1、碘化N-正丁基氟哌啶醇對缺氧血管平滑肌細胞增殖的影響及其作用機制的研究                                        作者：劉清,石剛剛，陳一村，周燕瓊，郭福曉，鄭燕珊 

2、;   【摘要】  目的:研究碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)對缺氧大鼠胸主動脈平滑肌細胞(SMCs)增殖的影響，并探討其作用機制是否與早期生長反應基因-1(egr-1)有關。方法:取第34代培養的大鼠胸主動脈SMCs制作缺氧模型，應用噻唑藍比色法檢測細胞增殖情況,流式細胞術測定細胞周期,蛋白印跡雜交方法檢測Egr-1及血小板源生長因子(PDGF-A)蛋白表達情況。結果:與缺氧組比,反義寡核苷酸組及F2組比色吸光度A值、細胞周期S+G2/M期比例均下降(P<0.01)，Egr-1及PDGF-A蛋白表達均減少。結論:F2可通過抑制Egr-1蛋白表達來抑制缺氧SM

3、Cs的過度增殖。 【關鍵詞】  碘化N-正丁基氟哌啶醇;血管平滑肌細胞；缺氧;增殖；反義寡核苷酸;早期生長反應基因-1AbstractObjective : To investigate the effect and mechanism of N-n-butyl haloperidol iodide(F2)on hypoxia-induced proliferation of rat thoracic aortic smooth muscle cells(SMCs)in vitro， and to indicate the relationship between the effec

4、t of F2 and the express of early growth response gene-1(egr-1). Methods:Passages 3 to 4 of cultured rat thoracic aortic SMCs were used to establish hypoxia models. The viability of VSMC was detected by mono-nuclear cell direct cytotoxicity assay. The cell cycle was analyzed by flow cytometry. The le

5、vels of Egr-1 and PDGF-A were assessed by Western blot. Results: Compared with the hypoxia group,the absorption value,proliferation index and the levels of Egr-1 and PDGF-A of antisense oligodeoxynucleotide group and F2 group were all decreased.Conclusion: The inhibition of F2 on hypoxia-induced pro

6、liferation of rat thoracic aortic SMCs in vitro is mediated by Egr-1.Key WordsN-n-butyl haloperidol iodide; vascular smooth muscle cell; Hypoxia; proliferation； antisense oligodeoxynucleotides; early growth response gene-1    碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)是本實驗室設計合成的一種新型氟哌啶醇季銨鹽衍生物,已有實驗表明它對心肌缺血再灌注損傷以及

7、心肌細胞、內皮細胞缺氧復氧損傷具有保護作用，且這種作用與抑制早期生長反應基因-1(egr-1)mRNA及蛋白表達水平的過度升高有關16。缺氧可致血管平滑肌細胞(VSMCs)的過度增殖7，進而導致一系列血管增生性疾病。本研究擬在觀察F2對心臟整體、離體以及內皮細胞的作用基礎上，進一步觀察F2對缺氧誘導的VSMCs增殖的作用及其與Egr-1的關系。1  材料與方法1.1  儀器與試劑    倒置相差顯微鏡(上海光學儀器廠,中國);超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司,中國);CO2培養箱(Thermo Forma公司,美國);凱基MTT細胞增殖檢測試劑

8、盒以及細胞周期檢測試劑盒(凱基生物科技發展有限公司，中國)；multiskan spectrum酶標儀(Thermo Labsystem公司,芬蘭);FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson公司，美國)；聚丙烯酰胺凝膠電泳相關材料(Bio-RAD公司,美國);硝酸纖維素膜(Invitrogen公司,美國)；F2(汕頭大學醫學院藥物研究室化學組合成,結構由中國科學院上海有機化學所鑒定,實驗前用聚乙二醇溶解配成);胎牛血清(杭州四季青生物制品公司,中國);M199培養基、胰蛋白酶(GIBICO公司,美國);Egr-1 1抗以及血小板源生長因子-A(PDGF-A)1抗(Sa

9、nta Crutz公司,美國);-SMactin 1抗、辣根過氧化物酶標記2抗、即用型SABC免疫組化染色試劑盒、3,3二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，中國);Egr-1反義寡核苷酸(AD-ODN)、正義、錯義寡核苷酸(大連Takara公司,中國)。1.2  大鼠胸主動脈VSMCs培養及鑒定    SD大鼠斷頸處死，放血，無菌條件下取出胸主動脈,去除血管內、外膜,將中膜組織以貼塊法行原代培養,細胞融合后用質量分數0.25%的胰蛋白酶消化傳代。倒置顯微鏡下觀察,呈現VSMCs特征性的“峰”、“谷”狀生長。小鼠抗大鼠-SMact

10、in單克隆抗體免疫細胞化學鑒定,陽性細胞達95%以上,實驗用第34代細胞。1.3  寡核苷酸的細胞轉染方法及熒光標記檢測    平滑肌轉染前1d換用無血清無抗生素培養基培養，先將脂質體LipofectamineTM 2000 Reagent溶入轉染液(M199培養基)中，每800L轉染液稀釋32L脂質體，輕輕混勻，室溫孵育5min。同時將AD-ODN、正義或錯義寡核苷酸也溶入轉染液中，每800L轉染液稀釋16g寡核苷酸，輕輕混勻，然后將兩者混合，室溫孵育20min,加入到6400L的M199培養基中,用此溶液換掉原培養基,繼續培養36h后進行下一步實驗。

11、將5端有異硫氰酸(FITC)標記的AS-ODN轉染VSMCs(步驟同上)，入37、體積分數5%的CO2細胞培養箱中避光培養8h，然后在488nm的激發光源下觀察熒光標記的AS-ODN轉染情況。1.4  實驗分組    取34代SD大鼠胸主動脈VSMCs隨機分為對照組；缺氧組；F2組(1×10-6mol/L)；PEG組(1×10-6mol/L)；AS-ODN組；正義寡核苷酸組；錯義寡核苷酸組；脂質體組(寡核苷酸的轉染按其細胞轉染方法進行)。所有組用無血清培養基孵育24h后換成體積分數10的胎牛血清培養基，除對照組在37、5% CO2普通

12、細胞培養箱內孵育16h外，其余組均放入自制的缺氧盒5內缺氧16h。1.5  MTT比色法測定VSMCs增殖    將細胞消化制成5×107個/L的細胞懸液，以每孔100L的量接種于96孔培養板中，用含10%胎牛血清的M199培養液置37、5% CO2細胞培養箱中培養24h，按照實驗分組要求培養后，每孔加入50L 1×MTT溶液,在37繼續孵育4h后吸出上清液,每孔加入150L DMSO,用平板搖床搖勻，用酶標儀在550nm波長處檢測每孔的吸光度(A值)。1.6  VSMCs細胞周期的測定   

13、取第3代生長良好的VSMCs,按實驗分組要求培養后分別消化,離心,收集細胞于離心管,再用PBS洗滌細胞1次(106g,離心10min),收集并調整細胞濃度為1×109/L的細胞懸液,用體積分數70的冷乙醇固定,4保存。染色前用PBS洗去固定液，加100L RNaseA 37水浴30min,再加入400L PI染色混勻，4避光30min,上機檢測。1.7  Egr-1及PDGF-A蛋白測定    Egr-1蛋白測定用的是缺氧2h模型，PDGF-A蛋白測定用的是缺氧16h模型。做完模型后培養瓶中的細胞用PBS洗滌2次,0.25%的胰蛋白酶和質量分數

14、0.2%的乙二胺四乙酸(11)消化收集,再加入PBS漂洗2次,106g,離心10min(4),棄上清液,沉淀中加入適量的單去污裂解液,冰上裂解30min。15294g,離心10min(4),取上清液,采用Bradford法測定蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液,100變性4min后備用。                          

15、60;      配制質量分數10%(測Egr-1時)或15(測PDGF-A時)的分離膠與質量分數5%的濃縮膠,完全凝固后,每泳道加70g蛋白樣品,經電泳(125V,70min)和轉膜(100V,60min)后,在封閉液中封閉2h,然后加入1400的Egr-1或PDGF-A抗體稀釋液,4過夜,緩沖液洗膜3次,每次10min,再加12000的二抗稀釋液室溫孵育2h,洗膜3次,每次10min,加化學發光試劑于膜上,反應1min,壓片,曝光后將膠片進行顯影、定影。1.8  統計學處理    結果以x±

16、s表示，用SPSS 11.0統計軟件進行分析,用單因素方差分析進行組間比較。2  結果2.1  AS-ODN在VSMCs中的轉染    同一視野下，SMCs所在位置與FITC標記的AS-ODN發光的位置相一致，成功轉染入VSMCs(圖1)。2.2  F2及AS-ODN對VSMCs增殖的影響    與缺氧組比,F2、AS-ODN組的吸光度A值均下降(P<0.01)，說明AS-ODN和F2均能抑制缺氧誘導的VSMCs增殖(表1)。表1  各組VSMCs的吸光度A值（略）2.3  F2

17、及AS-ODN對VSMCs細胞周期的影響    與缺氧組比,F2、AS-ODN組均可使SG2/M期的細胞比例下降,G0/G1期的上升(表2)。表2  各組VSMCs的細胞周期（略）2.4  F2及AS-ODN對VSMCs的Egr-1和PDGF-A蛋白表達的影響    與缺氧組比,F2、AS-ODN組的Egr-1以及PDGF-A蛋白表達均減少(圖2、3)。3  討論    F2可改善心肌缺血再灌注損傷；心肌細胞、內皮細胞缺氧復氧模型上,可降低egr-1RNA及蛋白表達水平，減弱

18、細胞炎癥反應的程度。F2對缺血再灌注心肌組織損傷和缺氧復氧心肌、內皮細胞損傷具有良好的保護作用。    Egr-1與血管損傷后VSMCs增殖與再生密切相關8，9。冠狀動脈擴張后再狹窄的發生機制與egr-1基因轉錄的激活有著密切聯系。Khachigian等10用靶向egr-1基因的AS-ODN方法明顯抑制了球囊擴張術后再狹窄的發生。Santiago等11用靶向egr-1基因的AS-ODN在機械損傷的模型上,證實了這種損傷所致VSMCs增殖與再生是egr-1依賴性的。實驗證實Ang上調VSMCs的PDGF-A鏈表達也是egr-1依賴性的12。實驗中，我們檢測了不同缺氧

19、時間VSMCs增殖情況以及不同缺氧時間Egr-1蛋白的表達水平，發現在缺氧16hVSMCs增殖最明顯，而Egr-1表達在缺氧1h后明顯升高，2h達高峰，此后逐漸下降，直到20h仍然高于對照組。因此，我們將靶向egr-1mRNA的AS-ODN轉染入VSMCs,在缺氧模型上觀察到AS-ODN組VSMCs的過度增殖受到明顯抑制，證實了egr-1與缺氧所致的VSMCs增殖的因果關系，這與文獻報道相一致。    PDGF可促進多種細胞的分裂增殖。研究表明，PDGF作為egr-1的下游基因，在VSMCs增殖中發揮關鍵作用8。本實驗表明，用靶向AS-ODN抑制egr-1基因的表

20、達后，PDGF-A表達也明顯下降,提示PDGF誘導VSMCs的增殖與egr-1有關。通過MTT比色法，表明F2、AS-ODN組均能抑制VSMCs增殖。流式細胞實驗結果表明，F2、AS-ODN組均能降低缺氧VSMCs的S期和G2/M期細胞的比例，增加G0/G1期細胞比例，抑制VSMCs的過度增殖。Western blot證實，F2、AS-ODN組能抑制PDGF-A的表達。這進一步證實了F2通過抑制Egr-1的表達來抑制缺氧誘導的VSMCs的過度增殖。 【參考文獻】  1Zhang YM, Shi GG, Zheng JH, et al. The protective effe

21、cts of N-n-butyl haloperidol iodide on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats by inhibiting Egr-1 overexpressionJ. Cell Physiol Biochem, 2007, 20(5): 639-648.2郭福曉, 石剛剛, 張艷美，等. 碘化N-正丁基氟哌啶醇對心肌細胞缺氧復氧損傷保護作用機制的研究J. 汕頭大學醫學院學報, 2006, 19(4): 207-210.3賈強用, 石剛剛, 呂艷秋，等. 碘化N-正丁基氟哌啶醇減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷作用的機制研究J

22、. 汕頭大學醫學院學報, 2006, 19(4): 197-200.4周燕瓊, 石剛剛, 高分飛, 等. 碘化正丁基氟哌啶醇對大鼠心肌缺血再灌注損傷血流動力學的影響J. 中國藥理學通報, 2004, 20(4): 449-452.5Gao FF, Shi GG, Zheng JH, et al. Protective effects of N-nbutylhaloperidol iodide on myocardial ischemia-reperfusion injury in rabbitsJ. Chin J Physiol, 2004, 47(2): 61-66.6唐昭, 石剛剛, 張艷美, 等. 碘化N-正丁基氟哌啶醇對Egr-1轉錄及表達的影響J. 中國臨床藥理學與治療學, 2004, 12(4): 1 343-1 348.7Gao G, Lin SX, Wang R, et al. The inhibitory effect of endogenous opioid peptide on