1、siRNA沉默PC3細(xì)胞中KDR基因的表達(dá)作者：繆應(yīng)業(yè)，劉新，李浩，喬卿華，侯林虎，劉小圓，郝曉柯【摘要】 目的： 構(gòu)建針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（KDR）基因的shRNA表達(dá)載體，研究KDR基因沉默后對(duì)PC3細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)的影響. 方法： 將合成的三對(duì)DNA正義鏈及反義鏈變性、退火，形成的雙鏈DNA與pSilencerTM3.1H1 neo線性質(zhì)粒用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建pSilencer3.1KDR1, pSilencer3.1KDR2和Psilencer3.1KDR3三個(gè)siRNA表達(dá)載體. 經(jīng)酶切及DNA測(cè)序鑒定后，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因法轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，通過RTPCR、免疫印跡和

2、免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn),檢測(cè)KDR的表達(dá)變化,MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)速度的變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，以未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒pSilencer3.1NC的PC3細(xì)胞為對(duì)照. 結(jié)果： 酶切及測(cè)序證實(shí)設(shè)計(jì)合成的DNA已正確插入載體. RTPCR、免疫印跡和免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)表明，pSilencer3.1KDR3有效地降解了PC3細(xì)胞中KDR基因的mRNA，下調(diào)蛋白表達(dá);轉(zhuǎn)染pSilencer3.1KDR3后PC3細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯變慢. 結(jié)果表明, pSilencer3.1KDR3組PC3細(xì)胞的G0/G1期百分率明顯增高，而S期和G2M期的細(xì)胞減少,與其余組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P&am

3、p;lt;0.01). 而pSilencer3.1KDR1和pSilencer3.1KDR2無效. 結(jié)論： 成功構(gòu)建針對(duì)KDR基因的siRNA表達(dá)載體，只有pSilencer3.1KDR3可有效地沉默KDR在前列腺癌細(xì)胞系PC3細(xì)胞中的表達(dá)，抑制PC3細(xì)胞的增殖. 【關(guān)鍵詞】 RNA,小分子干擾;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體;PC3細(xì)胞;前列腺腫瘤 0引言 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體，又稱激酶功能區(qū)受體(vascular endothelial growth factor , VEGFR2/kinase domain receptor, KDR)，其在血管內(nèi)皮和部分腫瘤細(xì)胞上特異性表達(dá)，對(duì)于VEGF的信號(hào)轉(zhuǎn)

4、導(dǎo)及血管內(nèi)皮生成起主導(dǎo)作用，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要的調(diào)節(jié)作用. 研究表明，人前列腺癌細(xì)胞中有VEGF和KDR表達(dá)，存在VEGFKDR自分泌途徑，與前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)1-2. 我們用pSilencerTM3.1H1 neo在前列腺癌細(xì)胞系PC3內(nèi)表達(dá)針對(duì)KDR基因的短發(fā)卡狀RNA(short hairpin small interfering RNA, shRNA), 阻斷或降低細(xì)胞中KDR基因的表達(dá)， 探討KDR基因沉默后對(duì)PC3細(xì)胞增殖、 生長(zhǎng)的影響. 1材料和方法 1.1材料pSilencerTM3.1H1 neo質(zhì)粒(美國(guó)Ambion公司)；LipofectamineTM

5、2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；PC3細(xì)胞株為本室保存；鼠抗人KDR mAb, 羊抗鼠二抗,DAB顯色液(武漢博士德公司)；GAPDH內(nèi)參及其mAb(上海康成生物有限公司)； pEGFPN2質(zhì)粒由第四軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室韋三華博士惠贈(zèng). 1.2方法 1.2.1siRNA靶序列的設(shè)計(jì)及其表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則3以及KDR(基因號(hào)AF063658)選取并針對(duì)KDR基因編碼區(qū)（A：395414 AACATGGAGTCGTGTACATTA；B：29692988 AAGCTCCTGAAGATCTGTATA；C：39063925 AAGCGGCTACCAGTCCGGATA）

6、，分別命名為（pSilencer3.1KDR1, pSilencer3.1KDR2, pSilencer3.1KDR3）,序列經(jīng)同源分析后，由北京賽百勝公司合成. 按操作說明將合成的DNA變性、退火，形成的雙鏈DNA與pSilencerTM3.1H1 neo線性質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞，LB平板（AMP+）篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行BamH, Hind雙酶切及瓊脂糖電泳鑒定，并提交大連寶生生物公司進(jìn)行測(cè)序. 1.2.2siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞提取測(cè)序正確的siRNA表達(dá)載體和pEGFPN2質(zhì)粒并測(cè)定濃度. 將PC3細(xì)胞按1×105/孔的數(shù)量轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板，siRNA表

7、達(dá)載體轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞按操作說明進(jìn)行，每孔質(zhì)粒用量為2 g，脂質(zhì)體用量為5 L. 以任何已知序列不同源的shRNA序列的質(zhì)粒為陰性對(duì)照, 以帶有綠色熒光蛋白的pEGFPN2質(zhì)粒同步轉(zhuǎn)染，熒光倒置顯微鏡于395 nm檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率. 1.2.3RTPCR檢測(cè)KDR的表達(dá)轉(zhuǎn)染后48 h，提取總RNA并定量，用DNA酶處理總RNA以去除DNA污染，取等量的RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR. pSilencer3.1KDR1位點(diǎn)PCR引物正義鏈：5GCCCAATAATCAGAGTGGCAGTG3，反義鏈：5GAGACGGACTCAGAACCACATCA3，產(chǎn)物長(zhǎng)度506 bp；pSilencer3.1KDR2位點(diǎn)

8、 PCR引物正義鏈：5GCACGATTCCGTCAAGGG3，反義鏈：5TTCAAAGGGAGGCGAGCA3，產(chǎn)物長(zhǎng)度383 bp；pSilencer3.1KDR3位點(diǎn)PCR引物正義鏈：5ACGGACAGTGGTATGGTT3，反義鏈：5CGAGTCAGGCTGGAGAAT3，產(chǎn)物長(zhǎng)度279 bp. 內(nèi)參照肌動(dòng)蛋白 PCR引物正義鏈：5GCTCGTCGTCGACAACGGCTC3，反義鏈：5CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC3,產(chǎn)物長(zhǎng)度353 bp. PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后采用FR200圖像分析系統(tǒng)分析. 1.2.4細(xì)胞總蛋白的提取及免疫印跡實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染后72 h提取細(xì)胞總蛋白

9、并定量，調(diào)整蛋白濃度至相同水平進(jìn)行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉；鼠抗人KDR一抗1/1000，GAPDH為1/1000，4過夜，加羊抗鼠二抗1/1000室溫1 h；洗滌、DAB顯色30 min. 采用FR200圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果. 1.2.5免疫細(xì)胞化學(xué)染色及陽性分值的計(jì)算轉(zhuǎn)染后72 h的細(xì)胞爬片，經(jīng)洗滌、固定，行KDR的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，以 PBS代替KDR抗體為陰性對(duì)照. 每張染色片隨機(jī)觀察幾個(gè)視野, 計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，染色深度以多數(shù)細(xì)胞為準(zhǔn). 陰性細(xì)胞記0分,黃色記1分,棕黃色記2分,棕褐色記3分，合計(jì)即為該細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性分值，每種細(xì)胞計(jì)5次求均數(shù). 1.2.6siRNA

10、轉(zhuǎn)染后PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線轉(zhuǎn)染后24 h，消化下各孔PC3細(xì)胞，按5×103/孔的數(shù)量轉(zhuǎn)種于96孔板，設(shè)24, 36, 48, 60, 72, 84 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，培養(yǎng)至各時(shí)間點(diǎn)，MTT法檢測(cè)吸光度A值. 1.2.7細(xì)胞周期測(cè)定收集轉(zhuǎn)染后72 h的細(xì)胞，加預(yù)冷的無水乙醇快速混勻(乙醇終濃度為600 mL/L700 mL/L) 4固定l h; PBS洗滌2次，每次加洗液2.5 mL左右，1000 r/min離心5 min；加100 L PBS調(diào)整細(xì)胞密度，每份樣品為8×105個(gè)細(xì)胞,加入1 mL PI 染色液，室溫下避光染色30 min,300目濾網(wǎng)過濾于流式細(xì)胞分析樣品管

11、，以流式細(xì)胞儀檢測(cè) DNAPI 的熒光強(qiáng)度，結(jié)果采用Modit 軟件系統(tǒng)進(jìn)行析. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)用x±s表示，對(duì)多組間均值比較行方差分析，兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn). P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 2結(jié)果 2.1siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建酶切后的瓊脂糖電泳圖可見大小為66 bp左右的酶切片段，與設(shè)計(jì)合成的KDR基因特異性序列大小相符（圖1）. DNA測(cè)序表明，各序列已成功插入了pSilencerTM3.1H1 neo載體. 將各siRNA表達(dá)載體分別命名為pSilencer3.1KDR1, pSilencer3.1KDR2和pSi

12、lencer3.1KDR3，陰性對(duì)照質(zhì)粒命名為pSilencer3.1NC. 2.2轉(zhuǎn)染效率的觀察轉(zhuǎn)染后24 h，經(jīng)熒光倒置顯微鏡下觀察pEGFPN2質(zhì)粒同步轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞，結(jié)果顯示，此次轉(zhuǎn)染的效率約為65%. 2.3siRNA對(duì)KDR mRNA抑制作用與pSilencer3.1NC和未轉(zhuǎn)染組PC3細(xì)胞相比，pSilencer3.1KDR3組PC3細(xì)胞的KDR mRNA水平明顯下調(diào)；pSilencer3.1NC、未轉(zhuǎn)染組和pSilencer3.1KDR3的KDR灰度積分值分別為：189±4, 191±4和104±3，而后者比前二者均低(P<0.01

13、). pSilencer3.1KDR1和pSilencer3.1KDR2組PC3細(xì)胞KDR的mRNA水平變化不明顯. 各組間肌動(dòng)蛋白的mRNA水平一致（圖2）. 2.4siRNA對(duì)KDR蛋白表達(dá)的抑制作用轉(zhuǎn)染72 h后，免疫印跡結(jié)果表明pSilencer3.1KDR3組，KDR蛋白總量明顯下調(diào)，而其余各組蛋白總量水平無明顯差異，各組GAPDH的表達(dá)水平一致（圖3）. 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果表明pSilencer3.1KDR3組KDR陽性細(xì)胞減少，陽性分值減低. 經(jīng)方差分析5組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，經(jīng)LSDt檢驗(yàn)，pSilencer3.1KDR3組與各組相比較，差異具

14、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而各組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）. 2.5siRNA抑制PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)與對(duì)照組相比，pSilencer3.1KDR3組轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯變慢，pSilencer3.1KDR1, pSilencer3.1KDR2轉(zhuǎn)染組無明顯變化（圖4）. 表1PC3細(xì)胞KDR蛋白免疫細(xì)胞化染色結(jié)果的比較 2.6siRNA對(duì)PC3細(xì)胞周期的影響pSilencer 3.1KDR3組G0/G1期細(xì)胞數(shù)較未轉(zhuǎn)染組增加了18.33，較pSilencer3.1NC組增加了11.41；進(jìn)入S期和G2M 期的細(xì)胞數(shù)較未轉(zhuǎn)染組分別減少了12.07和6.26，較pSile

15、ncer3.1NC組減少了8.21%和3.2(表2,圖5).表2siRNA對(duì)PC3細(xì)胞增殖周期的影響 圖5流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC3細(xì)胞周期 3討論 VEGF與其受體在腫瘤血管形成中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用4-5 . VEGFR家族的成員KDR是發(fā)揮功能的主要受體，不僅表達(dá)于腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞而且表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞膜和(或)胞質(zhì)，這提示腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF不僅以旁分泌方式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞并誘導(dǎo)血管新生，也可以通過自分泌途徑與自身表面的受體結(jié)合而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或遷移、抑制細(xì)胞凋亡. Witte等6制備的可與KDR特異性結(jié)合的mAb DC101，在體外能抑制VEGF與受體的結(jié)合，阻斷VEGF誘導(dǎo)的信號(hào)傳

16、導(dǎo)；Bruns等7用DC101治療前列腺轉(zhuǎn)移直腸癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)該治療不僅抑制小鼠腫瘤血管的生成，而且導(dǎo)致腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的死亡，這些結(jié)果表明抑制腫瘤細(xì)胞細(xì)胞和或腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上VEGF受體的表達(dá)，不僅可阻止腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，也可抑制腫瘤血管的生成，從而阻斷腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移. 本研究構(gòu)建的三個(gè)針對(duì)KDR基因的siRNA載體在前列腺癌細(xì)胞系PC3內(nèi)表達(dá)了針對(duì)KDR基因的shRNA，結(jié)果表明針對(duì)3號(hào)KDR基因位點(diǎn)的pSilencer3.1 KDR3載體有效地抑制了PC3細(xì)胞中KDR基因和蛋白的表達(dá). Schubert等8報(bào)道siRNA的干涉效率是受靶RNA的局部二級(jí)結(jié)構(gòu)影響. pSilencer3.1

17、KDR1和pSilencer3.1KDR2可能處于RNA的局部二級(jí)結(jié)構(gòu)或者是其大部分堿基對(duì)處于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的“莖”位置，而pSilencer3.1KDR3可能是靶序列局部結(jié)構(gòu)中的非配對(duì)堿基所占比例較大，則siRNA易于與其結(jié)合，從而得到較好的干涉效果，而本研究siRNA靶RNA的局部二級(jí)結(jié)構(gòu)的猜測(cè)，有待進(jìn)一步證實(shí). 雖然靶位點(diǎn)選擇的成功與否與其在mRNA中所處位置及二級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，但是pSilencer3.1KDR3能夠抑制PC3細(xì)胞中KDR基因和蛋白的表達(dá)，從而能夠抑制VEGF和KDR的結(jié)合，阻止腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖. 該策略，為腫瘤基因治療奠定了基礎(chǔ)，也為腫瘤血管抑制治療提供了思路.【參

18、考文獻(xiàn)】 1 Strohmeyer D, Rossing C, Bauerfeind A,et al. Vascular endothelial growth factor and its correlation with angiogenesis and p53expression in prostate cancerJ. Prostate，2000，45(3)：216-224.2 Ferrer FA, Miller LJ, Andrawis RI, et al. Angiogenesis and prostate cancer: In vivo and in vitro expressio

19、n of angiogenesis factors by prostate cancer cellsJ. Urology，1998，51(1)：161-167.3 UiTei K, Naito Y, Takahashi F, et al. Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian andchick RNA interferenceJ. Nucleic Acids Res，2004，32(3)：936-948.4 Suhardja A, Hoffman H. Role of growth factors and their receptors in proliferation of microvascular endothelial cellsJ.Microsc Res Tech，2003，60(1)：70-75.5 Underiner TL，Ruggeri B，Gingrich DE. Development of vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) kinase inhibitors as antiangio