1、可注射的生物可降解的透明質(zhì)酸酪胺交聯(lián)水凝膠的藥物控制釋放和組織工程Motoichi Kurisawa,*a Joo Eun Chung,a Yi Yan Yang,a Shu Jun Gaoa and Hiroshi Uyamab接收于2005年5月19日（英國(guó)劍橋大學(xué)），2005年6月29日接受首次是在2005年7月28日以預(yù)發(fā)表文章的形式公開(kāi)在網(wǎng)絡(luò)上DOI號(hào)：10.1039/b506989k連續(xù)注射透明質(zhì)酸酪胺結(jié)合物和酶在體內(nèi)通過(guò)酶的誘導(dǎo)氧化偶聯(lián)形成可生物降解水凝膠，是一種很有前途和潛力的作為藥物控釋和組織工程生物材料。水凝膠被廣泛應(yīng)用于生物活性分子的控制釋放和細(xì)胞的封裝。1 尤其是水凝膠

2、用作組織工程的骨架材料是實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)組織修復(fù)、再生的一種很有前景的方法。然而，到目前為止大部分水凝膠都需要外科手術(shù)植入，那樣的話將導(dǎo)致組織排異反應(yīng)和組織損壞。2 因此，可注射的原位形成凝膠的聚合物水凝膠體系的發(fā)展得到了很多的關(guān)注。3 理想的情況下，可注射的體系應(yīng)形成的水凝膠應(yīng)該在一個(gè)狹窄的生理上可接受的溫度范圍內(nèi)，并且是以一個(gè)足夠快的速率注入。4 此外，所用的試劑必須是無(wú)毒的，而且形成的水凝膠在疾病治愈后和或組織再生完成后是可以降解的。為了避免有毒交聯(lián)試劑的使用，物理交聯(lián)水凝膠被設(shè)計(jì)成為運(yùn)用聚合物鏈之間的離子反應(yīng)和采用溶液凝膠兩親性嵌段共聚物。2,5 化學(xué)交聯(lián)法用于合成機(jī)械穩(wěn)定性和對(duì)生物可降解

3、性的控制的水凝膠是一種很多變的方法。然而，這種方法用于可注射的體系卻是不適用的，因?yàn)橛卸净瘜W(xué)試劑經(jīng)常被用于水凝膠的合成從而導(dǎo)致生物活性分子例如生長(zhǎng)因子和細(xì)胞的一些不良反應(yīng)。在這項(xiàng)研究中，我們提出了一個(gè)簡(jiǎn)單的生物相容的原位凝膠形成體系，它由透明質(zhì)酸酪胺（HA-Tyr）偶聯(lián)物（方案1）在過(guò)氧化酶催化氧化反應(yīng)下形成，其中還涉及一些生物合成途徑像黑色素的形成。水凝膠在活體中通過(guò)注射器注入兩種溶液而形成，（）HA-Tyr溶液含有H2O2作為辣根過(guò)氧化酶（HRP）的氧化劑加上（）HRP作為一種模型催化劑，引發(fā)一部分苯環(huán)上的氧化偶聯(lián)反應(yīng)（方案2）。HA是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的一種主要成分，是一種由重復(fù)的二糖

4、單元（-1,4-D-葡萄糖醛酸和-1,3-N-乙酰基-D-葡萄糖胺）組成的粘多糖。6 我們將HA作為水凝膠的骨架高聚物是由于其具有良好的生物相容性和生物可降解性。7 因此，這種新型凝膠形成體系通過(guò)生物活性試劑的載入使我們形成的水凝膠沒(méi)有任何炎癥反應(yīng)和任何多余的反應(yīng)。我們相信一種很有前景的高效藥物治療和組織再生方式是在活體內(nèi)通過(guò)酶導(dǎo)介交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠形成的。HA-Tyr偶聯(lián)物方案1 HA-Tyr偶聯(lián)物的合成 HA-Tyr偶聯(lián)物 HA-Tyr水凝膠 方案2 通過(guò)酶催化氧化導(dǎo)介交聯(lián)HA-Tyr偶聯(lián)物原位凝膠聚合成聚合物水凝膠在此，我們報(bào)道了由透明質(zhì)酸和酪胺通過(guò)辣根過(guò)氧化酶的在體外或體內(nèi)的酶觸反應(yīng)而形

5、成的水凝膠，并且由于水凝膠的生物可降解性而發(fā)展成為具有藥物控釋和組織工程功效的理想注射體系。透明質(zhì)酸酪胺偶聯(lián)物是在蒸餾水中通過(guò)一種普通的碳化二胺和活性酯導(dǎo)介偶聯(lián)反應(yīng)8而成功合成的。 從1 H 核磁共振譜圖中可以發(fā)現(xiàn)每100個(gè)透明質(zhì)酸重復(fù)單元中有9個(gè)酪胺分子。透明質(zhì)酸酪胺水凝膠是在H2O2和HRP作用下使一部分的酪胺發(fā)生催化氧化反應(yīng)而合成的。過(guò)氧化酶是經(jīng)常在溫和的反應(yīng)條件下用作苯酚及其衍生物的氧化耦合反應(yīng)的催化劑。9 像方案2所顯示的，過(guò)氧化酶的氧化偶聯(lián)反應(yīng)是在苯酚與苯酚之間形成C-C鍵和 C-O 鍵。圖1顯示了凝膠時(shí)間和催化劑（H2O2 和 HRP）濃度之間的依賴關(guān)系。在圖1a中顯示的是凝膠時(shí)

6、間是隨著H2O2的濃度是增加而增加的。另外，當(dāng)雙氧水的濃度在2.4-20mmol/L之間的凝膠時(shí)間幾乎是常數(shù)。同時(shí)，不僅是當(dāng)H2O2的濃度為0mmol/L時(shí)觀察不到凝膠的形成而且當(dāng)H2O2的濃度大于100mmol/L時(shí)也觀察不到凝膠的形成，其原因是過(guò)度的氧化作用。相反的是，在圖1b 中顯示的是凝膠時(shí)間隨HRP 濃度的增加而減少，而且當(dāng)HRP 濃度大于1.25 份每毫升時(shí)凝膠時(shí)間幾乎是常數(shù)。而且凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和凝膠時(shí)間有關(guān)：更短時(shí)間內(nèi)形成的凝膠具有更好的機(jī)械強(qiáng)度（數(shù)據(jù)未顯示）。基于這些情況，凝膠強(qiáng)度和凝膠時(shí)間一樣可以通過(guò)改變H2O2和HRP 的濃度來(lái)控制。凝膠是在1.25份每毫升的HRP 和2.

7、4mmol/L的H2O2催化劑作用下20秒形成的。圖1 HA-Tyr水凝膠凝膠時(shí)間和催化劑濃度的關(guān)系。a) 1.25份每毫升的HRP的情況下H2O2的影響；b) 2.4mmol/L的H2O2的情況下HRP的影響。如圖2 所示，我們對(duì)水凝膠(規(guī)格為 20´20´1.2 mm)的體外酶觸降解反應(yīng)進(jìn)行了測(cè)試，我們以重量損失方面作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。以不同濃度的透明質(zhì)酸(0，10，25，50和100份每毫升)來(lái)研究水凝膠的降解過(guò)程，作為體內(nèi)酶水解透明質(zhì)酸鏈的模擬。§ 所有水凝膠在透明質(zhì)酸酶作用下都能完全降解，而單獨(dú)在PBS緩沖液中培養(yǎng)的陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)形成的水凝膠卻觀察不到重量的變化

8、。圖2 在體外37oC下的PBS緩沖液中HA-Tyr水凝膠的酶觸降解情況。透明質(zhì)酸酶濃度：，100份每毫升；，50份每毫升；，25份每毫升；，10份每毫升；，0份每毫升。水凝膠的降解速率(B)可以從下式中估算： B=h/2t (1)式中h 表示開(kāi)始時(shí)板坯的厚度，t表示完全降解所需的時(shí)間。這個(gè)方程式基于降解是發(fā)生在板坯的兩面而不是左右邊緣的假設(shè)的。降解速率隨著透明質(zhì)酸酶濃度的增加而增加。透明質(zhì)酸酶濃度從0，2.5，10，25和50 份每毫升的增加引起降解速率分別為0，1.8，2.3，4.1和5.5´ 106 cm/s。而且這些水凝膠重量的減少時(shí)隨時(shí)間線性發(fā)生的，表明降解過(guò)程僅由表面侵蝕

9、而產(chǎn)生。10 就希望這種表面控制降解的水凝膠可以達(dá)到對(duì)生物活性分子的緩釋作用，例如蛋白質(zhì)可以通過(guò)這種表面降解而釋放。為了研究水凝膠的體內(nèi)形成和降解情況，對(duì)小鼠進(jìn)行HA-Tyr 的皮下注入給藥并且不加入H2O2/HRP(表1)。¶ 使用四種注射方式：()注射器A(HA-Tyr +H2O2)+注射器B(HRP)，()注射器A(HA-Tyr)，()注射器A(HA-Tyr)+注射器B(HRP)，()注射器A(HA-Tyr +H2O2)。圖3a 表明小鼠體內(nèi)注射1天后收集到的水凝膠的情況。由注射體系()：注射器A(HA-Tyr +H2O2)+注射器B(HRP)形成的水凝膠具有最高的機(jī)械強(qiáng)度；其

10、他的機(jī)械強(qiáng)度為()>()()>()。這種結(jié)果表明H2O2和HRP的協(xié)同效應(yīng)和足夠高的濃度的共存性影響著HA-Tyr水凝膠的交聯(lián)效果。有趣的是僅僅注射HA-Tyr溶液也可以形成水凝膠，表明氧化偶聯(lián)反應(yīng)在很少量的H2O2和過(guò)氧化酶的存在下甚至是在沒(méi)有注射H2O2和HRP的生理?xiàng)l件下也能夠進(jìn)行。這些不僅是在可以觀察到炎癥或刺激的組織，而是通過(guò)這四種注射方式的部位都可以形成這種原位凝膠形成體系。 表1 注射溶液的成分a注射體系 注射器A 注射器B HA-Tyr +H2O2 HRP HA-Tyr HA-Tyr HRP HA-Tyr +H2O2 a透明質(zhì)酸酪胺偶聯(lián)物和酶通過(guò)兩種不同的注射器連續(xù)

11、的注入圖3 水凝膠在體內(nèi)的形成和降解情況。a) HA-Tyr水凝膠在體內(nèi)的形成情況。b) 由不同的注射溶液形成的水凝膠在體內(nèi)的降解情況： ，注射器A(HA-Tyr +H2O2)+注射器B(HRP)；，注射器A(HA-Tyr)；，注射器A(HA-Tyr)+注射器B(HRP)；，注射器A(HA-Tyr +H2O2)。如圖3b所示，水凝膠在生物體內(nèi)的降解能力取決于注射溶液的組成。超過(guò)一個(gè)月后同時(shí)使用了HRP和H2O2而形成的水凝膠的重量在逐漸的減少，相比之下其他的水凝膠則快速的降解。這就被認(rèn)為是水凝膠的交聯(lián)程度的不同而影響其降解能力。這些結(jié)論即將要被實(shí)際得到證實(shí)，試圖達(dá)到最佳的藥物治療效果和組織再生

12、而對(duì)水凝膠的降解能力進(jìn)行控制是很有必要的。總之，一個(gè)簡(jiǎn)單無(wú)毒可注射的原位水凝膠體系通過(guò)一種生物合成途徑酶導(dǎo)介氧化交聯(lián)反應(yīng)而得以實(shí)現(xiàn)。這種很方便的生物相容性好的可注射的原位水凝膠形成體系通過(guò)控制釋放生物活性分子和或細(xì)胞而控制藥物釋放和組織再生具有很大的優(yōu)勢(shì)。本研究由新加坡科學(xué)技術(shù)研究院基金支持。我們非常感謝日本智索株式會(huì)社所提供的透明質(zhì)酸和Cindy Ren女士以及她的寶貴建議。注解和參考文獻(xiàn) HA-Tyr是通過(guò)以下的大體步驟合成的。HA(0.5g，1.25mmol；800kDa)溶解在100ml蒸餾水中。再在這溶液中加入酪胺鹽酸鹽(4.68g，27.0mmol)。反應(yīng)混合溶液的pH通過(guò)加入0.

13、1M NaOH調(diào)整到6.8。1-乙基-3-3-(二甲基胺)丙基碳化二亞胺(EDC) (0.995g，5mmol)和1-羥基苯并三唑(HOBT) (0.675g，5mmol)在DMSO/蒸餾水(1:1，10 ml)。混合后反應(yīng)液的pH維持在6.8。反應(yīng)液在緩慢的攪拌下室溫保持48小時(shí)。混合液需要通過(guò)滲析純化（除去分子量為3500以下的分子）。讓剩余液凍干形成HA-Tyr（產(chǎn)量95%）。1 H 核磁共振譜（D2O）為： 1.9(s，C(-O)CH3)，2.6 2.8(br，ArCH2CH2)，6.7 7.2(br，Ar)。 Jeong等11報(bào)道了水凝膠的凝膠時(shí)間是由反向試管測(cè)試方法決定的。HA-T

14、yr(50 mg)被溶解在一小瓶的PBS（磷酸鹽緩沖液，pH為7.4）中。新配制的不同濃度的HRP和H2O2溶液加入小瓶中緩慢的混勻。在瓶中的反向溶液中觀察不到流動(dòng)則表明凝膠的形成。對(duì)于體外的降解實(shí)驗(yàn)，需要將含有HRP和H2O2的HA-Tyr溶液注入一個(gè)板坯中，板坯在上下兩邊都覆蓋有玻璃平板的墊片上。反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)生的水凝膠置于充足的蒸餾水中以除去沒(méi)有反應(yīng)的物質(zhì)，并使水凝膠溶脹蒸餾水。§ 將HA水凝膠（規(guī)格為20´20´1.2 mm）沉浸在100ml的PBS緩沖液中，并加入透明質(zhì)酸酶，混合物在37oC條件下攪拌。水凝膠的降解程度由剩余的凝膠重量來(lái)估算。¶

15、; 執(zhí)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的依據(jù)是國(guó)際動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究準(zhǔn)則。BALB/c小鼠由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，是出生于新加坡國(guó)立大學(xué)的動(dòng)物控股公司的6-8周大的小鼠。HA-Tyr（10mg/ml）被溶解于含有70 mmol/L H2O2的PBS緩沖液中，然后將0.5ml的該溶液通過(guò)22規(guī)格的注射器對(duì)小鼠進(jìn)行皮下注射，接下來(lái)用27規(guī)格的注射器注入濃度為0.25mg/ml的HRP溶液50l。1 Y. Qiu and K. Park, Adv. Drug. Delivery Rev., 2001, 53, 321; A. Kikuchi and T. Okano, Adv. Drug. Delivery Rev., 2002,

16、 54, 53; Y. Tachibana, M. Kurisawa, H. Uyama, T. Kakuchi and S. Kobayashi, Chem. Commun., 2003, 106; M. Kimura, K. Fukumoto, J. Watanabe and K. Isihara, J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 2004, 15, 631.2 B. Jeong, Y. H. Bae, D. S. Lee and S. W. Kim, Nature, 1997, 388, 860.3 R. Langer, Science, 1990, 249,

17、 1527; A. Hatefi and B. Amsden, J. Controlled Release, 2002, 80, 9.4 X. Z. Shu, Y. Liu, F. S. Palumbo, Y. Luo and G. D. Prestwitch, Biomaterials, 2004, 25, 1339.5 Hoffman, Adv. Drug Delivery Rev., 2002, 43, 3.6 T. C. Laurent and J. R. Fraser, FASEB J., 1992, 6, 2397.7 J. E. Scott, J. Anat., 1995, 187, 259.8 P. Bulpitt and D. Aeschlimann, J. Biomed. Mater. Res., 1999, 47, 152.9 S. Koba