1、  遼寧醫學院研究生學位論文開題報告書（科學學位）     坎地沙坦酯對糖尿病大鼠腎臟氧化應激及MCP-1表達的影響     姓 名：王素梅導 師：馮 玉教授 專 業：藥理學學位類型：基礎醫學科學碩士學位研究方向：糖尿病并發癥藥理    2011年11月30日  一、摘要 糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)系糖尿病嚴重的并發癥，也是造成其死亡率增加及患者生存質量下降的主要原因之一。其機制尚未完全闡明。

2、氧化應激、腎素一血管緊張素一醛固酮系統(RAAS)、炎癥因子、細胞內鈣離子變化等參與了DN的病理過程，其中活性氧族(reactive oxygen species，ROS)增加及機體炎癥反應在糖尿病繼發性病變中發揮著重要的生物學作用。近年來的研究認為，腎小球中由于單核細胞趨化蛋白l(MCP-l)合成和分泌增加，從而趨化和激活單核/巨噬細胞和部分T淋巴細胞，吸引其向病變部位的聚集、浸潤，經一系列炎癥反應，形成免疫復合物，以及補體活化等，導致細胞外基質(ECM)在腎小球和腎小管間質堆積，參與了DN的發生、發展。本實驗通過一次性鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射的方法建立糖尿

3、病大鼠模型，并應用坎地沙坦酯（Candesartan）干預治療。觀察坎地沙坦酯對糖尿病大鼠氧化應激及尿MCP-1的水平、腎組織MCP-1蛋白表達及腎臟結構、功能的影響，探討坎地沙坦酯腎臟保護作用及可能機制。二、立題依據1、課題研究背景糖尿病腎病是糖尿病最常見、最嚴重的慢性并發癥，隨著糖尿病發病率的逐年提高，DN已成為導致終末期腎病的主要病因之一。DN發病機制尚不十分明確，氧化應激損傷在糖尿病腎病中的作用已得到證實。此外，近年研究表明糖尿病（DM）患者機體存在低度慢性炎癥，糖尿病慢性并發癥與炎癥因子的增加密切相關。坎地沙坦酯作為一種血管緊張素受體拮抗劑，可在受體水平完全阻斷Ang的作用，對腎臟有

4、保護作用，但其作用機制目前仍不完全明確。因此，本實驗通過建立糖尿病大鼠模型，并應用坎地沙坦酯（Candesartan）干預治療。觀察坎地沙坦酯對糖尿病大鼠氧化應激及尿MCP-1的水平、腎組織中MCP-1的蛋白表達及腎臟結構、功能的影響，探討坎地沙坦酯腎臟保護作用及可能機制。2、目前國內外研究現狀及分析DN早期病理特征是腎小球肥大、基底膜增厚和腎小球系膜區細胞外基質(extracelluar matrix，ECM)堆積，晚期則表現為腎小球硬化和間質纖維化。 DN的病因和發病機制至今尚未完全闡明，近年來研究認為DN是在高血糖狀態下腎內糖代謝紊亂與血流動力學因素共同參與、相互作用的結果，近年研究揭示

5、DN的發病在代謝紊亂與血流動力學機制基礎上，炎癥機制是其持續發展的關鍵因素。DN早期對腎內血液動力學改變方面起著非常重要作用的腎局部腎素-血管緊張素系統（RAS）在其后期的病程發展中的推動作用與其觸發炎癥反應相關。已有研究證實，糖尿病處于一種慢性低水平的炎癥狀態。眾多的臨床研究顯示,糖尿病常伴有多種炎癥因子濃度的升高, 炎性標志物能夠預測糖尿病的發生。Leinonnen等通過試驗證明糖尿病患者的CRP、白介素-6等炎癥因子水平較正常對照組明顯升高。Freeman等提出, 在中年男性中CRP是獨立于糖尿病其它危險因素的預測糖尿病發生的物質。此后, 大量臨床流行病學調查進一步證實了多種炎癥因子可以

6、預測糖尿病的發生。亦有試驗證明抗炎治療可明顯改善糖尿病患者炎癥反應及并發癥。研究表明單核/巨噬細胞的趨化積聚對最后的腎臟損傷有著重要影響，MCP-1被認為是引起其作用的重要調節因子，影響著巨噬細胞浸潤和腎小球硬化，與其有相關聯的通路成為近年來研究的方向。坎地沙坦酯作為一種血管緊張素1型受體拮抗劑，可在受體水平完全阻斷Ang的作用，對腎臟有保護作用，但其作用機制目前仍不完全明確。本研究通過觀察探討坎地沙坦對糖尿病腎臟氧化應激及MCP-1表達的影響，進一步探討坎地沙坦（Candesartan）對糖尿病腎病的保護作用機制。3、課題研究的目的、意義已有研究表明，炎癥反應在糖尿病腎病發生發展中起重要作用

7、。其中重要的致炎因子血管內皮生長因子（VEGF）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和結締組織生長因子（CTGF）等參與介導DN的發生和炎癥損傷。因此，抑制這些致炎因子或其相關信號通路，可做為預防或延緩糖尿病腎病的重要策略之一。本課題觀察坎地沙坦酯對糖尿病腎臟氧化應激以及MCP-1表達的影響，旨在探討坎地沙坦酯對糖尿病腎病的保護作用及機制，從而為糖尿病腎病的發生機制和臨床治療提供實驗性理論依據。三、 研究內容及創新點研究內容：1.       研究坎地沙坦酯對糖尿病腎臟氧化應激的作用。2.    

8、;   觀察坎地沙坦酯對糖尿病尿MCP-1的水平、腎組織MCP-1蛋白表達的影響3.       觀察坎地沙坦酯對糖尿病腎臟結構、功能的影響。創新點：1.       研究坎地沙坦酯對糖尿病腎臟氧化應激的作用。2.       觀察坎地沙坦酯對糖尿病腎組織MCP-1蛋白表達、尿MCP-1的水平的影響，探討坎地沙坦酯腎臟保護作用及可能機制。四、技術路線   SD大鼠40只DM坎地

9、沙坦酯低劑量組5mg/kg/d坎地沙坦酯高劑量組10mg/kg/d NC1% STZ溶液50mg/kg枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液測血糖、尿白蛋白、肌酐24h尿蛋白排泄率(UAER) 病理變化尿MCP-1測定MCP-1的蛋白表達及半定量分析ELISA法免疫組化法Western印跡法PAS染色腎重/體重、氧化應激指標檢測尿MCP-1測定                     

10、0;       五、研究方案1糖尿病大鼠模型的制備及分組 健康SD大鼠40只，雄性200250g左右（由遼寧醫學院實驗動物中心提供），適應性飼養1周后，隨機分為3組，正常對照組（NC）10只，糖尿病模型組（DM）10只， 坎地沙坦酯用藥組（Cand）20只（低、高劑量組各10只）。DM組和Cand組均一次性給予鏈脲佐菌素（Sigma 公司）50mg .kg-1（體重）左下腹腔注射，72h后尾靜脈取血，用血糖儀測血糖，血糖16.7mmol.L-1，尿糖陽性者定為糖尿病大鼠模型。NC組給予等量檸檬酸緩沖液尾靜脈注射。DM大鼠成

11、模后1周，Cand組按低、高劑量分別給予坎地沙坦酯5 、10mg.kg-1.d-1,溶于0.9%氯化鈉溶液1.5 mL，灌胃1次，連續12周。DM組及NC組以等量生理鹽水灌胃。各組大鼠均給標準飼料喂養，自由飲水，每兩周測一次血糖。表 1 實驗動物分組組 別動物數（只）灌胃正常對照組（NC）10生理鹽水糖尿病組(DM)10生理鹽水坎地沙坦酯低劑量組（Cand1）105 mg.kg-1.d-1坎地沙坦酯高劑量組（Cand2）1010mg.kg-1.d-12、標本收集飼養12周后，用代謝籠準確收集24h尿標本，記錄尿量，禁食12h后稱重。用20烏拉坦(5 mL.kg-1)麻醉大鼠，頸總動脈取血2ml

12、，離心10min( 3000r.min-1)，分離血清，-80保存備用。腎臟稱重后，以冰生理鹽水沖洗干凈，分離皮、髓質，左腎皮質凍存于-80 冰箱中備用，右腎皮質以10%中性甲醛溶液固定，PBS沖洗 ,石蠟包埋 ,制成4m切片備用。3.具體檢測方法3.1 血糖、血肌酐、24小時尿白蛋白排泄率(UAER)測定采用日立7180全自動生化分析儀測定血肌酐。采用尿微量白蛋白檢測試劑盒（膠體金法）測定24小時尿白蛋白，UAER=尿白蛋白水平（g.mL-1）×24h尿量（mL）。3.3腎組織MDA 含量、SOD 、GAT 、GSH-Px活性測定丙二醛（MDA）用硫代巴比妥酸（TBA）法，超氧化物

13、歧化酶（SOD）活性用黃嘌呤氧化酶法，過氧化氫酶（GAT）活性用化學比色法，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性用二硫代二硝基苯甲酸法，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。3.4腎組織形態學觀察取腎組織，用10%甲醛溶液固定，特殊脫水處理，浸蠟包埋，按下列步驟行PAS染色：常規切片厚2 m3 m，脫蠟至水；0.5高碘酸氧化6 min8 min，蒸餾水洗; 無色品紅加蓋避光染7 min10 min，不經水洗，擦凈組織旁多余染液; 0.5偏重亞硫酸鈉作用1 min，水洗2 min5 min; Harris蘇木素復染1 min左右，水洗; 1鹽酸酒精分化片刻，自來水反復洗; 溫水返蘭，梯度酒精脫水，二

14、甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡觀察（×100）隨機采集100個腎小球，根據系膜基質增寬的程度行半定量評分：0=正常腎小球；1=系膜增寬面積25%(輕度)；2=系膜增寬面積在25%50%之間（中度）；3=系膜增寬面積在50%75%之間（中度至重度）；4=系膜增寬面積在75%100%之間（重度）。3.5免疫組化方法檢測MCP-1蛋白表達石蠟切片標記編號后置于60烤片機中 90min二甲苯二甲苯每次均 10-15min100%酒精 2-5min100%酒精 2-5min95%、95%、90%、80%酒精每次 2-5min蒸餾水 2-5minPBS 2-5min高壓熱修復 2min自然冷卻 3

15、0min滴加正常小羊血清封閉液，室溫20分鐘甩去多余液體，不洗滴加適當稀釋的抗室溫靜置1小時或4過夜或371小時PBS洗3次各2分鐘滴加生物素化抗，37 20min，PBS洗3次各2min滴加試劑SABC 37 30minPBS洗3次各2minDAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色脫水、透明、樹膠封片、鏡檢貼標簽鏡檢及保存。陰性對照用PBS代替抗。采用CM-2000B生物醫學圖像分析系統測量切片MCP-1的平均灰度值。3.6western印跡檢測MCP-1蛋白表達及半定量分析取大鼠腎組織，立即放入預冷的裂解緩沖液中 1 % Triton，0.1 % SDS，0.5 %去氧膽酸，EDTA 1 mmo

16、l·L-1，Tris ( pH 7.4) 20 mmol·L-1，NaCl 150 mmol·L-1，NaF 10 mmol·L-1，苯甲基磺酰氟化物（PMSF）0.1 mmol·L-1 ，4 超聲粉碎后，12000× g 離心30 min，取上清，用Lowry 法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白（BSA）為標準品，將各組蛋白濃度調成一致。用10 %12 %的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質，每個泳道蛋白上樣量為20 g。為了準確判斷目的蛋白帶的位置，一個泳道加SeeBlue Plus 2 預染蛋白標記物，電泳后

17、將PAGE凝膠中的蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜上，取出后將膜放入3 % BSA阻斷緩沖液中，封閉60 min，再用TBS Tris (pH 8.0) 10 mmol·L-1，NaCl 150 mmol·L-1 洗膜3次，每次10 min。將膜放入一抗中（抗體1:500稀釋），4 過夜。TTBS沖洗后，將膜放入二抗(二抗均1:500稀釋)中，室溫孵育1-2 h，然后用TTBS洗膜3次，每次10 min。將膜在SuperSignal West Pico底物工作液中孵育5 min，吸干多余試劑，放置化學發光凝膠系統分析儀中進行Ecl 化學發光。測定MCP-1。每個抗體測定時都進行-

18、肌動蛋白測定，以保證蛋白上樣量的一致性。利用Visionworks 6.3.3.圖像采集及分析軟件對蛋白帶進行分析。實驗重復3次。4、數據處理方法實驗數據用 表示，用SPSS11.0軟件進行統計學分析。采用one-way ANOVA和LSD-t 檢驗進行兩兩比較。5、質量控制方法嚴格遵循實驗操作方法及實驗儀器操作規則。（1）實驗設置正常對照組，不添加任何干預因素，以減少非處理因素對實驗結果的影響。 （2）實驗組和對照組的選取完全采取隨機原則，使非處理因素對實驗組和對照組的影響是相當的。 （3）在相同的條件下，進行多次實驗，提高實驗結果的可靠性。六、主要儀器設備和試劑鏈脲佐菌素（STZ）美國Si

19、gma公司坎地沙坦酯美國Sigma公司血糖儀及試紙美國強生系列CM-2000B生物醫學圖像分析系統北京大恒圖有限公司酶標分析儀中國LEICA-RM2135石蠟切片機德國萊卡公司全自動免疫組化染色儀美國DAKOCYTOMSTION低溫離心機德國Eppendorf公司日立7180全自動生化分析儀日立公司BIO-RAD電泳槽美國伯樂 七、課題前期研究基礎及可行性分析1、課題前期研究基礎：（1）糖尿病大鼠的成功造模。（2）已熟練掌握課題中實驗。2、可行性：（1）遼寧醫學院藥理研究室擁有先進的設備。為本課題的研究奠定了良好的基礎。本人廣泛查閱了相關文獻報道，對本實驗的目的、原理及實驗方法有了一

20、定程度的了解，對實驗中可能出現的一些困難有了一定的解決能力。藥理研究室的老師在該領域有著很豐富的經驗，能夠給予本人指導。（2）通過查閱國內外相關文獻，已基本了解了實驗相關技術。（3）實驗所需的儀器及設備基本具備，遼寧醫學院動物中心可提供實驗動物，各種藥品、試劑可從相關廠家購到。（4）已掌握SPSS統計軟件的使用方法。八、課題中關鍵問題及解決的措施1、動物模型制備以及喂養過程中死亡。需要老師指導動物模型制備，優化飼養條件，以達到實驗要求。2、光鏡、免疫組化結果不理想。實驗前熟練技術流程，實驗過程中嚴格操作，并請教有關老師及同學幫助。3、western檢測結果不理想。實驗前熟練技術流程，嚴格掌握實驗條件以及所需試劑的質量。九、年度研究計劃         2011.11-2012.01 查閱文獻，寫綜述         2012.02-2012.4 開題報告，預實驗