1、培養(yǎng)基質(zhì)量控制作業(yè)指導(dǎo)書1、目的：為加強(qiáng)我微生物實驗室的工作管理，保證實驗室的檢測質(zhì)量，特制定此作業(yè)指導(dǎo)書；2、范圍：本規(guī)范適用于實驗室微生物檢測中所使用培養(yǎng)基的質(zhì)量控制。3、職責(zé)：3.1 檢驗人員：按照本規(guī)程規(guī)對培養(yǎng)基使用前及使用過程中進(jìn)行質(zhì)量控制，確保培養(yǎng)基符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求。3.2 科室負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)指導(dǎo)、監(jiān)督檢驗人員對培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量控制。4、控制措施：41培養(yǎng)基的購置和驗收 培養(yǎng)基的購置試劑管理員在接到批準(zhǔn)的采購信息后，從合格供應(yīng)商中選擇廠商采購，同時要求廠商提供每批培養(yǎng)基的批號、使用前的pH值、儲藏信息、有效期、性能評價記錄（包括測試菌株、技術(shù)數(shù)據(jù)清單、質(zhì)控證書及必要的安全危害數(shù)據(jù)）。

2、 培養(yǎng)基的驗收購買培養(yǎng)基到貨后，由試劑管理員和微生物檢測人員共同核對生產(chǎn)企業(yè)提供的資料、培養(yǎng)基名稱、規(guī)格數(shù)量、外觀特征、批號、保質(zhì)期是否符合要求。同時應(yīng)填寫“培養(yǎng)基驗收檢查記錄單”驗收符合要求后，交由檢測人員接受保管，填寫培養(yǎng)基入庫記錄和建立試劑臺帳。4 2培養(yǎng)基的儲存干粉培養(yǎng)基應(yīng)保存在陰涼干燥處，要避免陽光直射；開瓶后的干粉培養(yǎng)基易吸濕，應(yīng)注意防潮并在有效期或6個月內(nèi)用完。應(yīng)每月對儲存中的培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)檢查，如容器密閉性復(fù)查、首次開封日期、內(nèi)容物的感官檢查，如果培養(yǎng)基發(fā)生結(jié)塊、顏色異常和其他變質(zhì)跡象就不能再使用。開封的脫水培養(yǎng)基，每次使用前應(yīng)對其質(zhì)量進(jìn)行檢查，通過粉末的流動性、均勻性、結(jié)塊情

3、況和色澤變化等判斷培養(yǎng)基的質(zhì)量變化。若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基受潮或物理性狀發(fā)生明顯改變則不應(yīng)再使用。即用性培養(yǎng)基按照產(chǎn)品標(biāo)識要求進(jìn)行儲存。4 3培養(yǎng)基的使用 配制培養(yǎng)基用水和玻璃器皿培養(yǎng)基制備用水應(yīng)使用電阻率不小于30萬cm的蒸餾水或與其同質(zhì)的水，每周檢測電阻率，每三個月檢測一次重金屬離子含量。制備培養(yǎng)基所用的玻璃器皿（如吸管、試管、燒杯等）新的玻璃器皿（首次使用）和再次使用的玻璃器皿按規(guī)定方法洗滌、干燥 稱量 稱量時要用專用的角匙，避免交叉污染而影響檢驗結(jié)果；干粉培養(yǎng)基易吸潮，如房間環(huán)境濕度較大時，應(yīng)提高稱量速度，完畢后及時蓋緊瓶蓋。 復(fù)水 復(fù)水時應(yīng)注意以下事項：a）不得用銅鍋或鐵鍋，以防有離子混入培養(yǎng)

4、基中，影響微生物的生長；b）容器的大小需大于復(fù)水后培養(yǎng)基總體積的2倍以上，避免在加熱溶解過程中，培養(yǎng)基溢出；c）加熱培養(yǎng)基時一定要進(jìn)行攪拌，特別是瓊脂類培養(yǎng)基；d）為避免燒焦和沸騰溢出，對于少量的培養(yǎng)基最好使用沸水浴進(jìn)行加熱；e）含有瓊脂粉的培養(yǎng)基，在加熱溶解之前可以浸泡數(shù)分鐘； f）對于瓊脂類培養(yǎng)基進(jìn)行再融化時應(yīng)使用沸水浴或流動蒸汽進(jìn)行加熱，最多只能加熱兩次，第二次再融化后仍未用完的培養(yǎng)基應(yīng)棄去；g）燒糊的培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)被破壞，并可產(chǎn)生有毒物質(zhì)，如發(fā)現(xiàn)焦化，或未溶解均勻前培養(yǎng)基有溢出，該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備。 滅菌 培養(yǎng)基采用高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌），通常是12115min，含糖或特

5、殊培養(yǎng)基，按照國家標(biāo)準(zhǔn)或生產(chǎn)商提供的說明滅菌。已配制好的培養(yǎng)基必須在15分鐘內(nèi)滅菌，避免微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分，改變培養(yǎng)基的酸堿度。為避免高溫破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，降低瓊脂的凝膠強(qiáng)度，必須嚴(yán)格控制滅菌溫度和時間，不可重復(fù)滅菌。 pH測定 在初次使用每批培養(yǎng)基時，均需隨同檢測配制一個測試培養(yǎng)基，在滅菌或消毒后應(yīng)在25溫度下采用精密PH 試紙測試PH值，并判斷是否符合要求；使用過程中，如果需要調(diào)整培養(yǎng)基的pH，應(yīng)用1mol/LNaOH或lmol/LHCL調(diào)整，注意不可反復(fù)調(diào)pH，否則會影響培養(yǎng)基的滲透壓。 4.3.6 配制好的培養(yǎng)基標(biāo)識和保存 滅菌以后培養(yǎng)基應(yīng)該迅速冷卻至所需溫度，避免長時間保存

6、在滅菌鍋內(nèi)，造成過度滅菌，影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分或選擇性效果。同時填寫配制記錄。內(nèi)容：名稱、配制量、配方（比）、操作中的重要參數(shù)（時間、壓力、溫度）、配制日期、配制者、截止使用日期。在每個已滅菌的培養(yǎng)基容器外做好標(biāo)記，注明名稱、配制日期、使用期限和配制人。培養(yǎng)基保存注意事項：1）環(huán)境條件：各種培養(yǎng)基均應(yīng)在潔凈的普通冰箱內(nèi)保存，以2-8左右為宜，不得凍結(jié)。2）保存時限: 基礎(chǔ)培養(yǎng)基應(yīng)在30天內(nèi)用完。鑒別培養(yǎng)基應(yīng)在21天內(nèi)用完。選擇性分離鑒別培養(yǎng)基制成平板后當(dāng)日用完,置保鮮膜(袋)密閉保存期限可延長至一周。從外單位購買的培養(yǎng)基保存時限按照產(chǎn)品標(biāo)注的時限執(zhí)行.44培養(yǎng)基批號的的管理培養(yǎng)基的批號由6位阿

7、拉伯?dāng)?shù)字組成，批號為年、月、日，各取2位，年份取后2位，月和日不足2位時，分別在數(shù)字前加0，表明是本日配制的批號。如2004年6月4日配制的培養(yǎng)基，批號為040604。 4.5質(zhì)量檢查購置的同一批次培養(yǎng)基其質(zhì)量檢查應(yīng)能通過無菌檢查（制備好的培養(yǎng)基經(jīng)3035培養(yǎng)48小時，真菌培養(yǎng)基經(jīng)2025培養(yǎng)72小時候后，應(yīng)無菌生長）、新購的不同批次的商品化培養(yǎng)基在使用前應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基性能測試，經(jīng)檢查合格的該批次培養(yǎng)基方準(zhǔn)許使用，否則不準(zhǔn)使用，做好檢查記錄。成品培養(yǎng)培養(yǎng)基的質(zhì)量控制應(yīng)包括物理指標(biāo)和微生物指標(biāo)的測試，根據(jù)測試結(jié)果及時填寫“實驗室培養(yǎng)基質(zhì)量控制性能測試記錄及評估報告4.5 培養(yǎng)基的性能測試 新購的不

8、同批次的商品化培養(yǎng)基在使用前應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基性能測試，包括物理指標(biāo)和微生物指標(biāo)的測試，根據(jù)測試結(jié)果及時填寫“實驗室培養(yǎng)基質(zhì)量控制性能測試記錄及評估報告，菌株的選擇參考SN/T 1538.2-2007培養(yǎng)基制備指南 第2部分：培養(yǎng)基性能測試實用指南。 451物理指標(biāo)控制1） 測試2025的pH值2）瓊脂層厚度；色澤；透明度和（或）是否存在肉眼可見雜質(zhì)；452微生物污染的控制從每批制備好的培養(yǎng)基中選取至少一個（或1%）平板或試管，置于35-37或按特定標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的溫度培養(yǎng)48h應(yīng)無菌生長，真菌培養(yǎng)基經(jīng)2025培養(yǎng)72小時候后，應(yīng)無菌生長。 453微生物學(xué)指標(biāo)控制可根據(jù)要求選用定量方法、半定量方法或定性

9、方法（詳見表1-表）對培養(yǎng)基性能進(jìn)行測試，具體操作方法如下：（1）生長率將適量測試菌株的工作培養(yǎng)物接種至固體、半固體和液體培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基上菌株的生長率應(yīng)達(dá)規(guī)定的最低限值。1）定量方法生長率PR的計算： PR = NS/NONS：從一個或多個待測培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù)。N0：從一個或多個規(guī)定的參考培養(yǎng)基平板上獲得的菌落總數(shù)（該菌落總數(shù)應(yīng)100cfu ）。要求：非選擇性培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長率最低應(yīng)為0.7，該類培養(yǎng)基應(yīng)易于目標(biāo)菌生長；選擇性培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長率最低應(yīng)為0.1；每平板（或每試管）的接種水平為10CFU100CFU。2） 半定量方法半定量方法采用生態(tài)測量技術(shù)在平板上劃線，平

10、板板連續(xù)劃線區(qū)域得分的總和即為生長指數(shù)G，G值不應(yīng)超過標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的允許范圍。3） 定性方法定性方法采用劃線法觀察。選擇性將濃度為104CFU/mL106CFU/mL的非目標(biāo)菌工作菌株懸浮液接種至選擇培養(yǎng)基和參考培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的選擇性應(yīng)達(dá)到規(guī)定值。定量方法選擇因子SF： SF = DO - DSDO：能在參考培養(yǎng)基上生長至少10個菌落的最高稀釋度DS：能在測試培養(yǎng)基上顯示生長的最高稀釋度 要求：非目標(biāo)菌在選擇性培養(yǎng)基上的SF至少為2 ；半定量和定量法中，非目標(biāo)菌應(yīng)部分或全部被抑制。生理生化特性（選擇性和特異性）規(guī)定培養(yǎng)基的基本特性，使用一套適當(dāng)?shù)臏y試菌株對培養(yǎng)基上的目標(biāo)菌的生理生化特性（菌落形態(tài)

11、、大小等）和非目標(biāo)菌的被抑制程度進(jìn)行測試。（2）性能評價和結(jié)果解釋按照規(guī)定得到的所有測試菌株的性能均符合規(guī)定，則該批培養(yǎng)基品質(zhì)優(yōu)良；若只有物理指標(biāo)和微生物指標(biāo)符合規(guī)定，則該批培養(yǎng)基可被接收。表1 計數(shù)用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)基用途培養(yǎng)條件測試菌株參考培養(yǎng)基控制方法判定標(biāo)準(zhǔn)特征反應(yīng)Baird-ParkerS生長率3724-48h金黃色葡萄球菌ATCC6538/25923TSA定量PR0.5黑色/灰色菌落，周圍為一混濁帶，其外有透明帶選擇性3748h大腸桿菌ATCC25922/8739定性全部抑制特異性3724-48h表皮葡萄球菌ATCC12228定性黑色/灰色菌落，周圍為一混濁帶，其外無透明帶MYPS

12、生長率3024-48h臘樣芽胞桿菌ATCC11778TSA定量PR0.7具沉淀帶的粉色菌落選擇性3748h大腸桿菌ATCC25922定性全部抑制特異性3748h 枯草芽胞桿菌ATCC6633定性不具沉淀帶的粉色菌落培養(yǎng)基用途培養(yǎng)條件測試菌株參考培養(yǎng)基控制方法判定標(biāo)準(zhǔn)特征反應(yīng)VRBG（結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂）S生長率3724h大腸桿菌ATCC25922/8739TSA定量PR0.5帶有或不帶沉淀帶的粉紅色或紅色菌落鼠傷寒沙門菌ATCC14028選擇性3720h糞鏈球菌ATCC29212/19433定性全部抑制VRBL（紫紅膽汁乳糖）S生長率3020h大腸桿菌ATCC25922/8739TSA

13、定量PR0.5帶有或不帶沉淀帶的淡紫色菌落選擇性3020h糞鏈球菌ATCC29212/19433定性全部抑制特異性3020h銅綠假單胞菌ATCC27853定性-無色至淺棕色菌落CT-SMAC（改良山梨醇麥康凱瓊脂）S生長率3724h大腸桿菌O157：H7ATCC43894/43895TSA定量PR0.5透明菌落，表面淡黃棕色，菌落直徑約1mm選擇性3724h金黃色葡萄球菌ATCC6538/25923定性全部抑制特異性3724h大腸桿菌ATCC11775/25922定性粉色菌落BGBLB（煌綠乳糖膽鹽肉湯）L生長率3024-48h大腸桿菌ATCC25922/8739TSA半定量濁度2+，導(dǎo)管1/

14、3產(chǎn)氣產(chǎn)氣并渾濁弗氏檸檬酸桿菌ATCC25922/8739選擇性糞鏈球菌ATCC29212/19433定性不生長ECL生長率442448h大腸桿菌ATCC25922半定量濁度2+，導(dǎo)氣管1/3產(chǎn)氣產(chǎn)氣并渾濁選擇性442448h銅綠假單胞菌ATCC27853b定性不生長EC-MUG/LS-MUGL生長率442448h大腸桿菌ATCC25922半定量濁度2+，導(dǎo)氣管1/3產(chǎn)氣產(chǎn)氣并渾濁，產(chǎn)生熒光選擇性442448h銅綠假單胞菌ATCC27853b定性不生長乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)L生長率3724h大腸桿菌ATCC25922半定量導(dǎo)氣管1/3產(chǎn)氣產(chǎn)氣并變黃色選擇性3724h鼠傷寒沙門菌ATCC14028定性

15、不產(chǎn)氣、仍為紫色LST（月桂酸肉湯）L生長率3724h大腸桿菌ATCC25922半定量導(dǎo)氣管1/3產(chǎn)氣選擇性3724h福氏志賀氏菌CMCC51572定性表2 計數(shù)用非選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)基用途培養(yǎng)條件測試菌株參考培養(yǎng)基控制方法判定標(biāo)準(zhǔn)特征反應(yīng)PCA（平板計數(shù)瓊脂）S生長率3072h大腸桿菌ATCC25922/8739TSA定量PR0.7金黃色葡萄球菌ATCC6538枯草芽孢桿菌ATCC6633表3 選擇性增菌培養(yǎng)基培養(yǎng)基用途培養(yǎng)條件測試菌株控制方法判定標(biāo)準(zhǔn)特征反應(yīng)EEL生長率3724h大腸桿菌ATCC25922/8739半定量VRBG上10CFU粉紅至紅色菌落，有或沒有沉淀帶鼠傷寒沙門菌ATCC1

16、4028選擇性糞腸球菌ATCC29212全部抑制RVSL生長率41.524h鼠傷寒沙門菌ATCC14028半定量XLD或其他選擇性培養(yǎng)基上10CFU腸炎沙門氏菌ATCC13076銅綠假單胞菌ATCC27853選擇性41.524h大腸桿菌ATCC25922半定量TSA上全抑制糞鏈球菌ATCC29212TSA上10CFUSC(亞硒酸鹽胱氨酸)L生長率3724h鼠傷寒沙門菌ATCC14028半定量XLD或其他選擇性培養(yǎng)基上10CFU不同培養(yǎng)基上菌落特征不同（見標(biāo)準(zhǔn)）+大腸桿菌ATCC25922+銅綠假單胞菌ATCC27853b選擇性3724h大腸桿菌ATCC25922半定量TSA上10CFU糞鏈球菌

17、ATCC29212TTB(四硫磺酸鈉煌綠增菌液)L生長率3724h鼠傷寒沙門菌ATCC14028半定量XLD或其他選擇性培養(yǎng)基上10CFU不同培養(yǎng)基上菌落特征不同（見標(biāo)準(zhǔn)）傷寒沙門菌CMCC50071選擇性3724h大腸桿菌ATCC25922TSA上10CFU堿性蛋白胨水L生長率3724h霍亂弧菌CMCC16109半定量TCBS或其他選擇性培養(yǎng)基上10CFU不同培養(yǎng)基上菌落特征不同（見標(biāo)準(zhǔn)）副溶血性弧菌CMCC20001選擇性3724h大腸桿菌ATCC25922/8739TSA上10CFU福氏志賀氏菌CMCC515727.5%氯化鈉肉湯L生長率3724h金黃色葡萄球菌ATCC6538半定量B-

18、P平板或其他培養(yǎng)基上10CFU不同培養(yǎng)基上菌落特征不同（見標(biāo)準(zhǔn)）表4 非選擇性增菌培養(yǎng)基培養(yǎng)基用途培養(yǎng)條件測試菌株控制方法判定標(biāo)準(zhǔn)特征反應(yīng)BHI生長率3724h金黃色葡萄球菌ATCC6538定性濁度12蛋白胨鹽L稀釋202545min大腸桿菌ATCC25922定量+/-50%菌落數(shù)/至（+/-50%原始菌落數(shù)金黃色葡萄球菌ATCC25923表4 非選擇性增菌培養(yǎng)基（續(xù)）培養(yǎng)基用途培養(yǎng)條件測試菌株控制方法判定標(biāo)準(zhǔn)特征反應(yīng)乳糖蛋白胨肉湯L生長率3724h大腸桿菌ATCC25922定性導(dǎo)氣管1/3產(chǎn)氣選擇性3724h鼠傷寒沙門菌ATCC14028定性SCDLP液體培養(yǎng)基L生長率3724h銅綠假單胞菌

19、ATCC27853定性濁度12大腸桿菌ATCC25922金黃色葡萄球菌ATCC6538液體沙氏培養(yǎng)基L生長率265天白色念珠菌CMCC98001定性濁度12真菌培養(yǎng)基L生長率265天白色念珠菌CMCC98001定性濁度12表5 選擇性分離培養(yǎng)基培養(yǎng)基用途培養(yǎng)條件測試菌株控制方法判定標(biāo)準(zhǔn)特征反應(yīng)亞硫酸酸鉍瓊脂（BS）S生長率3748h鼠傷寒沙門菌ATCC14028定性良好生長(2)菌落呈黑色，有金屬光澤福氏志賀氏菌CMCC51572菌落呈棕色選擇性大腸桿菌ATCC25922/8739全部或部分抑制（01）無典型菌落糞鏈球菌ATCC29212/19433全部抑制（0）-XLDS生長率3724h鼠傷

20、寒沙門菌ATCC14028定性良好生長(2)菌落呈黑色福氏志賀氏菌CMCC51573菌落呈無色選擇性大腸桿菌ATCC25922/8739全部或部分抑制（01）無典型菌落糞鏈球菌ATCC29212/19433全部抑制（0）-血瓊脂平板S生長率372448h金黃色葡萄球菌ATCC6538/25923定性良好生長溶血，透明溶血環(huán)糞鏈球菌ATCC29212定性良好生長溶血,草綠色溶血環(huán)TCBSS生長率372448h霍亂弧菌CMCC16109定性良好生長菌落較大，呈黃色副溶血性弧菌CMCC20001定性良好生長菌落較大，呈綠色4號瓊脂S生長率372448h霍亂弧菌CMCC16109定性良好生長菌落較大、扁平透明、濕潤、中心帶有黑色非O1群霍亂弧菌CMCC17045定性良好生長菌落較大、扁平透明、濕潤、中心帶有黑色選擇性3724h大腸桿菌ATCC25922/8739定性全部或部分抑制（01）表5 選擇性分離培養(yǎng)基（續(xù)）培養(yǎng)基用途培養(yǎng)條件測試菌株控制方法判定標(biāo)準(zhǔn)特征反應(yīng)伊紅美蘭瓊脂S生長率3724h大腸桿菌ATCC25922/8739定性良好生長菌落紫黑色帶金屬光澤鼠傷寒沙門菌ATCC14028定性良好生長菌落灰白色半透明福氏志賀氏菌CMCC5