定性）、目的產物特性（各種物理化學性質、穩定性）3、雜質的種類和性質雜質的種類和性質4、產品質量的要求、產品質量的要求 準許存在的雜質種類和最低含量、純度、

9、比活等。準許存在的雜質種類和最低含量、純度、比活等。三、 細胞破碎n物理方法 珠磨、高壓勻漿、超聲波破碎、勻漿、凍融、低滲裂解、研磨等n化學方法 有機溶劑（甲苯、丙酮等）、表面活性劑等。n 生物方法 酶法：溶菌酶、葡聚糖酶、溶壁酶等； 自溶：一定pH和溫度；一般采用加熱法，自溶時間較長。 5070MPa450m/s四、 固液分離 胞外蛋白：離心 包含體：離心、低速離心 胞內蛋白：去除細胞碎片 高速離心、微濾（0.110um）、 雙水相萃取（PEG-Dextran、 PEG-鹽系統）、絮凝、膨脹床吸附 五、分離純化方法 主要為各種層析方法： 離子交換層析、凝膠過濾、疏水層析、親和層析 超濾 六、

10、非蛋白類雜質的去除nDNA（離子交換、疏水層析等）n熱原（脂多糖，超濾、陰離子交換、疏水層析、多黏菌素B親和層析）n病毒病毒（紫外線照射、（紫外線照射、40nm膜過濾）膜過濾） 七、選擇分離純化方法的依據n根據產物表達形式來選擇根據產物表達形式來選擇 分泌表達（超濾、沉淀）分泌表達（超濾、沉淀） 胞內可溶表達（親和層析、離子交換）胞內可溶表達（親和層析、離子交換） 周質腔表達（溶菌酶處理后滲透壓休克）周質腔表達（溶菌酶處理后滲透壓休克） 包含體（離心回收）包含體（離心回收） 七、選擇分離純化方法的依據n根據分離單元之間的銜接選擇根據分離單元之間的銜接選擇 初步純化（超濾、沉淀；濃縮、去主要雜質

11、）初步純化（超濾、沉淀；濃縮、去主要雜質） 高分辯率高分辯率純化（親和層析、離子交換等色譜方式）純化（親和層析、離子交換等色譜方式） 色譜之間的分離次序：色譜之間的分離次序： 鹽析沉淀、離子交換后可直接采用疏水色譜鹽析沉淀、離子交換后可直接采用疏水色譜 親和層析通常放在第二步純化之后親和層析通常放在第二步純化之后 凝膠過濾通常放在最后（容量小、可更換緩沖）凝膠過濾通常放在最后（容量小、可更換緩沖）n根據分離純化工藝的要求來選擇根據分離純化工藝的要求來選擇 具有良好的穩定性和重復性具有良好的穩定性和重復性 純化步驟盡可能少，時間盡可能短等。純化步驟盡可能少，時間盡可能短等。2.8、包含體的復性

12、外源基因在大腸桿菌中高水平表達時通常會形成一外源基因在大腸桿菌中高水平表達時通常會形成一種由目的蛋白構成的不溶的、無活性的蛋白聚集體即包種由目的蛋白構成的不溶的、無活性的蛋白聚集體即包含體（含體（Inclusion Body） 包含體內約包含體內約90%的成分是蛋白質，的成分是蛋白質，目的蛋白占目的蛋白占50以上。以上。一、包含體表達的優點一、包含體表達的優點n表達量高表達量高n密度高（密度高（1.2-1.4g/mL之間之間 ），容易分離），容易分離n抗蛋白酶抗蛋白酶n對宿主毒性小對宿主毒性小二、包含體蛋白處理過程二、包含體蛋白處理過程細胞破碎細胞破碎包涵體分離包涵體分離包涵體溶解包涵體溶解目

13、的產物的復性目的產物的復性變性條件下純化變性條件下純化包涵體洗滌包涵體洗滌三、包含體的復性方法方法： 1. 稀釋復性 2. 透析復性 3. 層析復性影響復性的操作參數：蛋白濃度、溫度、pH、離子強度。提高蛋白復性率的策略：n復性添加劑如PEG、表面活性劑n分子伴侶常用半胱氨酸之間形成二硫鍵方法： 1. 空氣氧化法 在堿性條件下通空氣，氧化時可以加入二價銅離子加快反應速度，能夠取得更好的效果，缺點是不易控制氧化還原電勢，而且二硫鍵的氧化形成速度慢； 2.氧化還原對重排體系 常用氧化還原對有氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽和胱氨酸/半胱氨酸，通過調整氧化還原兩種物質的比例可以控制較精確的氧化還原電勢

14、，對二硫鍵反應進行控制，其二硫鍵形成速率快于空氣氧化法。 P-SH + R-S-S-R P-S-S-R + R-SH P-S-S-R + P-SH P-S-S-P + R-SH2.9 基因工程藥物的質量控制 生物材料、培養過程、純化過程、產品的質量控制。生物材料、培養過程、純化過程、產品的質量控制。 目標產品的質量控制：目標產品的質量控制：產品的鑒別、純度、活性、安產品的鑒別、純度、活性、安全性、穩定性、一致性。全性、穩定性、一致性。1.生物活性測定 活性、比活2.產品的鑒定（1）相對分子量 SDS-PAGE、凝膠過濾，允許10%誤差。 必要時采用質譜準確測定。（2）等電點 等電聚焦測定，等電

15、點常不均一，每批測定結果應一致。（3）紫外吸收光譜 特征型吸收，每批一致（4）氨基酸序列測定 送檢中試頭三批產品，N端15個氨基酸序列，C端13個氨基酸殘基。（5）氨基酸組成分析（6）免疫印跡（western blot）（7）圓二色光譜（8）肽圖 一般用胰蛋白酶或CNBr裂解，再用RP-HPLC或SDS-PAGE分析（9）二硫鍵分析3.蛋白純度分析 必須采用非還原SDS-PAGE和HPLC進行檢定，其他檢測方法包括CE（毛細管電泳）等。4.雜質檢測（1）內毒素(脂多糖) 家兔法、鱟試劑法（2）宿主細胞蛋白 免疫分析（3）宿主細胞殘余DNA 核酸雜交，100pg/劑量（4）細菌、酵母、真菌、支原

16、體、病毒 微生物學方法（5）其他物質 抗生素 牛血清 采用了抗體親和層析，檢測小鼠IgG含量。5.穩定性檢測 在不同溫度下保存，定期取樣檢測生物活性及其他特性的變化。6.一致性 各批次產品均符合標準規格。產品的保存：n液態保存 低溫： -20、 -80和液氮、短期4 穩定的pH 高濃度 加保護劑：糖類、脂類、蛋白類、還原劑（二硫蘇糖醇）等n固體保存 含水量5%以下， 4長期保存 冷凍干燥 凍干過程中加保護劑：低分子化合物（葡萄糖、蔗糖等）、高分子物質（糊精、血清）基因工程藥物制造實例基因工程藥物制造實例 自學自學第二章第二章 基因工程制藥基因工程制藥1.寫出基因工程的基本要素及制備基因工程藥物的基本寫出基因工程的基本要素及制備基因工程藥物的基本過程。過程。2.列出列出4種獲取目的基因的方式。種獲取目的基因的方式。3.了解常用的外源基因表達系統。了解常用的外源基因表達系統。4.寫出大腸桿菌表達系統的優勢和缺點。寫出大腸桿菌表達系