1、實訓二 血清-球蛋白的分離純化與鑒定目的要求 1了解蛋白質分離提純的總體思路。 2掌握鹽析法、分子篩層析法、離子交換層析等實驗原理及操作技術。 實驗原理 血清中蛋白質按電泳法一般可分為五類：清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白和-球蛋白，其中-球蛋白含量約占16，100ml血清中約含1.2g左右。 首先利用清蛋白和球蛋白在高濃度中性鹽溶液中(常用硫酸銨)溶解度的差異而進行沉淀分離，此為鹽析法。半飽和硫酸銨溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白則仍溶解在溶液中，經離心分離,沉淀部分即為含有-球蛋白的粗制品。 用鹽析法分離而得的蛋白質中含有大量的中性鹽，會妨礙蛋白質進一步純化，因此首先必須去除。常用的

2、方法有透析法、凝膠層析法等。本實驗采用凝膠層析法，其目的是利用蛋白質與無機鹽類之間分子量的差異。當溶液通過SephadexG-25凝膠柱時，溶液中分子直徑大的蛋白質不能進入凝膠顆粒的網孔，而分子直徑小的無機鹽能進入凝膠顆粒的網孔之中因此在洗脫過程中，小分子的鹽會被阻滯而后洗脫出來，從而可達到去鹽的目的。脫鹽后的蛋白質溶液尚含有各種球蛋白，利用它們等電點的不同可進行分離。球蛋白、-球蛋白的PI<6.0；球蛋白的PI為7.2左右。因此在PH6.3的緩沖溶液中，各類球蛋白所帶電荷不同。經DEAE(二乙基氨基乙基)纖維素陰離子交換層析柱進行層析時，帶負電荷的球蛋白和-球蛋白能與DEAE纖維素進行

3、陰離子交換而被結合；帶正電荷的球蛋白則不能與DEAE纖維素進行交換結合而直接從層析柱流出。因此隨洗脫液流出的只有球蛋白，從而使球蛋白粗制品被純化。其反應式如下：用上述方法分離得到球蛋白是否純凈，單一？可將純化前后的球蛋白進行電泳比較而鑒定之。試劑和器材1試劑（1）飽和硫酸銨溶液：稱固體硫酸銨(分析純)850g，置于1000ml蒸餾水中，在70一80水溫中攪拌溶解。將酸度調節至pH7.2，室溫中放置過夜，瓶底析出白色結晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。（2）葡聚糖凝膠G一25的處理：按每100ml凝膠床體積需要葡聚糖凝膠G一25干膠 25g。稱取所需量置于錐形瓶中。每克干膠加入蒸餾水約30ml，用玻

4、璃棒輕輕混勻，置于90100水溫中時時攪動，使氣泡逸出。1h后取出，稍靜置，傾去上清液細粒。也可于室溫中浸泡24h，攪拌后稍靜置，傾去上清液細粒，用蒸餾水洗滌23次，然后加0.017mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，備用。（3）DEAE一32(二乙基氨基乙基一32)纖維素的處理：按100ml柱床體積需DEAE纖維素14g稱取，每克加0.5molL鹽酸溶液15ml，攪拌。放置30min(鹽酸處理時間不可太長，否則DEAE纖維素變質)。加約l0倍量的蒸餾水攪拌，放置片刻，待纖維素下沉后，傾棄含細微懸浮物的上層液。如此反復數次。靜置30min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液

5、pH>4為止。加等體積lmol/L氫氧化鈉溶液，使最終濃度約為0.5mol/L氫氧化鈉，攪拌后放置30min，以虹吸除去上層液體。同上用蒸餾水反復洗至pH<7為止。虹吸去除上層液體，然后加入0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，備用。（4）0.0175molL磷酸鹽緩沖液(pH6.3) A液：稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H20)2.730g溶于蒸餾水中，加蒸餾水稀釋至1000ml。 B液：稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H20)6.269g，溶于蒸餾水中，加蒸餾水稀釋至 1000mL。 取A液77.5ml，加于B液22.5ml，混勻后即成。（5）20%磺基

6、水楊酸溶液（6）奈氏(Nessler)試劑應用液 貯存液；稱取碘化鉀(KI)7.58g于250ml三角燒瓶中，用蒸餾水5ml溶解，再加入碘（I2） 5.5g溶解，加77.5gHg用力振搖10min(此時產生高熱，須冷卻)，直至棕紅色的碘轉變成帶綠色的碘化汞鉀液為止，過濾上清液傾入100ml容量瓶，洗滌沉淀，洗滌液一并倒入容量瓶內，用蒸餾水稀釋至100ml。 應用液：取貯存液75ml加10NaOH 350ml，加水至500mL。（7）0.9氯化鈉溶液（8）乙酸纖維素薄膜電泳有關試劑(見實驗29)2器材（1）人血清。（2）層析柱。（3）長滴管。（4）醋酸纖維素薄膜。 (5 )離心機操作方法1鹽析中

7、性鹽沉淀取正常人血清2.0ml于小試管中，加0.9氯化鈉溶液2.0ml，邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液乙4.0ml，混勻后于室溫中放置10min，3000rmin離心10min。小心傾去含有清蛋白的上清液，重復洗滌一次，于沉淀中加入0.0175molL磷酸鹽緩沖液(pH6.3)0.51.Oml使之溶解。此液即為粗提的球蛋白溶液。2脫鹽凝膠柱層析（1）裝柱：洗凈的層析柱保持垂直位置，關閉出口，柱內留下約2.0ml洗脫液。一次性將疑膠從塑料接口加入層析柱內，打開柱底部出口，調節流速0.3ml/min。凝腔隨柱內溶液慢慢流下而均勻沉降到層析柱底部，最后使凝膠床達20厘米高，床面上保持有洗脫液，操

8、作過程中注意不能讓凝膠床表面露出液面并防止層析床內出現“紋路”。在凝膠表面可蓋一園形濾紙，以免加入液體時沖起膠粒。（2）上樣與洗脫：可以在凝膠表面上加圓形尼龍濾布或濾紙使表面平整，小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降至凝膠床表面，關緊下端出口，用長滴管吸取鹽析球蛋白溶液，小心緩慢加到凝膠床表面。打開下端出口，將流速控制在0.25ml/min使樣品進入凝膠床內。關閉出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)洗柱內壁。打開下端出口，待緩沖液進入凝膠床后再加少量緩沖液。如此重復三次，以洗凈內壁上的樣品溶液。然后可加入適量緩沖液開始洗脫。加樣開始應立即收集洗脫液。洗

9、脫時接通蠕動泵，流速為0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。（3）洗脫液中NH4+與蛋白質的檢查：取比色板兩個(其中一個為黑色背底)，按洗脫液的順序每管取一滴，分別滴入比色板中，前者加20磺基水楊酸溶液2滴，出現白色混濁或沉淀即示有蛋白質析出，由此可估計蛋白質在洗脫各管中的分布及濃度；于另一比色板中，加人奈氏試劑應用液l滴，以觀察NH4+出現的情況。 合并球蛋白含量高的各管，混勻。除留少量作電泳鑒定外，其余用DEAE纖維素陰離子交換柱進一步純化。3純化DEAE纖維素陰離子交換層析用DEAE纖維素裝柱約8-10cm高度，并用0.0175molL磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，然后將脫

10、鹽后的球蛋白溶液緩慢加于DEAE纖維素陰離子交換柱上，用同一緩沖液洗脫、分管收集。用20磺基水楊酸溶液檢查蛋白質分布情況。(裝柱、上樣、洗脫，收集及蛋白質檢查等操作步驟同凝膠層析)。4濃縮經DEAE纖維素陰離于交換柱純化的球蛋白液往往濃度較低。為便于鑒定，常需濃縮。收集較濃的純化的球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2 0.25gSephadex G一25干膠，搖動23min， 3000rmin 離心5min。上清液即為濃縮的-球蛋白溶液。 5鑒定乙酸纖維素薄膜電泳取乙酸纖維素薄膜2條，分別將血清、脫鹽后的球蛋白、DEAE纖維素陰離子交換柱純化的-球蛋白液等樣品點上。然后參閱實驗二十九：乙酸纖維薄

11、膜電泳法進行電泳分離、染色。比較電泳結果。注意事項1凝膠及DEAE纖維處理期間，必須小心用傾瀉法除去細小顆粒。這樣可使凝膠及纖維素顆粒大小均勻，流速穩定，分離效果好。2裝柱是層析操作中最重要的一步。為使柱床裝得均勻，務必做到凝膠懸液或DEAE纖維素混懸液不稀不厚，一般濃度為l：l，進樣及洗脫時切勿使床面暴露在空氣中，不然柱床會出現氣泡或分層現象；加樣時必須均勻，切勿攪動床面，否則均會影響分離效果。3本法是利用-球蛋白的等電點與-、-球蛋白不同，用離子交換層析法進行分離的。因此層析過程中用的緩沖液pH要求精確。4電泳注意事項見實驗二十九。5凝膠貯存：凝膠使用后如短期不用，為防止凝膠發霉可加防腐劑

12、如0.02疊氮鈉。保存于4冰箱內。若長期不用，應脫水干燥保存。脫水方法：將膨脹凝膠用水洗凈。用多孔漏斗抽干后，逐次更換由稀到濃的乙醇溶液浸泡若干時間，最后一次用95乙醇溶液浸泡脫水，然后用多孔漏斗抽干后，于6080烘干貯存。6離子交換劑的再生和保存；離子交換劑的價格較貴，每次用后只需再生處理便能反復使用多次。處理方法是：交替用酸、堿處理，最后用水洗至接近中性。陽離子交換劑最后為Na型，陰離子以Cl型是最穩定型，故陰離子交換劑處理順序為堿一水一酸一水。由于上述交換劑都是糖鏈結構。容易水解破壞，因此須避免強酸、強堿長時間浸泡和高溫處理，一般纖維素浸泡時間為3-4h。 離子交換劑容易長霉引起變質，不用時，需洗滌干凈，加防腐劑置冰箱內保存。常用0.02疊氮鈉防腐。疊氮鈉遇酸放出有毒氣體，也是劇毒與易爆的危險品。使用時要加倍小心。 除用凝膠層析法去除無機鹽類外，最常用的去鹽法就是透析。細的透析袋效率高，所需時間短。將透析袋一端折疊，用橡皮筋結扎，試驗是否逸漏，然后倒入待透析的蛋白質溶液。勿裝太滿，將袋的上端也結扎好，即可進行透析。開始可用流動的自來水，待大部分鹽被透析出后，再改為生理鹽水、緩沖液或蒸餾水。透析最好在較低的溫度下，并在磁力攪拌器上進行。此法簡單，易操作，儀器及試劑要求不高，但不如凝膠層析法