1、iNOS抑制劑對兔關節軟骨修復組織膠原表達的影響 作者：孫煒 王吉興 金大地 劉曉霞 劉安慶【摘要】 目的 觀察誘導型一氧化氮合酶抑制劑對關節軟骨修復組織膠原表達的影響。方法 24只新西蘭大白兔雙側股骨髁間關節面造成全層軟骨缺損。隨機抽簽均分為對照組、骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)組和一氧化氮合酶抑制劑S²甲基異硫脲組(S²methylisothiourea，SMT)組。術后1年處死動物。應用苦味酸²天狼猩紅染色檢測膠原的分布情況，圖像分析技術定量膠原的表達及進行修復組織軟骨厚度的測量。應用免

2、疫組織化學技術檢測型膠原的表達和分布。結果 圖像分析顯示，1年后SMT組型膠原表達量為65.9，明顯少于BMP組88.5和對照組94.6的表達量，型膠原30.7的表達量明顯多于BMP組10.8和對照組4.5的表達量。1年后SMT組軟骨厚度(1.85±0.56) mm明顯高于BMP組(0.67±0.31) mm和對照組(0.24±0.10) mm。SMT組缺損區型膠原含量明顯高于BMP組和對照組。結論 iNOS抑制劑SMT的應用能明顯增加型膠原表達和軟骨厚度，對于維持軟骨表型有積極意義。 【關鍵詞】 一氧化氮酶 抑制劑 軟骨 S²甲基異硫脲 膠原

3、Abstract：Objective To discuss effect of collagen expression in articular cartilage repaire tissue by inducible nitric oxide synthase inhibitor SMT.Methods Full²thickness defects of cartilage were created in the trochlear groove of twenty²four adult New Zealand White rabbits.eight d

4、efects were empty，eight were filled with a collagen fibrin glue impregnated with rhBMP，eight were filled with a collagen fibrin glue impregnated with rhBMP and hypodermic injection with 5 mg/kg²1/12 h²1 SMT.The animals were killed at one²year postperatively.The tissue sect

5、ions were stained with Sirius²Red against collagen type²and type²which analyzed by Quantiment 500.Cartilage thickness was measured by Quantiment 500 too.Results One²year after collagen fibrin glue with rhBMP and with hypodermic injection SMT，collagen type&sup2

6、; expression of repair tissue in SMT group(65.9) was less than in BMP group(88.5) and the control(94.6)，and collagen type² (30.7) was more than in BMP group(10.8) and the control(4.5).Cartilage thickness of SMT group(1.85±0.56) mm was significant higher than BMP group(0.67±0.31) m

7、m and the control(0.24±0.10) mm.Conclusion NOS inhibitor SMT could increase collagen type²expression and decrease collagen type²expression，as well as make phenotype good. Key words：nitric oxide synthase；inhibitor；cartilage；s²methylisothiourea；collagen 一氧化氮(nitric oxid

8、e，NO)是活潑的自由基分子，參與多種組織的代謝調節。關節軟骨自身修復能力十分有限，關節軟骨損傷通常會導致更嚴重的關節軟骨退變，既往研究已采用多種方法來修復和重建關節軟骨，許多技術已被廣泛應用于臨床。而一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS) 抑制劑有助于軟骨組織修復。因此本文應用苦味酸²天狼猩紅染色，研究軟骨修復組織中膠原纖維的表達變化，了解NOS抑制劑對軟骨修復組織膠原表達的影響。 1 材料與方法 1.1 研究對象與實驗分組 實驗于1999年6月至2001年2月在南方醫科大學完成。取8個月齡新西蘭兔24只，雄性，體重(2.5±0.2)

9、kg。隨機抽簽法分為對照組、骨形態發生蛋白組(bone morphogentic protein，BMP)和誘導型一氧化氮合酶抑制劑S²甲基異硫脲(S²methylisothiourea，SMT)組，動物由南方醫科大學提供。 動物模型和標本處理：8月齡新西蘭兔24只，隨機分為對照組、BMP組和SMT各8只。在右側股骨髁間關節面上作直徑4.5 mm、深達髓腔的全層缺損。a)對照組：軟骨缺損不充填任何物質；b)BMP組：缺損用BMP纖維蛋白凝膠復合物充填；c)SMT組：缺損應用膠原復合BMP充填，術后按5 mg·kg1·12 h1皮下注射SM

10、T。術后1年各組處死動物，制作石蠟切片用于檢測。 1.2 苦味酸²天狼猩紅染色顯示膠原分布：石蠟切片，0.1的天狼猩紅飽和苦味酸溶液(0.1 g天狼猩紅溶于100 mL苦味酸溶液)染60 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。偏振光顯微鏡下觀察。 1.3 軟骨、型膠原圖像分析 在40倍視野下，每張切片上選擇10個縱向視野，以正常軟骨、型膠原色度為參照。利用LeicaQ500MC圖像分析儀，在交互式操作方式下進行測試，獲得關于膠原的體視學定量指標。將獲得的體視學參數值按體視學原理和計算公式求得每例標本的形態學定量參數值，得到各型膠原含量。軟骨厚度圖像分析：利用LeicaQ50

11、0MC圖像分析儀，100倍視野下測量修復組織表面型膠原顯示的厚度來間接測量軟骨厚度。 1.4 統計學分析 SPSS 8.0軟件包完成統計處理，數值均以±s表示，Paired²samples T test作均數的顯著性檢驗。 2 結 果 2.1 偏振光顯微鏡下觀察 在偏振光顯微鏡下，型膠原表現為較強的雙折光，緊密排列，為黃色或紅色的纖維。型膠原顯示弱的雙折光，呈現綠色混合顏色的疏松纖維。術后1年，對照組修復組織內基本未見綠色纖維，以致密粗大黃色纖維為主，與軟骨下骨結構也有明顯差別；術后1年，BMP組基本以黃色和紅色纖維為主，中間夾雜很少量綠色弱折光纖維；術后1年，SM

12、T組仍可見大量綠色弱折光纖維，但局部有異位骨化。 2.2 軟骨修復組織/膠原分布圖像分析結果 經圖像分析，SMT組術后1年型膠原占65.9，型膠原30.7。分別與對照組型膠原(94.6)、BMP組型膠原(88.5)，對照組型膠原(4.5)、BMP組的型膠原(10.8)相比，差異有顯著性意義(P0.05)(見表1)。表1術后1年軟骨修復組織、膠原分布和厚度比較注：與對照組和BMP組相比，*P0.05。 2.3 軟骨厚度的測量 經圖像分析，1年后SMT組軟骨厚度(1.85±0.56) mm明顯高于BMP組(0.67±0.31) mm及對照組(0.24±0.10) mm

13、，其差異有顯著性意義(P0.05)(見表1)。 3 討 論 NO作為體內重要的信號傳導分子，已證實在骨關節炎發病和轉歸方面有重要作用。我們以前的研究也提示iNOS抑制劑SMT能提高軟骨修復組織的質量1，2，但由于技術的原因，均未能對軟骨修復組織內膠原變化，特別是型和型膠原作定量分析，以闡明修復組織膠原的變化規律，從而提高修復組織質量。天狼猩紅是陰離子強酸染料，易與膠原纖維中的堿性基團反應。膠原纖維在偏振光下有正的單軸雙折光屬性，與天狼猩紅結合可增強雙折射，提高分辨率3。Junqueira等4最早將苦味酸²天狼猩紅染色法應用于組織切片的膠原檢測，國內也曾用于纖維表達等方面的研究

14、5，6。 既往研究雖然采用了多種方法促進軟骨修復，許多報告均能在早期獲得缺損區透明軟骨的生成。但是這些修復組織無論是在生物學結構和形態方面，還是生物力學方面，均與正常軟骨不同。而且這些修復軟骨組織較差的功能及耐用性，隨后導致退行性退變，被纖維組織代替7、8。型膠原是軟骨組織最主要的成分，可作為軟骨的表型標記，決定了關節軟骨特性，是評價軟骨修復質量的標志之一。既往采用免疫組化技術不僅抗體來源不易，價格昂貴，操作費時，而且只能在不同切片上觀察膠原的分布情況。而苦味酸²天狼猩紅染色法可以在一張切片上同時顯示出各種膠原的分布及其相互的關系，有利于觀察軟骨修復過程中各種膠原變化的規律。

15、隨著計算機分析技術的成熟，根據不同的顏色和灰度定量分析膠原分布成為可能。我們首次采用苦味酸²天狼猩紅染色法并與病理體視學方法結合，檢測軟骨修復組織中型和型膠原的分布，以觀察一氧化氮合酶抑制劑SMT對軟骨表型維持的影響。但天狼猩紅染色對于區分型和型膠原尚不理想，我們采用正常軟骨的型膠原為基準來校正軟骨修復組織中型膠原，以此區分型膠原。同時，軟骨修復中型膠原的表達較少。圖像分析結果顯示，SMT組軟骨修復組織在術后1年型膠原明顯少于BMP組和對照組，型膠原多于BMP組和對照組。 本實驗結果提示，SMT的應用對維持軟骨修復組織的表型方面具有積極作用。但軟骨的修復組織與正常軟骨相比仍然

16、有一定差距，尤其是異位骨化及接合處的退變。但苦味酸²天狼猩紅染色法無疑是一種觀察軟骨修復組織中膠原類型、分布、含量及變化較理想的方法。【參考文獻】 1Vuolteenaho K，Moilanen T，Knowles RG，et al.The role of nitric oxide in osteoarthritisJ.Scand J Rheumatol，2007，36(4)：247²58.2孫煒，王吉興，金大地，等.一氧化氮合酶抑制劑長期作用對兔關節軟骨缺損修復的影響J.中華醫學雜志，2002，82(1)：23²26.3周明芳，程天民，馮

17、正直.抑郁對大鼠創面愈合過程中膠原含量的影響J.第三軍醫大學學報，2008，30(13)：1293²1295.4Junqueira LC，Cossermlli W，Brentani R.Differential staining of collagens of type ， and by Sirius Red and polarization microscopyJ.Arch HistolJpn，1978，41(3)：267²274.5姬文婕，周欣，楊磊.天狼猩紅²偏振光法觀察染石英小鼠肺組織膠原纖維的動態變化J.中華勞動衛生職業病雜志，2004，22(5)：361²363.6韓曉梅，趙堪興.人眼直肌Pulley系統膠原成分的實驗研究J.眼科新進展，2007，27(10)：721²724.7Peterson L，Brittberg M，Kiviranta I，et al.Autolo