1、第 14卷第 2期 大 連 水 產 學 院 學 報 Vol. 14No. 2 1999年 6月 JOURNAL OF DALIAN FISHERIES UNIVERSIT Y Jun . 1999 綜述文章編號 :1000-9957(1999 02-0054-08轉基因魚的研究進展譚海東 1, 張 波 1, 朱春陽 1, 郝景泉 2(1. 遼寧省農業科學院大連生物技術研究所 , 大連 116023; 2. 遼寧省鐵嶺市農業局 , 鐵嶺 112000摘要 :轉基因魚的外源基因構建需要有啟 動子、目的 基因和 終止子 等 , 常用外 源基因 的 導入 方法有顯微注射、電穿孔等 , 并 介紹了 外源

2、基 因表達 模式及 常用的 標記 基因。轉 基因魚的研究比較落后 , 當務之急是從分子水平上分析魚類的生理現象及表達基因的結構。關鍵詞 :轉基因魚 ; 啟動子 ; 顯微注射 ; 電穿孔中圖分類號 :Q953 文獻標識碼 :A近幾十年來 , 隨著分子遺傳學的迅速發展 , 許多生物轉基因成為現實。從 1980年 以后 , 轉基因研究已用于各種動物。尤其在 1982年 , Palm iter 1報道了給小鼠受精卵的 雄性原核導入大鼠的生長激素基因 , 獲得了快速生長的 超級小鼠 , 比平常的小鼠大 一倍 , 引起了人們的極大興趣。在魚種改良上 , 轉基因技術已用于各方面的研究。在基礎領域內 , 被應

3、用于遺傳基 因的整合、反式作用因子的機能分析及導入外源基因產生的蛋白質引起的生理機能分析 等 2。如反式作用因子的組織特異性和時期特異性 , 用培養細胞的方法進行分析比較 困難 , 但用轉基因方法分析就容易。像澳大利亞斑馬魚可靠調節環境因素 , 在全年內都 可以得到受精卵。用魚卵來進行外源基因的導入實驗 , 比較適合分析初期發生的外源基 因表達。另外 , 轉基因技術也被應用于魚類育種上 3。以往為了向魚類導入和固定有用的 外源基因 , 一直采用雜交技術 , 但這種技術用來固定目的基因需要的時間長 , 而且時常 發生有害基因的積累 , 給表現型帶來不良影響 ; 還有雜交親本具有不親和性 , 其遺

4、傳特 征難以預測。與此相比 , 在目的基因的蛋白質被確定的情況下 , 如果把目的基因單個分 離 , 改變后轉入個體中去 , 就可能使其遺傳特征在短期內轉給個體或表達增強。為了進 一步使外源基因傳給下一代 , 通過把這些個體有計劃的進行交配的方法 , 可在短期內確 定具有目的基因的體系。如上所述 , 導入外源基因不管是在基礎研究上還是在水產育種上 , 都有許多優點。 為此 , 作者就轉基因魚類外源基因的構建、導入及表達進行介紹。收稿日期 :1998 01 27作者簡介 :譚海東 (1971 , 男 , 助理研究員。1 外源基因的構建外源基因的構建至少需要三個部分 :啟動子、目的基因和終止子。啟動

5、子是 DNA 分子上結合 RNA 聚合酶并形成轉錄起始復合物的區域 , 它和增強子 (增強轉錄活性的 結構 一起構成基因轉錄的順勢結構。終止子是使轉錄終止的序列 , 它構成基因轉錄的 主要反式因子 , 保證翻譯到適當位置停止 , 以免出現過長的蛋白質。順勢作用因子和反 式作用因子協同調節基因轉錄的精確性、靈活性 , 特別是在細胞生長、發育、分化過程 中起重要的調控作用。目前還沒有對魚類基因順反因子進行詳細分析的例子 , 僅限于對 鯉魚的 -肌動蛋白 4、鮭魚的金屬硫蛋白 5、美洲大綿 魚 尉 及寒帶比目魚的抗凍蛋白 6等少數基因的研究。因此 , 至今轉基因魚所采用的啟動子和增強子中很多是來自高

6、等動 物或以高等動物為宿主的病毒的啟動子和增強子。生長激素基因和抗凍蛋白基因是當前 目的基因研究的熱點。終止子的研究至今未見報道。1 1 啟動子和增強子1 1 1 來自病毒基因的啟動子和增強子在基因導入魚類中 , 采用最廣泛的還是來自高等動物病毒的啟動子和增強子 , 以魚 類細胞為宿主的病毒啟動子和增強子的分析工作幾乎沒有進行 , 因此挪用高等動物細胞 內病毒的啟動子和增強子。如 SV 40(猴病毒 40 是感染猿猴的一種病毒 , 這種病毒的 啟動子和增強子在哺乳動物中的應用非常廣泛 7, 已在鯉魚的上皮細胞 8、鮭魚的肝 細胞 9中發現活性。現正向各種魚類導入 , 但僅能確認有低水平的表達。

7、 RSV 是感染 雞的一種勞氏肉瘤病毒 , 在高等動物細胞內其啟動子和增強子活性很高 , 特別是 LT R (長末端重復序列 表達非常強的活性 10, 是在魚類 (如金魚、斑馬魚、鮭魚等 中使 用最廣泛的啟動子和增強子。腺病毒是感染新生兒的一種皰疹病毒 , 在斑馬魚細胞內這 種病毒的啟動子和增強子有活性 , 在初期胚培養中推算出其活性是 RSVLTR (勞氏肉 瘤病毒長末端重復序列 近 2倍。 SV 40的啟動子和增強子與一種病毒的 LTR 組合的啟 動子和增強子在鮭魚的初期胚中也顯示出 RSVLTR 的 2倍活性 11。1 1 2 來自魚類基因的啟動子和增強子就期望目的基因有較高水平的表達或

8、表達組織特異性、時期特異性來說 , 一般用來 源于宿主細胞的啟動子和增強子是最合適 , 即對于轉基因魚來源于魚類的啟動子和增強 子是最合適的?？箖龅鞍资悄蠘O海冰點下棲息魚類具有的蛋白質 , 可防止冰點下體液凍 結 12?？箖龅鞍资窃诟闻K中產生的 , 在其它魚類 (即原先不含抗凍蛋白的魚類 上也 被斷定有活性。來源于美洲大綿 魚 尉 、寒帶比目魚的抗凍蛋白的啟動子和增強子的活性 也是通過導入其它魚中被發現的。將寒帶比目魚的抗凍蛋白基因的啟動子和增強子導入 大西洋鮭中 , 抗凍蛋白在大西洋鮭的肝臟中有很強的表達 , 但這種抗凍蛋白的啟動子和 增強子在斑馬魚初期胚的研究中其活性不如 RSV 的 LT

9、R 及后文要提到的肽鏈延伸因 子 3, 這和抗凍蛋白在肝臟組織特異性表達有關。金屬硫蛋白是在肝臟中產生的能結合金屬的蛋白質 , 對重金屬有解毒作用。由于這 , 55第 2期 譚海東等 :轉基因魚的研究進展表達。在鮭魚中分離出 2種金屬硫蛋白基因 , 對其啟動子和增強子的分析正在進行 5, 另外投入鋅可以誘導外源基因在魚胚中的表達 13。以上的抗凍蛋白和金屬硫蛋白基因是在特定組織的特定條件下表達非常強的基因。 另外有些基因能在所有的組織中表達 , 這些基因被稱為管家基因。如果把管家基因的啟 動子和增強子與特定的基因結合導入魚中 , 就能在所有的組織中表達。為達此目的 , 在 魚類上采用了來源于肽

10、鏈延伸因子基因的啟動子和增強子。 -肌動蛋白是構成細胞骨 架的蛋白質 , 來自鯉魚的 -肌動蛋白基因的啟動子和增強子已被詳細分析 4。EF1 是一種合成蛋白質必需的肽鏈延伸因子 , 在真核細胞有較高的活性 14。大西 洋鮭的 EF1 在斑馬魚中顯示較高的活性 , 其活性在下一代仍能被確定 15。1 1 3 來自高等動物的啟動子和增強子前述的金屬硫蛋白基因的啟動子和增強子首先是在小鼠中發現的 , 后來用于金魚、 泥鰍、鮭魚、鲇魚及大西洋鮭中 2, 但明確發現外源基因的例子很少。在鮭魚、大西 洋鮭中報道了其活性 16, 但被染色體整合的狀態尚未發現。來源于小鼠的熱擊蛋白的 啟動子和增強子在斑馬魚的

11、初期胚上顯示出非常高的活性。有人使用小鼠金屬硫蛋白基因的啟動子和增強子在虹鱒的肝臟細胞中表達目的基因 的強度只有使用其自身的金屬硫蛋白基因的啟動子和增強子的 1/2018。另外利用進行 轉基因時 , 外源基因不應含有病毒的有潛在危害的 DNA 序列 , 因此 , 許多學者一致強 調構建 全魚基因 的重要性和迫切性 19, 20。1 2 目的基因1 2 1 生長激素基因對魚類目的基因的研究是從生長激素基因開始的 , 朱作言 21首先運用轉基因技術 將人的生長激素基因的重組 DNA 導入魚的受精卵中。隨后在泥鰍 22, 23、闊尾 23、鯽 魚 22, 24、縮骨鯽 25、青魚 26、虹鱒 19,

12、 27、溝鯰 27、羅非魚 28、鮭魚 16, 29、魴 等 生長激素的導入相繼成功。Zhang 30通過 RSV 的 LTR 向鯉魚導入虹鱒的生長激素互補 DNA, 生長速度比普 通魚類快 20%, 而且這種特性可以遺傳給下一代。美洲大綿 魚 尉 抗凍蛋白基因的啟動子 和增強子連接鮭魚的生長激素互補 DNA 基因一起導入大西洋鮭 , 結果其生長速度比對 照組快 46倍 , 最高的可達 30倍 3, 而且這種大西洋鮭的下一代同樣顯出較高的生長 率。由于抗凍蛋白基因的啟動子和增強子在肝臟中活性最高 , 所以有人開始考察在肝臟 中產生的生長激素是否與肝臟中存在生長激素的受體有關。近來在黑鯛的研究中

13、發現 , 生長激素不僅可以促進生長 , 還可以提高魚苗的成活率 31。1 2 2 抗凍蛋白基因當海水溫度低到冰點以下 , 很多魚不能生存 , 而前面介紹的具有抗凍蛋白的魚類卻 能生存。如果把這種基因導入普通的魚類 , 使它們在體內產生抗凍蛋白 , 這樣即使在冰 點以下也可以養殖普通的魚類。56大 連 水 產 學 院 學 報 第 14卷 , (2 外源基因的導入2 1 顯微注射法 32外源基因的導入最常用的方法是給魚卵進行顯微注射 , 即把外源基因吸入玻璃細管 內在顯微鏡下注入魚卵。斑馬魚、鮭魚、大西洋鮭、鯉魚、美國鲇魚、泥鰍、金魚、鯽 魚等均被采用 。通常外源基因是在受精卵第一次卵裂前注入胚孔

14、中?？婶~類的卵膜非 常堅硬 , 微管難以通過。為克服這一點 , Chourrout 27用金屬針打開孔后 , 再用玻璃微 管進行顯微注射。由于鯉科魚的卵膜易被蛋白質分解酶分解 , 有的研究人員除去卵膜后 再進行顯微注射 33, 34。另外 , 鮭科魚類的卵膜吸水后開始硬化 , 在大麻哈魚上可采用 剛受精卵膜尚未硬化就進行顯微注射的方法 19, 35。還有 , 一些魚類的受精孔容易確定 , 通過開孔進行顯微注射 28。近來 , Yoshizaki 36發現鮭魚的卵在還原型谷胱甘肽溶液中受精能防止卵膜硬化 , 并找到了非常容易進行顯微注射的方法。 Ozato 37把即將成熟的卵母細胞取出 (未受精

15、卵卵膜不硬化 , 向此卵母細胞進行注射。綜上所述三種顯微注 射法為 :一是從受精孔將 DNA 溶液注入卵中 , 簡稱 MP 法 ; 二是在受精卵剛受精后卵 殼尚未變硬時直接注射 , 簡稱 EI 法 ; 三是用金屬針在卵殼上打一個孔 , 再進行顯微注 射 , 簡稱 LI 法。2 2 電穿孔法所謂電穿孔法 , 是在細胞 DNA 的混合液中加入電脈沖 , 使細胞膜臨時被破壞 , 這 樣細胞外存在的 DNA 分子既可流入細胞內。這種方 法本來只用于細胞培養方面的技 術 , 可是用于混有精子、卵子的 DNA 溶液中 , 也可以得到導入外源基因的魚。此法用 于斑馬魚 38, 39、美國大麻哈 魚 38、鯉

16、魚 38、泥鰍 40的受精卵及斑馬魚 41、大麻哈魚 42, 43的精子 , 成功地把外源基因導入魚內 , 該方法具有能輕易處理大量精子和卵子 的優點 , 但存在著外源基因導入率低于顯微注射的問題?？捎械膱蟮?PCR 法 (聚合酶 鏈式反應 檢測電脈沖法導入外源基因的大麻哈魚是否存在外源基因時 , 結果全部個體 均被檢出外源基因 38, 這個高導入率可能與 PCR 的經驗靈敏度非常高有關。也就是 說 , 由于電脈沖法很難像顯微注射法那樣向細胞內導入同樣多的外源基因 , 所以認為每 個細胞所含外源基因的拷貝數要比注射法所得到的拷貝數低一些。同樣理由可以推測 , 電穿孔法得到的個體是含外源基因極低

17、的嵌合體。2 3 基因槍注射法基因槍注射法是通過把吸附 DNA 的金屬微粒高速打入細胞內 , 使基因導入細胞內 的方法。有人在泥鰍、斑馬魚、鮭魚的三日胚上應用此法 44, 結果 70%的個體生存 , 一部分個體導入了外源基因。此法不僅容易進行 , 而且有短期可處理多個個體的優點 , 只是現在的報道太少 , 有待今后研究。2 4 逆轉錄病毒感染法 57第 2期 譚海東等 :轉基因魚的研究進展細胞的染色體上 , 從這種納入病毒基因組的細胞產生的細胞染色體內就存在了病毒基 因。如果把目的基因組合到病毒染色體上 , 用改造的病毒侵染宿主細胞就有可能向細胞 內導入外源基因 45, 但轉基因病毒有嚴格的宿

18、主特異性 , 而且魚類轉基因病毒的分析 非常落后 , 對于魚類很難適應此法。有人用能廣泛感染宿主的 VSV (水皰性口炎病毒 的 G-蛋白組合的病毒感染斑馬魚的胚 , 表明外源基因不僅可以導入魚內 , 而且還有外 源基因導入時很少改變的優點 46。2 5 組織注射法有報道外源基因向體組織直接注射時 , 周圍細胞把外源基因納入 , 并且發現了那種 外源基因。有人把 CAT (鏈霉素轉移酶基因 注射到一些魚的體側肌肉上 , 從肌肉勻 漿中檢出 CAT 活性 47。另一方面 , 把含有合成黑色素的互補 DNA 質粒注射到一些魚 的體側肌肉上 , 使周圍體表合成黑色素 , 體表黑化 47。這種方法能非

19、常容易地把外源 基因導入細胞內 , 所以對檢出外源基因啟動子非常有效。2 6 精子攜帶法最近 , 有人報道把脫水的精子懸浮于低濃度的 DNA 溶液中 , 在細胞外液流入最旺 時加入電脈沖 , 細胞外 DNA 向精子內流動效率提高 48。另外 , 精子與 DNA 共培養 , 使一部分精子獲得外源基因 , 并且 DNA 與精子的結合效率較高 2, 但有必要探討導入 率及重復性。3 外源基因的表達關于快速生長轉基因魚的表達、產生方法和機制 , 朱作言 49已做了詳細的研究。 筆者只介紹一下外源基因的表達模式及標記基因。3 1 每個階段外源基因的表達模式向魚卵導入外源基因 , 被宿主染色體整合 , 同

20、時其表達模式在初期發育中也有很大 幅度的變化。向鮭魚內導入 RSVCAT (勞氏肉瘤病毒氯霉素轉移酶基因 , 囊胚期以前 的時期未能全部確認 , 可在囊胚期開始至發眼期為止 , 發現有高水平的表達 , 孵化期表 達量開始下降 50。抗凍蛋白基因的啟動子和增強子活性在發眼期前后開始上升 , 而在 孵化期下降 7。 -肌動蛋白的啟動子和增強子在受精后 35d 顯示出高活性 , 其后急 劇減少 8。如上所述 , 由于所采用的啟動子和增強子或宿主的不同 , 其表達模式有所 差異 , 但均在孵化期前后表達量減少。因此 , 可以推測在初期胚過程中暫時表達的基因 是未被染色體整合的外源基因 , 當外源基因被

21、分解排除后 , 表達量就急劇減少。但在鮭 魚的每一個細胞 DNA 量非常少的 12d 胚中 , 在發眼期也有外源基因的高度表達 , 與此 時期 RSVLTR 活性化起作用有關。向鮭魚內導入 RSVCAT , 受精后 70d 開始看到被染 色體結合的基因得到表達 , 從其個體得到下一代個體的一部分也表達了 RSVCAT 。在 鯉魚中導入 RSV 的 LTR 生長激素互補 DNA 及在大麻哈魚中導入抗凍蛋白基因 , 均在 , 在 58大 連 水 產 學 院 學 報 第 14卷第2期 譚海東等: 轉基因魚的研究進展 59 下一代中也顯示出較高活性 15 。 被染色體整合的外源基因因結合位置的不同,

22、其表達受到很大影響, 這種現象被稱 為位置效應。被整合的外源基因的表達受到附近基因的促進或抑制, 特別是導入的啟動 子和增強子活性弱時, 其影響更顯著。今后, 應重點開發被染色體整合的也能高水平正 確表達的啟動子和增強子。 3 2 標記基因 如上所述, 采用各種魚進行外源基因的表達研究, 從復制水平上分析, 通常采用探 針雜交技術; 在蛋白質水平上, 是用抗體和抗原特異結合的特性來進行分析?？墒沁@些 方法測定時間長, 操作繁瑣, 低水平表達的基因很難檢出。于是在檢測外源基因的表達 時多采用標記基因, 能高靈敏度檢出轉錄、翻譯產物的基因。由于所有的標記基因都是 編碼酶的蛋白質, 所以把蛋白質加入

23、組織提取液或組織中就能檢出其酶的活性, 隨著酶 反應時間的延長來提高檢驗的靈敏度, 特別是在新啟動子和增強子開放領域內, 本方法 是必不可少的技術。對轉基因魚來說, CAT 基因、 - 半乳糖苷酶基因以及熒光素酶基 因多被采用。無論采用那種酶都能高靈敏度地、簡便地檢出表達基因。乳糖苷酶在組織 切片上也能使表達組織著色, 而且在魚類的胚原封不動的情況下也能檢出其活性, 因而 這種方法最適合外源基因在每個組織中的表達分析。熒光素酶是促進組織提取液同熒光 素發生反應的酶。小林修一 51 把 GFP ( 綠色熒光蛋白基因 導入斑馬魚, 由于 GFP 受 紫外線照射, GFP 分子本身發出熒光, 所以非

24、常容易檢出, 因此認為此法可用于活體 組織中啟動子和增強子活性的檢出。T amiya 52 通過轉基因法把螢火蟲的熒光素酶基因 導入魚體內, 可以得到能發出熒光的魚。 以上就轉基因魚的研究作了介紹, 這個領域正在高速發展, 特別是在基礎生物學領 域。同時, 基因導入技術的應用也越來越廣泛, 但不清楚的地方還很多, 當務之急是從 分子水平上分析魚類的生理現象及表達基因的結構, 以便使人們更能自如地進行轉基因 操作, 讓轉基因魚從實驗室走向生產化, 培育出具有生長快、抗病等特點的優良品種。 參 1 sion gene J . N at ure, 1992, 300( 16 : 611 615. 2

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