1、木犀草素對骨肉瘤的抑制效應及其機制研究【摘要】目的：研究木犀草素對骨肉瘤的抑制效應及其機制；方法：以1.25g/L、2.5g/L、5g/L、10g/L的木犀草素溶液對骨肉瘤MG-63細胞行劃痕實驗、侵襲實驗、免疫印跡實驗，并觀察經不同濃度木犀草素溶液培養后骨肉瘤MG-63細胞形態；結果：木犀草素對于骨肉瘤MG-63細胞的生長、增值、運動遷移能力、穿膜細胞數量、IL-6蛋白表達水平均有一定的抑制作用，并且其抑制作用隨著木犀草素濃度的增加而逐漸增加；結論：一定濃度的木犀草素對于骨肉瘤MG-63細胞具有極強的抑制作用，值得應用于臨床骨肉瘤的治療。【關鍵詞】木犀草素；骨肉瘤；抑制效應；機制the me

2、chanism of inhibitory effect of luteolin on osteosarcomaAbstract Objective: inhibitory effect on human osteosarcoma and its mechanism of luteolin; methods: 1.25g/L、2.5g/L、5g/L、10g/L luteolin solution on osteosarcoma MG-63 cell line scratch test, invasion assay, Western blot, and observe the differen

3、t concentration of mignonette fibroin solution cultured osteosarcoma MG-63 cell morphology; results: luteolin for osteosarcoma MG-63 cell growth, proliferation, movement ability, transmembrane cell number, the expression level of IL-6 protein was inhibited, and the inhibition increased with the incr

4、ease of luteolin concentration increases gradually; conclusion: a certain concentration of luteolin has a strong inhibitory effect on human osteosarcoma MG-63 cells, treatment is applied to clinical osteosarcoma.keyword luteolin; osteosarcoma; inhibitory effect; mechanism骨肉瘤是臨床相對常見的惡性腫瘤，多發于少兒或青少年，該病

5、預后不良，相當多的患者因患上該病而死亡1。近幾年來，隨著保肢手術的不斷發展以及全新化療藥物的研制成功，骨肉瘤的治療療效有了較大的提高。但是，轉移以及復發的骨肉瘤患者預后依然相當差，并且繼發轉移以及耐化療藥物骨肉瘤的出現仍然是相當嚴重的問題2。作為來源于植物的黃酮類物質，木犀草素能夠干擾骨肉瘤細胞新陳代謝的正常進行，抑制其生長，誘導其凋亡，對于骨肉瘤的治療具有較高的應用價值3、4。為研究木犀草素對骨肉瘤的抑制效應及其機制，為臨床治療骨肉瘤提供依據，我院于2013年6月2014年5月展開相關研究，其效果顯著，現作如下總結報道。1 材料與方法1.1 材料細胞系：選擇浙江大學藥學院培養的人體骨肉瘤MG

6、-63細胞系。藥物：木犀草素（Sigma公司產品）試劑：小牛血清（GIBCO公司產品），RPM1640培養基粉劑（GIBCO公司產品），胰蛋白酶（Amersco公司產品），-actin抗體（Sigma公司產品），IL-6（Sigma公司產品），辣根過氧化物酶標記二抗（Jackson公司產品）。儀器： 通用臺式冷凍離心機（Sigma公司產品）、倒置相差顯微鏡（OLYMPUS公司產品）、SG403A-HE生物安全柜（Baker公司產品）、CO2培養箱（Forma公司產品）、全自動高壓滅菌鍋（ALP產品）、電子分析天平（Sigma公司產品）、紫外-可見光光度計（Hach公司產品）。1.2 實驗方法細

7、胞系培養：將骨肉瘤MG-63細胞系置于37、5%CO2培養箱內，以小牛血清（10%）、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素配置而成的RPM1640培養液貼壁培養。倒置熒光顯微鏡觀察骨肉瘤MG-63細胞生長，胰蛋白酶（0.25%）消化傳代，選擇處于生長期的骨肉瘤細胞進行實驗。1.2.2 觀察骨肉瘤MG-63細胞形態取6孔培養板，每孔分別滴加骨肉瘤MG-63細胞懸濁液1mL，然后分別滴加100L濃度為1.25g/L、2.5g/L、5g/L、10g/L的木犀草素溶液以及等量磷酸鹽緩沖液進行對照，于常規條件下進行培養。24h后使用倒置相差顯微鏡觀察已培養好的腫瘤細胞樣本，記錄其形態特點，各濃度培

8、養的樣本均重復觀察3次，選擇典型結果進行比較分析。1.2.3 劃痕實驗取6孔培養板鋪滿骨肉瘤MG-63細胞，觀察細胞生長，于細胞貼壁長滿時劃痕，然后分別滴加100L濃度為5g/L、10g/L的木犀草素溶液以及等量磷酸鹽緩沖液進行對照，于常規條件下進行培養，于0h與24h對劃痕距離進行認真觀察并拍照記錄。1.2.4 侵襲實驗5取已培養好的骨肉瘤MG-63細胞懸液，進行細胞計數，并將骨肉瘤MG-63細胞懸液的細胞數目調整為5×104個/100L后鋪板。取24孔培養板，于每孔滴加RPM1640培養基，并在侵襲實驗小室上室滴加調整好的骨肉瘤MG-63細胞懸液100L，以使每個上室內均含5&#

9、215;104個骨肉瘤MG-63細胞，然后于上室滴加1%牛血清白蛋白10L，以確保上室滲透壓。分別滴加濃度為5g/L、10g/L的木犀草素100L，并于37、5%CO2培養箱內行15h常規培養。然后將小室取出以乙醇（90%）固定，結晶紫溶液（0.1%）染色，于×400低倍鏡下觀察觀察拍照，選取4個視野做細胞計數，算出平均值。侵襲實驗重復進行3次。1.2.5 免疫印跡實驗6分別取木犀草素處理前及處理后的骨肉瘤MG-63細胞1mL，滴加細胞裂解液300L，行30min冰上裂解，然后哦移入1.5mL離心管中，4下通用臺式冷凍離心機12000r/min速度離心5min，然后取出上清液并于-2

10、0下妥善保存。二喹啉甲酸法測定其蛋白濃度，每一個泳道40g上樣蛋白量，將上樣于80V下行30min聚丙烯酰胺凝膠電泳，于120V下行90min聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳完成后把蛋白移到PVDF膜上，以新配置成含脫脂奶粉（5%）的磷酸鹽吐溫緩沖液搖床行2h封閉，加入1:500的-Acrin抗體及1:500的IL-6抗體，于4反應18h后取出PVDF膜，使用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，15min/次，取1:3000的辣根過氧化物酶標記二抗室溫下封閉1h，以磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，10min/次，然后以化學發光法進行檢測，并以X光片對結果進行記錄。1.3 統計學方法以SPSS19.0統計學軟件進行統計

11、分析，計量資料以±s表示，用t檢驗作組間比較，p0.05表示組間差異存在統計學意義。2 結果2.1 骨肉瘤細胞在形態上的變化在正常條件下培養的骨肉瘤MG-63細胞貼壁良好，形態規則，細胞透亮，輪廓清晰；經1.25g/L與2.5g/L木犀草素處理后的骨肉瘤MG-63細胞與正常條件下培養點細胞無顯著差異，而經5g/L與10g/L木犀草素處理后的骨肉瘤MG-63細胞貼壁較弱或消失，且細胞皺縮，生長緩慢，部分破碎，多數懸浮分散生長。（如圖1所示） 正常培養 5g/L木犀草素培養 10g/L木犀草素培養 圖1 不同培養條件下骨肉瘤細胞形態圖2.2 劃痕實驗結果培養0h時，三組骨肉瘤MG-63細

12、胞未見大量運動遷移，劃痕區域覆蓋率均為0%；經24h培養后，未使用木犀草素處理的骨肉瘤MG-63細胞可大量運動遷移，其劃痕區域覆蓋率為98.73%；使用 5g/L木犀草素培養的骨肉瘤MG-63細胞運動遷移能力有所降低，其劃痕區域覆蓋率為74.89%；使用10g/L木犀草素培養的骨肉瘤MG-63細胞運動遷移能力顯著降低，其劃痕區域覆蓋率為52.86%。且未使用木犀草素處理、使用 5g/L、10g/L木犀草素培養覆蓋率比較，存在顯著統計學差異（p0.05）。2.3 侵襲實驗結果和正常條件下生長的骨肉瘤MG-63細胞相比較，經過5g/L、10g/L木犀草素處理的骨肉瘤MG-63細胞，其穿膜細胞數量分

13、別降低至正常條件下生長細胞的60.03%、22.47%，正常條件下、使用 5g/L、10g/L木犀草素處理的穿膜細胞數量比較，存在顯著統計學差異（p0.05）。2.4 免疫印跡實驗結果和正常條件下生長的IL-6蛋白表達水平相比較，經過5g/L、10g/L木犀草素處理的骨肉瘤MG-63細胞，隨著木犀草素濃度的增加IL-6蛋白表達水平逐漸降低，IL-6蛋白總量也逐漸減少。其具體結果如圖2。 正常培養 5g/L木犀草素培養 10g/L木犀草素培養 圖2 不同培養條件下IL-6蛋白表達水平圖像和正常條件下生長的抗-Acrin抗體蛋白表達水平相比較，經過5g/L、10g/L木犀草素處理的骨肉瘤MG-63

14、細胞，隨著木犀草素濃度的增加抗-Acrin抗體蛋白表達水平變化不顯著，抗-Acrin抗體總量變化不顯著。其具體結果如圖3。 正常培養 5g/L木犀草素培養 10g/L木犀草素培養 圖3 不同培養條件下-Acrin抗體水平圖像3 討論3.1 臨床研究發現，骨肉瘤主要來源于間葉細胞，是由具有極強惡性增殖能力的肉瘤細胞產生的不成熟骨組織或者骨腫瘤性組織7。骨腫瘤可發生于任何年齡的人群，但多見于1525歲的青年人，男性多于女性，其發病率約為2:1。骨肉瘤主要侵犯干干骺區，甚至能夠穿過骨骺對關節造成影響8。骨肉瘤惡性程度非常高，預后相當差，術后3年存活率只有不到20%，5年存活率只有不到5%。近幾年來，

15、隨著醫療水平的不斷提高，骨肉瘤5年生存率逐漸提高，即便如此，仍然有40%左右的患者出現轉移，并最終導致患者死亡9。相當多的研究表明，在骨肉瘤轉移進程中，多數細胞因子的表達出現異常，如IL-6。作為一種效能較多的細胞因子，IL-6不但對腫瘤的生長與增值起著十分重要的作用，同時還可以促進生成腫瘤血管、腫瘤遷移、促使產生炎性反應。臨床研究表明，異常高表達的IL-6及IL-6受體和腫瘤的發生有著密切的關系10。3.2 在本研究中，經5g/L與10g/L木犀草素處理后的骨肉瘤MG-63細胞生長惡劣，明顯不如未經木犀草素處理及低濃度木犀草素處理的骨肉瘤細胞生長狀況，提示較高濃度的木犀草素對于骨肉瘤細胞的生

16、長、增值具有一定的抑制效應。使用木犀草素處理的骨肉瘤MG-63細胞其運動遷移能力顯著降低，劃痕區域間隔明顯，并且木樨草素濃度越高其劃痕區域間隔就越明顯，提示木犀草素能夠顯著抑制骨肉瘤MG-63細胞的運動遷移，并且其抑制能力與木犀草素的濃度呈明顯的正相關關系。經過木犀草素處理的骨肉瘤MG-63細胞，其穿膜細胞數量顯著降低，并且木犀草素濃度越高其穿膜細胞降低數量就越多，提示木犀草素能夠顯著抑制穿膜細胞的數量，并且其抑制能力與木犀草素的濃度呈明顯的正相關關系。免疫印跡實驗表明，骨肉瘤MG-63細胞IL-6蛋白表達水平隨木犀草素濃度的增加而逐漸降低，提示木犀草素能夠抑制IL-6蛋白的表達，并且其抑制能

17、力也與木犀草素的濃度呈明顯的正相關關系。3.3 總之，本研究發現，木犀草素對于骨肉瘤MG-63細胞的生長、增值、運動遷移能力、穿膜細胞數量、IL-6蛋白表達水平均有一定的抑制作用，并且其抑制作用隨著木犀草素濃度的增加而逐漸增加，說明一定濃度的木犀草素對于骨肉瘤MG-63細胞具有極強的抑制作用，值得應用于臨床骨肉瘤的治療。參考文獻:1、徐統震, 孫雪飛,任冬梅,等.木犀草素抑制肺癌細胞A549的增殖及其聯合化療作用J山東大學學報(醫學版)，2012，50（07）：50-54. 2、戴歡子.印跡基因TSSC3對骨肉瘤生物學特性的影響及其機制研究D.重慶：第三軍醫大學，2012年病理學與病理生理學博士學位論文.3、李燁.木犀草素、葒草苷和異葒草苷的UGT代謝機理及BCRP外排轉運蛋白調控其代謝的機制研究D.廣東廣州：南方醫科大學，2013年藥劑學碩士學位論文.4、韓亞麗,繆競誠,盛偉華，等.Ad-IL-24對MG-63人骨肉瘤細胞抑癌效應的體內外實驗J生物工程學報，2009，10：1538-1545.5、姜英; 謝鯤鵬; 霍洪楠，等.木犀草素下調AEG-1和MMP-2的表達對血管生成和乳腺癌細胞侵襲性的抑制作用J生理學報，2013，65（05）：513-518.6、劉郁東.抑制mTOR通路在常氧及缺氧條件下對骨肉瘤細胞表型和生長相關分子的影響D湖北武漢：華中科技大學, 2013年