1、    肺炎鏈球菌表面蛋白在細菌 體外粘附中的介導作用        【 摘要 】目的在體外研究肺炎鏈球菌表面蛋白對細菌粘附于宿主細胞的介導作用。 方法用FITC熒光標記肺炎鏈球菌(S、S)，用蛋白質合成抑制劑，RNA合成抑制劑和神經氨酸酶分別處理肺炎鏈球菌和小鼠腹腔巨噬細胞后，在體外觀察這些因素對細菌與巨噬細胞粘附率的影響；另外觀察細菌細胞壁提取物對上述粘附率的影響。 結果證實了粘附過程存在劑量依賴和時間依賴的關系，是特異的粘附過程。用多因素分別處理肺炎鏈球菌和巨

2、噬細胞后，其粘附率的改變與肺炎鏈球菌合成RNA和蛋白質有關，需要肺炎鏈球菌識別巨噬細胞表面糖蛋白結構的受體。肺炎鏈球菌可溶性細胞壁成分能與完整肺炎鏈球菌同樣有對巨噬細胞的粘附，去蛋白細胞壁成分則無此作用。 結論提示細菌表面蛋白介導了這一粘附過程。【 主題詞 】鏈球菌，肺炎巨噬細胞細菌粘附細胞壁膜糖蛋白類 The mediatory effects of pneumococcal surface proteins on the adherence of bacteria to host cell in vitroHuang Bin, Yin Yibing, Kang Gefei.Departme

3、nt of Clinical Biochemistry,Faculty of Laboratory Medicine,Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400046【 Abstract 】ObjectiveThe Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae is a major pathogen of pneumonia,sepsis and meningitis. To gain access to tissue within the human host, Strep

4、tococcus pnumoniae must initially attach to the surface of host cell. The recent research reported that the cell wall could mediate Streptococcus pneumoniae attachment to human endothelial cells. Although the factors of pneumococcal adhesions are still currently unknown,the surface proteins of S. pn

5、eumoniae are thought to be the potential candidates. MethodsIn this study,S. pneumoniae(S,S) were labelled by FITC, then the bacteria and mice macrophages were pretreated with the RNA,protein synthetic inhibitors and purified pneumococcal cell wall components,respectively. The effects on the adheren

6、ce between the bacteria and macrophages were studied. ResultsConclusionsThese results suggest that pneumococcal cell wall proteins mediate the interaction. 【 Subject words 】Streptococcus pneumoniaeMacrophagesBacterial adhersionCell wall protein肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是一種能引起肺炎、腦膜炎和菌血癥等疾病的重要的病原

7、菌1。目前，對S.pn粘附和致病的機理還不十分清楚。傳統認為S.pn的毒力因子主要是抗吞噬作用的莢膜，最近的研究表明莢膜對于S.pn早期粘附到宿主細胞并無影響，細胞壁(cellwall,CW)介導S.pn對血管內皮細胞的粘附，但不清楚是CW中何種成分發揮作用2。某些細菌細胞表面的蛋白質能介導細菌粘附3，但S.pn表面蛋白質是否作為毒力因子介導了粘附過程尚未見報道。并且，目前S.pn的莢膜多糖疫苗的免疫保護作用有局限性，特別是對兩歲以內的幼兒保護作用較差4。因此，研究S.pn與宿主細胞的粘附機制有重要意義。巨噬細胞是S.pn感染后宿主防御系統的第一道防線，我們通過在體外研究S.pn與小鼠巨噬細胞

8、(macrophages)粘附的機理，探討了參與粘附的病原菌和宿主方面的因素，為進一步研究S.pn的致病機理和抗菌藥物提供參考。材料與方法1. 實驗菌株及熒光標記：肺炎鏈球菌S、S標準菌株由中國醫科院提供，主要遺傳特性經鑒定合格。將S.pn在C+Y半合成培養基中37恒溫水浴靜止培養5，在對數生長中、后期取菌液約3ml (A 620= 0.5)離心，PBS洗滌細菌3次后重新懸浮使濃度達到108 CFU/ml，然后與溶解于0.05mol/L Na2 CO3 和 0.1mol/L NaCl緩沖液中的FITC(1mg/ml)混合，4標記1小時后用PBS洗滌細菌3次，重新用PBS懸浮使S.pn濃度達到1

9、08CFU/ml2。2. 小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養:取雄性812周齡BALB/c小鼠，腹腔注射1甲基纖維素1ml，72小時后用RPMI 1640沖洗腹腔收獲巨噬細胞。收獲的細胞經PBS洗滌后，用含10FCS和青霉素、鏈霉素各100U/ml的RPMI 1640配成5×105/ml，接種于直徑為4cm的小培養皿，37 5CO2條件下培養90分鐘，去除未貼壁細胞6。3. 肺炎鏈球菌對巨噬細胞的粘附實驗: 將貼壁生長的巨噬細胞(5×105/ml)用PBS洗滌后，加入有血清無抗生素的RPMI 1640培養基，再加入FITC標記的S.pn菌液(5×107CFU/ml)，加入

10、S.pn與巨噬細胞數之比為201。混合后培養皿放37 5CO2孵箱孵育6小時，取出后用PBS洗至少5次，去掉未粘附細菌。在熒光顯微鏡下觀察粘附細菌，用IF DM-510激發濾光片，在明視場下計數巨噬細胞數，暗視場下計數巨噬細胞上粘附的S.pn數，粘附以100個巨噬細胞中粘附的S.pn數表示。每個實驗做兩次，每個標本平行3孔，最后結果以±s表示2。4. 肺炎鏈球菌細胞壁的提取:將在C+Y半合成培養基中生長到對數生長中、后期的S.pn(A620=0.5)約10ml離心，無菌PBS洗滌細菌3次后加入0.5ml含 25g/ml 變溶菌素的原生質緩沖液 (含20%蔗糖、 0.0025mol/L

11、 MgSO475. 各種處理因素對肺炎鏈球菌粘附巨噬細胞的影響:在進行粘附實驗前分別用氯霉素(蛋白質合成抑制劑)、慶大霉素(蛋白質合成抑制劑)、利福平(RNA合成抑制劑)、萘定酮酸(DNA合成抑制劑)處理S.pn，37 15分鐘，胰酶(蛋白水解酶)處理S.pn，37 10分鐘，神經氨酸酶(水解糖蛋白、糖脂上的唾液酸)、CW提取物及去蛋白CW提取物處理巨噬細胞，37 30分鐘，過碘酸(糖基氧化劑)、胰酶處理巨噬細胞，37 10分鐘。再用同樣的方法做粘附實驗，觀察這些因素對S.pn粘附巨噬細胞的影響。結果1. 肺炎鏈球菌對小鼠巨噬細胞的粘附動力學:結果表明(見1、2)，S.pn粘附小鼠巨噬細胞的過

12、程存在時間依賴和劑量依賴的關系，提示粘附作用的發生是特異的。通過雙倒數作法我們求出S粘附巨噬細胞的H50(粘附為50%最大粘附時所需的時間)為1.9小時，最大粘附Amax為40個S.pn/100個巨噬細胞，S粘附巨噬細胞的H50為1.5小時，Amax為200個S.pn/100個巨噬細胞。S粘附巨噬細胞的A50(粘附為50%最大粘附時相應的S.pn濃度)為3.2×105CFU/ml，S的A50為5×105CFU/ml，結果表明S更易粘附于巨噬細胞。1肺炎鏈球菌粘附巨噬細胞的時間進程曲線Fig 1. Time course for adherence of S.pneumoni

13、ae to macrophages Macrophages were incubated with 5×107 CFU of S.pneumoniae per ml.Adherence is expressed as the number of attached bacteria per 100 macrophages.A:S,B:S2肺炎鏈球菌粘附巨噬細胞的劑量依賴曲線Fig 2. Dose-response curve for adherence of S.pneumoniae to macrophagesMacrophages were incubated with incre

14、asing concentrations of S.pneumoniae for 6h.Adherence is expressed as the number of attached pneumococci per 100 macrophages.A.S ,B: 2. 各種處理因素對肺炎鏈球菌粘附小鼠巨噬細胞的影響(見表1)：結果表明，用氯霉素、慶大霉素、利福平、胰酶分別處理S.pn后，S.pn對巨噬細胞的粘附都降低，提示粘附過程需要S.pn合成蛋白質和RNA，S.pn細胞表面蛋白質介導了粘附過程。用萘定酮酸處理S.pn后，并不降低粘附，表明粘附過程可能與DNA合成無關。表2結果表明，用神經

15、氨酸酶、過碘酸、胰酶分別處理巨噬細胞后粘附都大大降低，用神經氨酸酶和胰酶共同處理巨噬細胞后粘附降低尤為明顯，提示S.pn粘附于巨噬細胞需要識別巨噬細胞表面糖蛋白性質的結構。表1各種因素分別處理S后對粘附的影響Table 1. Effect of different pretreatments of S on S adherence of macrophagesPretreatmentAdherence()P valueControl165.7±10.4Chloramphenicol(30.0g/ml)141.7± 8.7<0.05Gentamicin(40.0g/ml

16、) 133.5± 6.3<0.05Rifampin(32.0g/ml)138.3±10.8<0.05Nalidixic acid(20.0g/ml)161.3± 8.6>0.05Trypsin(0.025) 92.6± 6.5<0.01表2各種因素分別處理巨噬細胞后對粘附的影響Table 2. Effect of different pretreatments of macrophages on S adherence of macrophagesPretreatmentAdherence()P valueControl165.7

17、±10.4Neuraminidase(1U/ml)23.5±4.1<0.01Periodic acid(4.0mmol/L)47.8±3.6<0.01Trypsin(0.025)34.2±4.8<0.01Neuraminidase & trypsin10.4±2.5<0.013. 肺炎鏈球菌細胞壁提取物在粘附中的作用:從3中可以看出，S.pn CW提取物降低了完整S.pn對巨噬細胞的粘附，這種作用與CW提取物的量存在劑量依賴關系。通過雙對數作法求出I50值(抑制率為50最大抑制率時相應的CW提取物濃度)為22.3

18、8g/ml。去蛋白質CW作用于巨噬細胞30分鐘后，完整S.pn對巨噬細胞的粘附為160.5±8.3，與對照(未用CW處理巨噬細胞)的粘附結果165.7±10.4相比，P>0.05，無統計學意義，未提示去蛋白CW提取物對完整S.pn粘附巨噬細胞有影響(3)。 討論我們通過一系列粘附實驗發現，S.pn粘附于小鼠巨噬細胞這個過程存在劑量依賴和時間依賴的關系，且是特異的，是宿主細胞和S.pn共同參與的過程。這個過程與S.pn合成RNA和蛋白質有關，可能與合成DNA無關，并且需要巨噬細胞表面糖蛋白性質的結構參與。Geelen2曾報道，無莢膜的S.pn并不降低對宿主細胞的粘附，有

19、無莢膜對粘附并無影響。因此我們的這個結果對于揭示S.pn的早期粘附機制具有重要意義。已有資料表明，在炎癥激活的宿主細胞表面，S.pn的受體為PAF受體，所含糖基結構為GlcNAc8，而在靜息期宿主細胞表面受體為糖脂或糖蛋白，糖基結構為GalNAc1-3Gal、GalNAc 1-4Gal、GlcNAc 1-3Gal9。3肺炎鏈球菌細胞壁對完整細菌粘附巨噬細胞的影響曲線Fig 3. Inhibition of adherence of S.pneumoniae to macrophages by pneumococcal cell wall(CW)Macrophages were incubate

20、d with increasing concentrations of CW for 30 min prior to addition of intact pneummococci(5×107 CFU/ml).Results were normalized to adherence of S.pneumoniae to control macrophages unincubated with CW,which was set at 100% 我們用變溶菌素作用S.pn，37 1小時后，可得到CW提取物。在處理過程中，S.pn細胞表面自溶酶同時發揮作用，自溶酶識別S.pn細胞壁多糖磷酸

21、膽堿殘基，通過水解丙氨酸和N-乙酰胞壁酸之間的共價連接將肽聚糖水解為肽鏈和聚糖骨架10，而變溶菌素破壞S.pn CW肽聚糖骨架上N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的-1,4糖苷鍵分子連接，因此使S.pn CW肽聚糖骨架水解而保留CW上的蛋白質。將用這種方法得到的S.pn CW提取物(含蛋白質、聚糖骨架片段、脂多糖等)先與巨噬細胞作用30分鐘后，再加入完整S.pn觀察其對巨噬細胞的粘附，發現S.pn CW提取物與完整S.pn對巨噬細胞具有同樣的粘附作用，而去蛋白CW成分則無此作用，提示S.pn粘附于巨噬細胞需要S.pn CW表面蛋白質的介導，它通過識別小鼠巨噬細胞表面糖蛋白結構的受體，在S.pn

22、 CW和巨噬細胞之間形成架橋，從而通過直接或間接的作用(直接作為粘附素或調節粘附素的表達或介導LTA與宿主細胞受體連接)介導S.pn粘附于小鼠巨噬細胞。這為進一步研究S.pn的致病機理，鑒定S.pn CW表面參與粘附的特異蛋白質及其生物學性質、功能，以及發展新一代抗菌藥物奠定了一定基礎。作者單位：400046 重慶醫科大學醫學檢驗系參考文獻1Burman LA,Norrby R,Trollfors. Invasive pneumococcal infections: incidence,prepdisposing factors, and prognosis. Rev Infect Dis,1

23、985,7133-142.2Geelen S,Bhallacharyya C,Tuomanen E, et al.The cell wall mediates pneumococcal attachment to and cytopathology in human endothelial cells. Infect Immun,1993,61(4)1538-1543.3Westerlund B, Korhonen TK. Bacterial protein binding to the mammalian extracellular matrix. Mol Microbiol,1993,9687-694.4Alonso De Velasco E,Verheul AFM,Verhoef J,et al. Streptococcus pneumoniae virulence factors, pathogenesis, and vaccines. Rev Microbiol, 1995,59(4)591-603.5Lacks S, Hotchkizz RD. A study