1、實驗一 蛋白質分子量的測定凝膠層析法一、原理凝膠層析法也稱分子篩層析法，是利用具有一定孔徑大小的多孔凝膠作固定相的層析技術。當混合物隨流動相經過凝膠層析柱時，其中各組分按其分子大小不同而被分離的技術。該法設備簡單、操作方便、重復性好、樣品回收率高。凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網狀結構、呈珠狀顆粒的物質，每個顆粒的細微結構及篩孔的直徑均勻一致，像篩子，小的分子可以進入凝膠網孔，而大的分子則排阻于顆粒之外。當含有分子大小不一的蛋白質混合物樣品加到用此類凝膠顆粒裝填而成的層析柱上時，這些物質即隨洗脫液的流動而發生移動。大分子物質沿凝膠顆粒間隙隨洗脫液移動，流程短，移動速率快，先被洗出層析柱；

2、而小分子物質可通過凝膠網孔進入顆粒內部，然后再擴散出來，故流程長，移動速度慢，最后被洗出層析柱，從而使樣品中不同大小的分子彼此獲得分離。若分子大小介于上述完全排阻或完全滲入凝膠的物質，則居二者之間從柱中流出?？傊?，各種不同相對分子質量的蛋白質分子，最終由于它們被排阻和擴散的程度不同，在凝膠柱中所經過的路程和時間也不同，從而彼此可以分離開來。將凝膠裝在柱后，柱床體積稱為“總體積”，以Vt表示。實質上Vt是由Vo，Vi與Vg三部分組成，Vo稱為“孔隙體積”或“外水體積”，即存在于柱床內凝膠顆粒外面空隙之間的水相體積，相應于一般層析法中柱內流動相的體積；Vi為內體積，即凝膠顆粒內部所含水相的體積。V

3、g為凝膠本身的體積。洗脫體積（Ve）與Vo與Vi之間的關系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi。式中Ve為洗脫體積，自加入樣品時算起，到組分最大濃度（峰）出現時所流出的體積；Kd為樣品組分在二相間的分配系數，也可以說Kd是分子量不同的溶質在凝膠內部與外部的分配系數。它只與被分離的物質分子的大小和凝膠顆粒孔隙的大小分布有關，而與柱的長度粗細無關，也就是說它對每一物質為常數，與柱的物理條件無關。Kd可通過實驗求得，上式可以改寫為:Kd=(Ve-Vo)/Vi。上式中Ve為實際測得的洗脫體積；Vo可用不被凝膠滯留的大分子物質的溶液（最好是有顏色以便于觀察，如血紅蛋白，印度黑墨水，分子量約200萬的藍色葡

4、聚糖-2000等）通過實際測量求得；Vi可由gWr求得（g為干膠重量，單位為克；Wr為凝膠的“吸水量”，以毫升每克表示）。因此，對一層析柱膠床來說，只要通過實際實驗得知某一物質的洗脫體積就可算出它的Kd值。如果假定蛋白質分子近于球形，同時沒有顯著的水合作用，則不同大小分子量的蛋白質，在洗脫時峰的位置和該物質相對分子質量有直接的定量的關系。在一根凝膠柱中，凝膠顆粒間空隙所含水相體積為外水體積Vo，不能進入凝膠孔徑的那些大分子，當洗脫體積為Vo時，出現洗脫峰。凝膠顆粒內部孔穴的總體積為內水體積Vi，能全部滲入凝膠的那些小分子，當洗脫體積為Vo+Vi時，出現洗脫峰。Ve與分子量的關系：對同一類型的化

5、合物，洗脫特性與組分的分子量有關，流過凝膠柱時，按分子量大小順序流出，分子量大的走在前面。Ve與分子量的關系可用下式表示：Ve=K1-K2logM，式中M為相對分子質量，K1和K2為常數,Ve也可用Ve-Vo。二、儀器和試劑1.標準蛋白質:藍色葡聚糖-2000（200KD）、牛血清蛋白（67KD）、胃蛋白酶(36KD)、CytC(13.7KD)等，均為分析純。2.儀器:層析柱核酸蛋白檢測器（或紫外分光光度計）、自動部分收集器、刻度管。3.試劑:藍色葡聚糖2000、SephardexG-75、洗脫液：0.2mol/LTris-HCL-KCL,PH7.5。三、實驗步驟測定蛋白質的分子量根據需要可選

6、用SephadexG-75、G-100或G-150型凝膠，凝膠顆粒一般在40120微米，柱管選用直徑1.0-1.3cm，高90-100cm。1.標準曲線的制定：層析柱用1.2100cm，凝膠用SephadexG-75或G-100。（1）蛋白質標準樣品混合液：分別稱取4mg藍色葡聚糖-2000（200KD）、牛血清蛋白（67KD）、胃蛋白酶(36KD)、CytC(13.7KD)共同溶于2ml PH7.5 0.025mol/L Tris-Hcl緩沖液中。（2）上柱和洗脫：將標準樣品混合液上柱，然后用PH7.5 0.025mol/L Tris-Hcl緩沖液洗脫，流速15d/min，2ml/管，用部分

7、收集器收集，紫外檢測儀280nm出檢測，或收集后用紫外分光光度儀于280nm出測定每管OD值，以管號（或洗脫體積）為橫坐標，0D值為縱坐標繪出洗脫曲線。根據洗脫峰位置量出每種蛋白質的洗脫體積（Ve）。然后以蛋白質分子量的對數（lgM）為橫坐標，Ve為縱坐標，作出標準曲線。為了結果可靠，應以同樣條件重復1-2次，取Ve平均值作圖。2.未知數品分子量的測定：完全按照標準曲線的條件操作，根據紫外線檢測的洗脫峰位置，得出體積。重復1-2次，取其平均值，由標準曲線可查得樣品的分子量。四、實驗結果牛血清蛋白 藍色葡聚糖-2000Ve（ml）OD值Ve（ml）OD值00.04100.03920.04120.

8、00640.1640.0056060.00180.0180100.025100.015120.223120.341140.115140.15160.039160.07180.12180.048200200.04胃蛋白酶 CytcVe（ml）OD值Ve（ml）OD值00.0270020.02920.00740.02440.02160.02660.01980.02680.018100.031100.076120.039120.185140.131140.252160.304160.215180.315180.118200.676200.077220.105220.057240.042240.047

9、260.02260.034280.07280.025300.05300.013320320.01340.008作出洗脫曲線：牛血清白蛋白藍色葡聚糖-2000胃蛋白酶Cytc繪出標準曲線如下：五、討論1.從洗脫曲線上可以看出，出現了四個較明顯的峰值（實驗結果較為理想）：OD:0.233(Ve=12ml)，0.341（Ve=12ml），0.676（Ve=20ml），0.252（Ve=14ml），分別對照試驗中所加樣的四種蛋白質。由于分子量大的先洗脫出來，小分子量的蛋白后洗脫出來，因此洗脫順序是藍色葡聚糖-2000（200KD），牛血清白蛋白（67KD），胃蛋白酶（36KD），Cytc（13.7KD）?？赡苡捎谙疵擉w積間差距較