1、核酸分子雜交技術與應用綜述摘要 核酸分子雜交技術是20世紀70年代發展起來的一種嶄新的分子生物學技術。它是基于DNA分子堿基互補配對原理，用特異性的核酸探針與待測樣品的DNA/RNA形成雜交分子的過程。分子雜交實驗依據其形式的不同可以分為液相雜交、固相雜交、原位雜交，而固相雜交又可以分為菌落雜交、點/狹縫雜交、Southern印跡雜交和Northern印跡雜交。各類型雜交稻基本原理和步驟是基本相同的，只是選用的雜交原材料、點樣方法有所不同。關鍵字 核酸分子雜交 液相雜交 固相雜交 原位雜交 應用 本文是對分子雜交技術的原理和類型分類及其應用的一篇綜述。旨在了解各種雜交類型的應用方向，即在生物、

2、醫學上的應用。一、 核酸分子雜交原理DNA分子是由兩條單鏈形成的雙股螺旋結構，維系這一結構的力是兩條單鏈堿基氫鍵和同一單鏈上相鄰堿基間的范德華力。在一定條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規則線團，DNA分子成為單鏈，這一過程稱作變性或融解。加熱、改變DNA融解的pH值，或有機溶劑等理化因素，均可使DNA變性。變性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外光吸收增加。在溫度升高引起的DNA變性過程中，DNA的變性會在一個很狹窄的溫度范圍內發生，這一溫度范圍的重點被稱作融解溫度Tm。Tm值得大小取決于核酸分子的G-C含量，核酸分子的G-C含量越高，其Tm值越高。因為G-C堿基之間有

3、三個氫鍵，而A-T堿基之間只有兩個氫鍵。變性DNA只要消除變性條件，具有堿基互補的單鏈又可以重新結合形成雙鏈，這一過程稱作復性。根據這一原理，將一種核酸單鏈標記成為探針，再與另一種核酸單鏈進行堿基互補配對，可以形成異源核酸分子的雙鏈結構，這一過程稱作雜交（hybridization）。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補序列就可以形成雜交體。二、 核酸分子雜交類型（一） 固相雜交固相雜交是把欲檢測的核酸樣品先結合到某種固相支持物上，再與溶解于溶液中的雜家探針進行反應，雜交結果可用儀器進行檢測，但大多數情況下直接進行放射自顯影，然后

4、根據自顯影圖譜分析雜交結果。1、 菌落雜交用于重組細菌克隆篩選的固相雜交，稱作菌落雜交。主要步驟包括菌落平板培養、濾膜滅菌后放到細菌平板上，使菌落粘附到濾膜上，將濾膜放到經適當溶液飽和度吸水紙上，菌斑溶解產生單鏈的DNA，固定DNA用32P標記的單鏈探針與菌落DNA進行雜交。雜交后，洗脫未結合的探針，將濾膜暴露于X線膠片進行放射自顯影。將自顯影膠片、濾膜、培養平板比較就可以確定陽性菌落。2、 Southern雜交Southern雜交是從環境樣品中提取細菌總DNA，用適當的限制性核酸內切酶切割，經凝膠電泳分離后，將凝膠中的條帶轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后對該膜進行探針檢測的方法。只有含有

5、靶DNA序列的DNA分子才能與特定的核酸探針進行雜交。Southern雜交主要用于研究某些細菌多態性變化規律。3、 Northern印記雜交Northern印記雜交和Southern印記雜交的過程基本相同，區別在于靶核酸是RNA而非DNA。RNA在電泳前已經變性，進一步經歷變性凝膠電泳分離后，不再進行變性處理。在Northern雜交中所使用的探針常常是克隆的基因。（二） 液相雜交液相雜交是一種研究最早且操作簡便的雜交類型。液相雜交的反應原理和反應條件與固相雜交基本相同，僅僅是將待檢測的核酸樣品和雜交探針同時溶于雜交液中進行反應，然后利用羥磷灰石柱選擇性結合單鏈或雙鏈核酸的性質分離雜化雙鏈和未參

6、加反應的探針，用儀器計數并通過計數分析雜交結果，或者利用核酸分子的減色性（260nm處吸光度的降低與雙鏈形成去的多少成正比）分析雜交的結果。（三） 原位雜交原位雜交是應用核酸探針與組織或細胞中的核酸按堿基配對原則進行特異性結合形成雜交體，然后應用組織化學或免疫組織化學方法在顯微鏡下進行細胞內定位或基因表達的檢測技術。其中在此技術上發展的熒光原位雜交（FISH）技術因其經濟、安全、無污染、探針穩定、快速、簡便、直觀、可靠、靈敏度高、信號強、背景低等，在診斷生物學、發育生物學、細胞生物學、遺傳學和病理學研究上均得到廣泛的應用。三、 核酸分子雜交技術應用（1） Southern印記雜交1、 單基因遺

7、傳病的基因診斷：早在1978年，簡悅威等醫學家在鐮狀細胞貧血癥的基因診斷中就采用過Southern雜交的方法，取得了基因診斷的突破。2、 基因點突變的檢測：例如ATP敏感性鉀離子通道的亞單位內向整流鉀通道基因A635G突變的檢測（2） Northern印記雜交Northern印記技術多用來檢查基因組中某個特定的基因是否得到轉錄以及轉錄的相對水平。目前，Northern印記技術仍然被認為是檢測基因表達水平的金標準。（3） 液相雜交以液相雜交技術為基本工作原理設計的多功能懸浮點陣儀是液態芯片技術應用的典范。這一技術平臺已被應用于遺傳突變的分子診斷，如出生缺陷干預工程中的Downs綜合征、珠蛋白合成

8、障礙性貧血、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷的基因診斷，也已被用于SNPs分析、感染性疾病的鑒別診斷、藥物敏感性和親子鑒定。此外，還可以應用于基因表達譜的分析，從而進行腫瘤性疾病如血液病、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、膀胱癌和結腸癌的分子病理學研究。（4） 熒光原位雜交(FISH)技術1、 細胞遺傳學分析產前診斷：在新生兒的先天性疾病中，染色體的數目異常要占很大的一部分，其中以染色體X、Y、13、18和21數量的異常最為多見。利用FISH技術的優勢還可以用于產前診斷中的羊水細胞核型分析。常規的染色體型分析技術需要對羊水細胞進行培養，時間較長。FISH技術可以在少量的羊水細胞涂片上進行異常染色體的數目分析

9、，不需要羊水細胞的培養，記得地縮短了病人等待的時間。生殖醫學中的應用：采用FISH技術可對一個卵裂球的染色體進行檢測，排除存在染色體異常的胚胎，提高胚胎種植成功率。另一方面，對精子染色體的研究已經成為男性不育者精子檢測的一項重要內容。血液疾病中染色體易位的檢測：在化療后緩解的慢性粒細胞性白血病病人的標本中，采用FISH技術極易發現殘存的白血病細胞，確定微小殘留病灶。FISH檢測的結果對白血病的診斷、治療和預后的估計提供了有力的依據，也為白血病機制的研究提供了線索。2、病原學檢測：采用FISH技術還可以快速鑒定血培養中的微生物、送檢樣本中的病毒等，采用診斷微生物DNA或RNA的熒光標記探針可以直接快速地檢測出微生物病原體核酸，檢測靈敏度較高。3、比較基因組雜交4、基因圖譜繪制5、診斷微生物菌落結構與群落動態6、監測微生物的原位生理學7、FISH技術結合流式細胞術定量化檢測微生物四、 展望盡管核酸分子雜交技術的應用越來越廣泛，但其在臨床實用中仍存在不少問題，必須提高檢測單拷貝基因的敏感性，用非放射性物質代替放射性同位素標記探針以及簡化實驗操作和縮短雜交時間，這樣，就需要在以下三方面著手研