1、第五章第五章 培養基及設備的滅菌培養基及設備的滅菌使生物反應的基質或產物，因雜菌的消耗使生物反應的基質或產物，因雜菌的消耗而損失，造成生產能力的下降。而損失，造成生產能力的下降。 雜菌也會產生代謝產物，這就使產物的提取雜菌也會產生代謝產物，這就使產物的提取更加困難，造成得率降低，產品質量下降。更加困難，造成得率降低，產品質量下降。 有些雜菌會分解產物，使生產失敗。有些雜菌會分解產物，使生產失敗。 雜菌大量繁殖后，會改變反應液的雜菌大量繁殖后，會改變反應液的pH值，使值，使反應異常。反應異常。 如發生噬菌體污染，生產菌細胞將被裂解，使如發生噬菌體污染，生產菌細胞將被裂解，使生產失敗。生產失敗。

2、染菌造成的不良后果染菌造成的不良后果第一節第一節 培養基滅菌的目的、要求和方法培養基滅菌的目的、要求和方法 一、定義一、定義1. 培養基滅菌的定義 指從培養基中殺滅有生活能力的細菌營養體及其孢子，或從中將其除去。工業規模的液體培養基滅菌，殺滅雜菌比除去雜菌更為常用。2. 滅菌與消毒的區別滅菌：用物理或化學方法殺死或除去環境中所有微生物，包括營養細胞、細菌芽孢和孢子。消毒：用物理或化學方法殺死物料、容器、器皿內外的病源微生物。二、培養基滅菌的目的二、培養基滅菌的目的 1. 在發酵過程中夾雜其它雜菌造成的后果 2. 工業上具體措施 包括：（1）使用的培養基和設備須經滅菌；（2）好氧培養中使用的空氣

3、應經除菌處理；（3）設備應嚴密，發酵罐維持正壓環境；（4）培養過程中加入的物料應經過滅菌；（5）使用無污染的純粹種子。3. 培養基滅菌的目的4. 培養基滅菌的要求（1）達到要求的無菌程度（10-3）（2）盡量減少營養成分的破壞5. 滅菌的方法（1）化學法 化學藥品滅菌法 （2）物理法 干熱滅菌法 濕熱滅菌法 射線滅菌法 6，濕熱滅菌的原理 當溫度超過生長的最高限度時，微生物細胞中的原生質膠體和酶發生不可逆的凝固變性，使微生物在很短時間內死亡。7. 濕熱滅菌中的相關定義 致死溫度致死溫度：殺死微生物的極限溫度。 致死時間致死時間：在致死溫度下，殺死全部微生物所需的時間。 微生物的熱阻微生物的熱阻

4、：是指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時間。 相對熱阻相對熱阻：指某一微生物在某條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間的比值。 各種微生物對濕熱的相對熱阻微生物相對熱阻營養細胞和酵母細菌芽孢霉菌孢子病毒和噬菌體1.03106210158. 濕熱滅菌的優點 蒸汽來源容易，操作費用低，本身無毒 蒸汽有強的穿透力，滅菌易于徹底 蒸汽有很大的潛熱 操作方便，易管理第二節第二節 濕熱滅菌的理論基礎濕熱滅菌的理論基礎 一、培養基濕熱滅菌需解決的工程問題一、培養基濕熱滅菌需解決的工程問題1. 將培養基中的雜菌總數N0 殺滅到可以接受的總數N（10-3/ml）， 需要多高的溫度

5、、多長的時間為合理。2. 滅菌溫度和時間的確定 取決于：（1）雜菌孢子的熱滅死動力學 （2）反應器的形式和操作方式（3）培養基中有效成分受熱破壞的可接受范圍二、微生物的熱死滅動力學方程二、微生物的熱死滅動力學方程 微生物營養細胞的均相熱死滅動力學符合化學反應的一級反應動力學，即： N：任一時刻的活細菌濃度（個/L） t：時間（min） 1NkdtdN K：比熱死速率常數（死亡速率）（min-1） 取邊界條件t0=0，N=N0，對（1）積分得上式稱為對數殘留定律上式稱為對數殘留定律 2ln0tKNN 30KteNN死亡速率k，又稱為滅菌速度常數K越大，表明微生物越容易死亡。一定溫度下，比死亡速率

6、k隨微生物的種類不同而不同；同一種微生物其營養體細胞與芽孢的k也不同。對熱抵抗能力較弱：細菌營養體、酵母菌、放線菌、病毒及phage。對熱抵抗能力較強：細菌芽孢和霉菌的孢子。三、溫度對三、溫度對K K的影響的影響 比熱死滅速率常數K與滅菌溫度T的關系可用阿累尼烏斯方程表征 A：頻率因子（min-1） E：活化能（J/mol） R：通用氣體常數J/（mol.k） 4/ RTEeAK 從方程（4）可以看出：（1）活化能E的大小對K值有重大影響（2）不同菌的孢子的熱死滅反應E可能各不相同對方程（4）兩邊取對數，得 5lnlnAKRTE 對方程（5）兩邊對T取導數，得 由方程（6）可得出結論：反應的E

7、越高，lnK對T的變化率越大，即T的變化對K的影響越大。 62lnTREdTKd受熱物質E（J/mol）維生素B12維生素B1鹽酸鹽嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子肉毒梭菌孢子枯草桿菌孢子9623292048283257343088317984例：嗜熱脂肪芽孢桿菌 嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子死滅程度為N/N0=10-16時，滅菌溫度對維生素B1破壞的影響滅菌溫度（C）達到滅菌程度的時間（min）維生素B1的損失（%）100110120130140150843757.60.8510.1070.01599.9989271031理論滅軍時間的估算理論滅軍時間的估算培養基在滅菌前，存在各種各樣的微生物，培養基在滅菌前，

8、存在各種各樣的微生物，k值值不同計算時，可以取對熱抵抗力較大的芽孢桿不同計算時，可以取對熱抵抗力較大的芽孢桿菌的菌的k值。值。此時，此時，A取取1.341036s-1， E E取取2.8442.84410-5J/mol。即：即：36.127+T14845-=lgk例：某發酵罐裝培養基例：某發酵罐裝培養基40m3，在，在121下進行分下進行分批滅菌。設每毫升培養基中含耐熱的芽孢為批滅菌。設每毫升培養基中含耐熱的芽孢為107個，求理論滅菌時間。個，求理論滅菌時間。解：解：N0=10106107=41014個個 Ns=0.001個個 算得：算得：K=0.0281s-11.55-=36.127+121

9、+27314845-=36.127+T14845-=lgk24min=1442.6=0.001104ln0.02811=NNlnk1=4s0第三節第三節 培養基滅菌的工程設計培養基滅菌的工程設計一、無菌的標準一、無菌的標準 根據微生物熱死滅方程，要求滅菌后達到絕對無菌。 在工程設計中常取N=10-3二、分批滅菌二、分批滅菌1. 分批滅菌的設計 在發酵罐中進行實罐滅菌，是典型的分批滅菌。 全過程包括升溫、保溫、降溫三個過程。孢子熱死亡的規律符合 7NkdtdN積分，得 在分批滅菌過程中 8ln0tKNN 9lnlnlnlnln221022100NNNNNNNNNNNNNN升溫、冷卻階段T是時間t

10、的函數，K不是常數，所以： 式中Kh是保溫階段的孢子比熱死亡速度常數 10ln100/tRTENNdteA 11ln1221ttKhNN 12ln322/dteAttRTENN分批滅菌中幾種換熱方式的溫度-時間變化關系2. 保證間歇滅菌成功的要素（1）內部結構合理(主要是無死角)，焊縫及軸封裝置可靠，蛇管無穿孔現象（2）壓力穩定的蒸汽（3）合理的操作方法 發酵罐的接管圖4. 培養基間歇滅菌過程中應注意的問題（1）溫度和壓力的關系（2）泡沫問題（3）投料過程中，麩皮和豆餅粉等固形物在罐壁上殘留的問題（4）滅菌結束后應立即引入無菌空氣保壓三、連續滅菌的設計三、連續滅菌的設計1. 連續滅菌的流程（1

11、）噴射加熱連續滅菌噴射加熱連續滅菌流程典型的噴射加熱連續滅菌時的溫度和時間曲線圖（2）薄板換熱器連續滅菌 薄板換熱器連續滅菌流程薄板換熱器連續滅菌時的溫度和時間曲線圖（3）噴淋冷卻連續滅菌 噴淋冷卻連續滅菌流程3. 連續滅菌設備的結構及計算（1）設備結構：套管式連消塔噴嘴式連消塔連消器噴射加熱器薄板換熱器維持罐四、連續滅菌與間歇滅菌的比較四、連續滅菌與間歇滅菌的比較1. 連續滅菌的優缺點 優點： 保留較多的營養質量、容易放大、較易自動控制、糖受蒸汽的影響較少、縮短滅菌周期、在某些情況下，可使發酵罐的腐蝕減少、發酵罐利用率高、蒸汽負荷均勻 缺點： 設備比較復雜，投資較大 2. 分批滅菌的優缺點

12、優點： 設備投資較少、染菌的危險性較小、人工操作較方便、對培養基中固體物質含量較多時更為適宜 缺點： 滅菌過程中蒸汽用量變化大，造成鍋爐負荷波動大，一般只限于中小型發酵裝置 。五、影響滅菌的因素五、影響滅菌的因素1. 培養基成分對滅菌的影響 油脂，糖類及一定濃度的蛋白質可增加微生物的耐熱性，另一些物質，如高濃度的鹽類，色素等可削弱其耐熱性。2. pH值的影響pH值對微生物的耐熱性影響很大，pH為6.08.0時微生物最不易死亡， pH 6.0時氫離子易滲入微生物的細胞內。3. 培養基的物理狀態對滅菌的影響4. 培養基中微生物數量對滅菌的影響5. 培養基中氫離子濃度對滅菌的影響 培養基中氫離子濃度

13、直接影響滅菌的效果。培養基的 酸堿度越大，所需殺滅微生物的溫度越低。6. 微生物細胞中水分對滅菌的影響細胞含水越多，蛋白質變性的溫度越底7. 微生物細胞菌齡對滅菌的影響老細胞水分含量低、低齡細胞水分含量高8. 空氣排除情況對滅菌的影響9. 攪拌對滅菌的影響10. 泡沫對滅菌的影響六、六、常見培養基與設備、管道滅菌條件常見培養基與設備、管道滅菌條件1. 殺菌鍋內滅菌固體培養基滅菌：壓力0.098MPa，維持2030min；液體培養基滅菌：壓力0.098MPa，維持1520min；玻璃器皿及用具滅菌：壓力0.098MPa，維持3060min。2. 種子罐、發酵罐、計量罐、補料罐等的空罐及管道滅菌從

14、有關管道通入蒸汽，使罐內蒸汽壓力達0.147MPa，維持45min。3. 空氣總過濾器和分過濾器滅菌 維持壓力0.147MPa，滅菌2h4. 種子培養基實罐滅菌從夾層通入蒸汽間接加熱至80 ，關閉夾層蒸汽的進口閥門、升溫121 ，30min谷氨酸發酵的種子培養基實罐滅菌為110 ，維持10min5.發酵培養基實罐滅菌121 ，30min，谷氨酸實消105 ，維持5min6. 發酵培養基連續滅菌 一般培養基130 ，維持5min 谷氨酸發酵培養基為115 ，68min7. 消泡劑滅菌 直接加熱至121 ，30min8. 補料罐滅菌 根據料液不同而異，淀粉質原料121 維持5min9. 尿素溶液滅

15、菌 105 ，5min七、發酵罐的滅菌七、發酵罐的滅菌 培養基的滅菌如果是采用連續滅菌法，則發酵罐應在加入滅菌的培養基前先行單獨滅菌。通常是用蒸汽加熱發酵罐的夾套或設管并從空氣分布管中通入蒸汽，充滿整個容器后，再從排氣管中緩緩排出。容器內的蒸汽壓力保持1kg，20min。在保溫結束后，關鍵是隨即通入無菌空氣，使容器保持正壓，防止形成真空而吸入帶菌的空氣。注意事項：注意事項：l 先將罐內空氣排盡，滅菌時要保持蒸氣暢通，使有關閥門、管道徹底滅菌；l 嚴格檢查有關罐體、管道、法蘭、軸封、閥門等有無滲漏、穿孔、堵塞、死角以及有無閥門忘開、忘關、開關次序搞錯，泡沫冒頂和逃液等不正常現象；l 在配料時應開攪拌器，盡量將各種粉餅等團塊打碎，攪拌均勻，防止結塊或大顆粒對其內部微生物的保護；l 淀粉配比超過4%時必須水解，否則影響滅菌效果；l 滅菌時，罐蓋面上的玻璃視鏡必須用橡皮墊蓋好，以防沾著冷水引起炸裂。八、附屬設備滅菌發酵罐的附屬設備：分空氣過濾器，補料系統、消沫劑系統等。（1）分空氣過濾器在發酵罐滅菌之前進行滅菌，滅菌后用空氣吹干備用。（2）補料罐的滅菌溫度視物料性質而定，如糖水，滅菌時蒸氣壓力為0.1Mpa（120），保溫30min。（3）油罐（消沫劑罐）滅菌