




版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、組代謝型谷氨酸受體阻斷劑對老年癡呆大鼠模型腦內nNOS及nNOS mRNA表達的影響 作者:馮榮芳 劉凌云 石衛(wèi)東 李娜 馮亞青【摘要】 目的 闡明組代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor 2/3,mGluR2/3)對老年性癡呆(AD)發(fā)病過程中一氧化氮(NO)的影響。方法 應用免疫組化和原位雜交方法,觀察腦室應用組mGluR2/3阻斷劑甲基(4四唑基苯)甘氨酸 (MTPG)對腦室淀粉樣肽(A)注射所致的AD大鼠神經型一氧化氮合酶(nNOS)及其mRNA表達的影響。48只SD大鼠隨機分為假手術組、癡呆組、癡呆組+MTPG組,每組16只。各組大鼠均在Mo
2、rris水迷宮測試后常溫飼養(yǎng)1 w后取材觀察。結果 假手術組海馬CA1區(qū)錐體細胞輪廓清楚,排列整齊,胞漿有較弱的nNOS表達。癡呆組nNOS表達較假手術組明顯增加,同時錐體細胞數目變少,錐體神經元的輪廓、形態(tài)出現明顯的損傷性改變;腦室注射mGluR2/3阻斷劑MTPG,可部分阻斷AD引起的nNOS表達增加,對神經元的形態(tài)也有恢復作用。原位雜交與免疫組化顯示相似的變化趨勢。結論 mGluR2/3參與AD發(fā)病過程,NO信號通路可能發(fā)揮重要作用。 【關鍵詞】 腦室A注射;神經型一氧化氮合酶; 代謝型谷氨酸受體;甲基(4四唑基苯)甘氨酸;SD大鼠代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutam
3、ate receptors,mGluRs)是腦內廣泛存在的、與G蛋白偶聯的膜受體,參與腦內許多生理、病理過程。研究證實, mGluRs參與腦缺血耐受的發(fā)病機制1,并在老年性癡呆(AD)的發(fā)病中起一定作用。一氧化氮 (NO) 作為非經典神經介質參與許多與谷氨酸受體激活相關的生理、病理過程2,如海馬的長時程突觸傳遞增強和小腦的長時程突觸傳遞抑制、神經遞質釋放的調節(jié)、動物的學習和記憶3以及缺血耐受過程等4。本實驗采用免疫組織化學和原位雜交方法,觀察腦室應用組mGluR阻斷劑甲基(4四唑基苯)甘氨酸(MTPG)對AD發(fā)病過程中NO的影響。1 材料與方法1.1 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠48只,體
4、重250280 g(由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供),隨機分為假手術組、癡呆組和癡呆+MTPG組,每組16只。假手術組:進行所有手術操作,注射等量蒸餾水。癡呆組:于大鼠左側腦室緩慢注入凝聚態(tài)淀粉樣肽(A2535) (濃度為4 g/L)5 l;癡呆+MTPG組:大鼠左側腦室注入A 2535后1 w,于右側腦室注射MTPG 0.04 mg(MTPG溶于人工腦脊液),其他兩組均右側腦室注入等量人工腦脊液。4 w后進行Morris水迷宮檢測,各組大鼠均于Morris水迷宮測試后1 w處死,其中8只用于腦組織病理學檢測和免疫組化染色,8只用于原位雜交。1.2 癡呆大鼠模型的復制 A老化的處理:將A253
5、5(片段序列為:HGSNKGAIIGLMOH)溶于蒸餾水(蒸餾水有利于A2535聚合),濃度為4 g/L,在37保溫箱中孵育4 d,使其變?yōu)槟蹜B(tài)A。參照文獻5的方法復制癡呆大鼠模型:大鼠在10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉下,固定于江灣1型C大鼠立體定位儀上,常規(guī)消毒,切皮,暴露前囟,依據大鼠腦立體定位圖譜,于前囟后0.8 mm,中線左旁開1.5 mm,用牙科鉆開顱,切開硬膜,用微量進樣器自腦表面垂直進針4.0 mm (AP:-0.8 mm,ML:1.5 mm,DL:4.0 mm),于左側腦室緩慢注入凝聚態(tài)A2535 5 l,留針5 min,緩慢撤針;對照組動物經歷同樣的手術程序,
6、注射等量蒸餾水。關閉切口,待動物清醒后,送回養(yǎng)籠,自由飲水,飲食。MTPG右側腦室注射:方法同上,在AD建模后1 w,于前囟后0.8 mm,中線右旁開1.5 mm),用牙科鉆開顱,切開硬膜,用微量進樣器自腦表面垂直進針4.0 mm (AP:-0.8 mm,ML:1.5 mm,DL:4.0 mm),注射MTPG(4 mg/ml,溶于人工腦脊液),每次注射MTPG 10 l,1 min內注完,留針5 min;其他兩組動物經歷同樣的手術過程,分別注射等體積的人工腦脊液;注射4 w后進行Morris水迷宮測試。1.3 Morris水迷宮測試 大鼠空間學習記憶能力測試采用中國醫(yī)學科學院研制的大鼠Morr
7、is水迷宮裝置。測試包括定向航行試驗和空間探索試驗。在水迷宮水槽壁上標明 4個入水點,將水槽等分為4個象限,逃避平臺置于第三象限。水槽內充以潔凈自來水,水面高出平臺 2 cm,并加入適量奶粉使水渾濁,水溫控制于(20±2)。實驗前1 d將大鼠放入不含平臺的水槽中2 min,使其適應迷宮環(huán)境及游泳。試驗共7 d。前6 d進行定向航行試驗將大鼠從入水點置入水槽中,記錄60 s內大鼠從入水到爬上平臺所需時間即潛伏期。每只大鼠每天訓練4次,即從4個不同象限入水點入水進行訓練各1次。訓練中,若大鼠在60 s內找到平臺,讓其于平臺上站立10 s;若未找到,用棒將其引上平臺,并讓其站立10 s,潛
8、伏期記為60 s。第 7天進行空間探索試驗:撤去平臺,將大鼠從第二象限入水點放入水槽,記錄60 s內其在平臺象限(第三象限)的滯留時間。1.4 腦組織病理學檢測 在預定取材時間點,將動物戊巴比妥鈉深麻醉后,開胸經升主動脈依次灌注4生理鹽水100 ml,440 g/L多聚甲醛250 ml(10 min快速階段,50 min慢速階段)后,取出大腦。冠狀切取視交叉后14 mm腦組織,用40 g/L多聚甲醛固定24 h,常規(guī)脫水,石蠟包埋。在背側海馬水平連續(xù)切片,片厚6 m,展片、脫蠟后,硫堇染色下觀察海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經元死亡(DND)情況。在光學顯微鏡下對海馬CA1區(qū)組織學改變進行分級(Hist
9、ological grade,HG),標準如下:0級:無神經元死亡;1級:散在的神經元死亡;2級:成片的神經元死亡;3級:幾乎全部神經元死亡。取雙側平均值作為統計值。高倍鏡下計數雙側海馬CA1區(qū)1 mm長度區(qū)段內存活的錐體細胞數,每側計數3個區(qū)段,取其平均數為神經元密度(ND)6。1.5 免疫組化染色及分析 取材、切片同腦組織病理學檢測。切片首先在3%H2O2 孵育 10 min 以消除內源性過氧化物酶活性,微波照射15 min以充分暴露抗原,在用100 ml/L的正常山羊血清37孵育30 min后,加入一抗(150 稀釋,免抗nNOS,武漢博士德生物公司) 4孵育過夜,加入二抗(生物素標記的
10、羊抗兔lgG復合物)、在37 孵育30 min后,用0.01 mol/L PBS沖洗,辣根酶標記鏈酶卵白素37 孵育30 min,用DAB(二氨基聯苯)顯影。用0.01 mol/L PBS代替nNOS抗體作為陰性對照。在光學顯微鏡下,觀察大鼠海馬CA1區(qū)nNOS陽性細胞的形態(tài)及分布特征。通過彩色圖文分析系統(HPIAS1000彩色圖文分析系統,同濟醫(yī)科大學),計數視野內陽性細胞數目,測量陽性細胞截面總面積、平均光密度以反映免疫組化染色的程度。每個標本測量5個視野取其平均值。總面積、平均光密度數值越大,表示nNOS表達越強。1.6 原位雜交 在預定取材時間點斷頭處死動物,快速低溫剝出大腦,冠狀切
11、取視交叉后14 mm腦組織,用新鮮配制的加有0.1%DEPC的40 g/L多聚甲醛固定50 min以阻止核糖核酸酶活性,0.1 mol/L PBS 4 過夜,換液一次;梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,連續(xù)切片,片厚7 m,在含有0.1%DEPC 水的蒸餾水中展片、脫蠟后,行原位雜交染色。陰性對照采用預雜交液代替雜交液。相對定量分析方法同免疫組化。1.7 統計學處理 組織學分級采用多樣本等級資料的秩和檢驗;其他所用實驗數據采用x±s表示,使用SPSS10統計軟件包,進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析和相關分析。2 結果2.1 海馬CA1區(qū)HG及和ND變化 假手術組海馬CA1區(qū)錐體細
12、胞排列緊密有序,細胞核大而圓,染色淺,核仁明顯,未見明顯胞漿濃染,核固縮等神經元變性受損征象。而癡呆大鼠海馬CA1錐體神經細胞排列疏松,數目減少,細胞形態(tài)異常,許多細胞出現體積縮小,核濃染,錐體神經元密度明顯降低;而癡呆+MTPG組海馬CA1區(qū)錐體神經元密度明顯改善,見圖1,表1。2.2 nNOS表達 假手術組海馬CA1區(qū)錐體細胞輪廓清楚,排列整齊,胞漿有較弱nNOS表達(圖2)。癡呆組nNOS表達很強(圖2);但是nNOS的表達增加伴隨有錐體神經元排列的紊亂和外形的不規(guī)則(圖1)。而且,錐體神經元的粗大的突起也顯示免疫陽性反應。在癡呆+MTPG組中,nNOS的表達與癡呆組相比較弱,但表達的圖
13、形類似于癡呆組(圖2,表2)。用0.01 mol/L PBS代替nNOS抗體的一組切片無陽性染色。2.3 NOS mRNA表達 海馬CA1區(qū)nNOS mRNA的表達的觀察方法同免疫組化。原位雜交除了核中同時有少量表達外,與免疫組化顯示相似的變化趨勢(圖3)。 原位雜交陰性對照,用預雜交液代替雜交液,結果不顯色,見表3。表1 各組海馬CAI區(qū)組織學分級和ND(n=8)(略)與假手術組比較:1)P0.05;與癡呆組比較:2)P0.05,下表同表2 各組海馬CA1區(qū)nNOS 陽性反應細胞數目、總面積及光密度(略)表3 各組海馬CA1區(qū)nNOS mRNA免疫陽性細胞數目、總面積及光密度(略)圖1 各組
14、大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞的組織學分級(×100)(略)圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞nNOS免疫陽性表達(×100)(略)圖3 原位雜交方法顯示各組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞nNOS mRNA的陽性表達 (×100)(略)3 討論 本研究發(fā)現,腦室注射MTPG這一強的選擇性mGluR2/3阻斷劑,能明顯阻斷AD所致的海馬錐體神經元損傷,表明mGluR2/3 AD所致的神經元損傷中發(fā)揮重要作用。關于AD發(fā)病中mGluR2/3激活的機制,可能與細胞外谷氨酸的增加有關。離子型谷氨酸受體居于突觸后膜的中心,而mGluRs可能居于突觸后膜的外圍, mGluR2/3不參與神
15、經細胞之間正常的興奮傳導,可被過量的谷氨酸激活6,7。在AD腦中,有持續(xù)的谷氨酸向細胞外釋放引起部分去極化產生的背景噪音,導致細胞外谷氨酸濃度增加;因此, AD中谷氨酸的釋放,在某種程度上 增加了細胞外谷氨酸濃度,進一步激活mGluR2/3。 本研究結果表明AD能引起nNOS和NO表達增加,而MTPG不僅能阻斷AD誘導的nNOS表達增加,而且能部分阻斷AD中海馬神經元的損傷。為闡明mGluR2/3激活的下游機制,作者觀察了nNOS和其mRNA 在AD中表達的變化和MTPG對這種表達的影響,試圖確定NO信號通路在mGluR2/3參與AD發(fā)病過程中的作用。免疫組化染色顯示海馬CA1區(qū)nNOS表達在
16、AD中上調; AD動物海馬CA1區(qū)nNOS的上調與AD的神經原的損傷一致,提示NO參與AD發(fā)病過程。 腦室應用MTPG既能部分阻斷AD神經損傷作用,又能部分阻斷AD誘導的nNOS的上調。結果強烈提示激活mGluR2/3能上調nNOS的表達,導致NO產生,后者參與激活mGluR2/3介導的AD的發(fā)病。進一步觀察mGluR2/3激動劑對AD中nNOS的效果將會為上述結論提供更多證據。 癡呆組mGluR興奮可能通過NOS活性依賴和非NOS活性依賴兩條途徑促進NO生成的增加8。一方面,癡呆組mGluR興奮,可通過偶聯的G蛋白介導磷酸肌醇(PI)系統的作用促進NO生成。G蛋白激活磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C
17、,將膜上的磷脂酰肌醇二磷脂(PIP2)水解為三磷酸肌醇(IP3)和二脂酰甘油(DG),構成相互配合的 IP3/Ca2+和 DG/PKC兩條第二信使通路。IP3能刺激Ca2從內質網中釋放;胞內鈣的動員,啟動一系列鈣激活波,增加NOS活性和NO產生9;DG在膜內激活蛋白激酶C(PKC),調節(jié)離子通道的蛋白磷酸化,激活NOS對Ca2+濃度的敏感性而增加NO的釋放10,11;另一方面,mGluR2/3可增加NO產生通過非NOS活性依賴途徑;mGluR2/3能增加L精氨酸對NOS的可用性;L精氨酸通過增加鈣調蛋白活性或/和增強細胞內儲鈣池的鈣動員,增加NO的產生12。癡呆+MTPG組MTPG阻斷AD中的
18、神經損傷。本研究提示mGluR2/3參與AD發(fā)病可能通過NO信號通路起作用或與NO信號通路有關。【參考文獻】 1 Feng RF,Li WB,Liu HQ,et al.Effect of methyl(4tetrazolylphenyl) glycine on the induction of hippocampal ischemic tolerance in the ratJ. Acta Physiol Sin,2003;55(3):30310.2 Beckman JS.The doubleedged role of nitric oxide in brain function and su
19、peroxidemediated injuryJ.J Dev Physiol,1991;15(1):539.3 Liu HQ,Li WB,Li QJ,et al.Nitric oxide participates in the induction of brain ischemic tolerance via activating ERK1/2 signaling pathwaysJ. Neurochem Res,2006;31(7):96774.4 Centeno JM,Orti M,Salom JB.Nitric oxide is involved in anoxic preconditi
20、oning neuroprotection in rat hippocampal slicesJ.Brain Res,1999;836(12):629.5 Yamaguchi Y,Kawashima S.Effect of amyloidbeta(2535) on passive avoidance,radialarm maze learning and choline acetyltransferase activity in the ratJ.Eur J Pharmacol,2001;412(3):26572.6 Scanziani M,Salin PA,Vogt KE,et al.Use
21、dependent increases in glutamate concentration activate presynaptic metabotropic glutamate receptorsJ.Nature,1997;385(6617):6304.7 Sommer C,Roth SU,Kuhn R,et al.Metabotropic glutamate receptor subtypes are differentially expressed after transient cerebral ischemia without during and after tolerance induction in the gerbal hippocampusJ.Brain Res,2000;872(12):17280.8 Vincent AM,Maiese K.The metabotropic glutamate system promotes neuronal survival through distinct pathways of programmed cell deathJ. Exp Neurol
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 草場生態(tài)旅游項目租賃合同
- 倉儲物流倉儲操作與維護勞動合同
- 自制冷飲勞動技術課件
- 膳食健康課件
- 腰椎融合術后護理
- 電池工程師(鉛酸電池)考試試卷及答案
- 機電工程師(電氣布線)崗位面試問題及答案
- 購車合同中的二手車鑒定評估標準
- 股東股權代持及公司社會責任履行合同
- 股權轉讓補充協議書:股權變更登記流程模板
- 劍橋商務英語BEC(初級)全套課件
- 醫(yī)療器械臨床評價課件
- 滬科版九年級物理全一冊教案(完整版)教學設計含教學反思
- DB32∕T 2880-2016 光纖傳感式橋隧結構健康監(jiān)測系統設計、施工及維護規(guī)范
- 開發(fā)報建流程及細則
- 潔凈室塵埃粒子檢測規(guī)范
- 測量成果驗收單
- 系統開發(fā)需求確認單
- 高中成績證明模板(共2頁)
- 冰毯機的使用與護理
- (完整版)BrownBear繪本附配音
評論
0/150
提交評論