1、弓 形 蟲 環 介導 等 溫 擴 增快 速檢 測 方 法的 建 立李月梅 , 薛書江 , 其木格 , 邢 瑩 , 張守發 3(延邊大學農學院動物醫學系 , 吉林 龍井 133400摘要 :為了建立弓形蟲的快速檢測方法 , 本研究建立了一種靈敏、 特異 、 快速的分子生物學檢測方法 環介導等溫擴增技術 (LAMP 。用 10倍系列稀釋的 DNA 樣品對該檢測方法的靈敏度進行了測試 , 同時通過對擴增產物做內切酶驗證 ; 為證明 LAMP 技術的特異性 , 對新孢子蟲、附 紅細胞體、 瑟氏泰勒蟲等病原體進行檢測。 結果顯示 :利用 LAMP 技術成功檢測到弓形蟲基因區 , 此方法的靈敏度可達到能檢

2、測 5個拷貝 DNA 分子水平 , 酶切分析結果正確 , 并且特異性強 , 對新孢子蟲 、 附紅細胞體、 瑟氏泰勒蟲等病原體檢測均為陰性。 說明 LAMP 技術可應用于弓形蟲 的快速檢測 。關鍵詞 :弓形蟲 ; 環介導等溫擴增技術中圖分類號 :S85217 文獻標識碼 :A 文章編號 :05292 0030D evelop m en ed l am pli f i ca ti on a ss ay fora gondiiL I Yue 2mei, XUE Shu 2jiang, Q IMu 2ge, X I N G Ying, ZHANG Shou 2fa 3(Veterinary Depar

3、t m ent of Agricultural College, Yanbian University, Longjing 133400, China Abstract:I n order t o devel op a rap id and si m p le method f or Toxoplas m a gondii infecti on, a novel l oop 2mediated is other mal amp lificati on (LAMP assay f or T 1gondii was established . Ten serial diluti ons of DN

4、A sa mp le was used t o evaluate the sensitivity of assay, and the accu 2 racy was de monstrated by incisi on enzy me . The pathogens, N eospora, Eperythrozoon and Sergenti, were detected in order t o evaluate the s pe 2 cificity . The result showed that T 1gondii gene could be detected by LAM P, an

5、d the detecti on li m it was 5cop ies . The result of incisi on en 2 zy me was correct . The s pecificity of LAMP assay was good and no amp lificati on p r oduct was found in the sa mp les of N eospora, Eperythrozoon and Sergenti . It suggested LAMP assay was feasible for detecti on of T 1gondii .Ke

6、y words:Toxoplas m a gondii ; l oop 2mediated is other mal a mp lificati on (LAMP 弓形蟲 (Toxoplas m a gondii 是一種嚴重危害人 類及家畜的機會性致病原蟲 , 呈世界性分布 , 可侵犯 除成熟紅細胞以外的任何有核細胞 , 引起多種組織 、 器官病變和損害 1。對于一般人群 , 弓形蟲可引起 慢性隱性感染 2; 對于特殊人群 , 如艾滋病患者 、 妊娠期婦女 、 器官移植者等可引起嚴重的后果 , 甚至 死亡 3。 弓形蟲在畜禽中傳播 、流行 , 導致家畜大 批死亡 , 給 畜牧 業造成 重大 的

7、經 濟 損 失 4。我 國 中華人民共和國動物防疫法 將其列為多種動物共 患病二類疫病 。環介導等溫擴增 (l oop 2mediated is other mal a mp li 2 ficati on, LAMP 反應在等溫條件下進行 , 沒有核酸 收稿日期 :2009205223作者簡介 :李月梅 (19842 , 女 , 碩士研究生。3通訊作者 。 變復性過 程 , 不 但節省 了大 量的時 間 , 又 減少 了 RNA 酶和擴增核酸污染的機會 。更重要的是 , 擴增 反應只有在 4條引物完全與識別的靶序列 6個結合區 匹配的情況下才能順利進行 , 所有這些特性都在很大 程度上減少了擴

8、增反應的背景 , 從而使檢測特異性得 到改善 。1 材料和方法111 材料 B st DNA 聚合酶購自 NE B 公司 ; SY BR Green 購自上海百維信公司 ; 限制性內切酶 B an 為 TaKa 2 Ra 公司產品 ; 弓形蟲 GRA3基因序列的質粒 pGEX 2 GRA3、 菌株 BL 221、新孢子蟲 、附紅細胞體 、瑟氏 泰勒蟲病原體由本校預防獸醫學實驗室保存 。3 Ani m al Husbandry &VeterinaryMedicine 2009 Vol 141 No 111112 引物的設計與合成根據 Gen Bank AF414079中 已 發 表 的

9、弓 形 蟲 GRA3致密顆粒蛋白基因序列 , 利用 DNAStar 610進 行引物設計 。 引物包括 F3、 B3、 F I P 、 B I P 4條引物 , 分別識別 6個基因位點 。113 弓形蟲 LAMP 檢測方法的建立11311 LAMP 反應體系的建立 弓形蟲 LAMP 的反應體系為 25L, 各組份的終 濃 度 為 :F3/B3各 012mol/L、 F I P /BI P 各 116mol/L、 d NTP 114mmol/L(each 、 Tris 2HCl 20 mmol/L、 (NH 4 2S O 410mmol/L、 KCl 10mmol/L、 MgS O 46mmol

10、/L、 Trit on X 2100011%、 B st DNA 聚合 酶 8U 、 模板 2L 。將水浴鍋溫度調至 63 后 , 將 含 LAMP 反應液的 PCR 反應管置于水浴鍋內等溫擴 增 3060m in, 結束后 80 加熱 2m in 。11312 弓形蟲 LAMP 檢測反應結束后 ,于 115%LAMP 擴 增產 物 中 加 入 1的 SY BR Green 染 料 , 觀 察 LAMP 反應液是否發生顏色變化 , 再將 PCR 反應管 置于紫外燈下照射 , 觀察是否有強烈的熒光產生 。 114 LAMP 擴增產物的酶切鑒定對 LAMP 擴增產物用限制性內切酶 B an 進行

11、消化 , 水浴消化 4h, 115%瓊脂糖凝膠電泳 , 觀察結 果 。115 LAMP 的敏感性試驗將得到的模板進行 10倍系列稀釋成 5到 5×105 5個稀釋度 。 用所建立的 LAMP 檢測方法和 PCR 檢測 方法進行敏感性比對試驗 。116 LAMP 的特異性試驗抽提新孢子蟲 、 附紅細胞體 、 瑟氏泰勒蟲基因組 DNA , 按照所建立的弓形蟲 LAMP 檢測方法 , 進行特 異性試驗 。2 結果211 LAMP 擴增產物的檢測對 弓 形 蟲 重 組 質 粒 pGEX 2GRA3樣 品 進 行 了 LAMP 檢測 , 電泳結果顯示條帶呈階梯狀分布 , 與理 論結果相符 (圖

12、 1 。在加入弓形蟲重組質粒 pGEX 2 GRA3樣品反應管中加入染料后置紫外燈下照射 , 發 出強烈的綠色熒光 (圖 2 。212 LAMP 擴增產物的酶切鑒定用 B an 對 LAMP 產物進行限制性內切酶切分 析 , 酶切產物與 115%濃度的瓊脂糖凝膠中電泳 。結 果顯示 , 經 B an 酶切 , 得到了 90bp 和 150bp 的 2條特異性條帶 , 與預期的大小相符 (圖 3 。 213 LAMP 的敏感性試驗將得到的模板 10倍系列稀釋成 5到 5×105共 1 3畜牧與獸醫 2009年 第 41卷 第 11期5個稀釋度 。 結果顯示 5拷貝以上的稀釋度均顯示了典

13、型的 LAMP 擴增帶型 , 且信號依次遞增 。 說明該檢 測方法的靈敏度理論上可達到大約 5個拷貝的水平 (圖 4 。1. 5個拷貝 2. 51; 3. 5×3DNA LAMP 擴增產物 ; 4. 5×104個拷貝 DNA LAMP 擴增產物 ; 5. 5×106個拷貝 DNA LAMP 擴增產物 ; M. 100bp DNA 標準分子量圖 4 LA M P 敏感性試驗結果214 LAMP 特異性試驗所建立的弓形蟲 LAMP 檢測方法可以檢測出弓形 蟲的核酸 。 但將等溫擴增時間延長至 2h, 仍不能檢 測出新孢子蟲 、 附紅細胞體 、 瑟氏泰勒蟲的核酸 。3

14、討論環介導等溫擴增技術依賴于能夠識別靶序列上 6個特異區域的引物和一種具解旋功能且呈瀑布式擴增 的 B st DNA 聚合酶 , 在等溫條件下可高效 、 快速 、 特 異地擴增靶序列5。 LAMP 是呈瀑布式擴增 , 擴增效率高 ; 由于 LAMP 識別的是核酸上的 68個特異性 的位點 , 所以其特異性強 ; LAMP 只在 6065 進 行恒溫擴增 , 只要水浴鍋即可 , 也不需要特殊的儀器 , 因此非常簡便 ; 而且由于 LAMP 是恒溫擴增 , 不 需要反轉錄步驟 , 不需要 PCR 儀升降溫的時間 , 所 以擴增時間短 。 為了提高檢測準確性和檢測效率 , 縮 短檢測周期 , 本研究

15、建立了檢測弓形蟲的 LAMP 檢測 方法 , 結果顯示該方法是一種新型 、 快速 、 實用 、 靈 敏的檢測技術 。目前大多數弓形蟲病原體的基因檢測中都選用保 守區基因 , 本試驗選擇了 GRA3基因 , 該基因是在基 因保守區內選擇的 , 這樣就提高了擴增的特異性 。 對于梯度稀釋的模板檢測結果顯示 , 該 LAMP 方法的靈 敏度比普通 PCR 方法高 , 能夠檢測到 5拷貝的模板 ; 特異性和重復性試驗結果表明 , 該方法是可靠的 , 對 于其他的病原體都沒有出現非特異 性擴 增 。由 于 LAMP 具有快速 、靈敏 、特異 、簡便的特點 , 因此 , 非常適合基層部門和養殖場使用 ,

16、尤 其適 合現 場 檢測 。LAMP 技術與 PCR 相比具有以下優點 6-8: 反 應條件簡單 , 在一恒溫水箱中即可完成 ; 優化步驟 非常簡單 , 由于 LAMP 反應體系中起決定作用的是引物濃度 、 dNTP 濃度和 Mg 2+濃度 , 所以只要將這 3個 因素的濃度調至最佳 , 即可實現對 LAMP 的優化 ; 快速高效 , LAMP 在 1h 10910; 6個特異序, ; 結 , , 從 dNTP 析出的焦磷Mg 2+結合 , 產生大量的副 產物焦磷酸鎂沉淀 , 肉眼即可直接觀察結果 。 總之 , LAMP 是一種便捷 、特異而又靈敏的快速 基因檢測技術 , 如果進一步優化 、

17、完善和推廣 , 該技 術將會在遺傳和傳染病的早期診斷及預防控制方面發 揮重要作用 。參考文獻 :1 LUfr B J. Toxoplas m a vencephalitis in MDS J .Clin I nf D is,1992, 15(2 :2112222.2 斯特勞 , 阿萊爾 , 蒙加林 , 等 . 豬病學 M.趙德明 , 張中秋 , 沈建 中 , 等 譯 . 北 京 :中 國 農 業 大 學 出 版 社 , 2000:6812685.3 Bout D T, Mevelec M N, Velge Roussel F, et al . Pr os pects for ahuman To

18、xoplas m a vaccine J .CurrD rug Targets I m mune Endocr Metabol D is ord, 2002, 2(3 :2272234.4 Hol m gren J, Czerkinsky C . Mucosal i m munity and vaccines J .NatMed, 2005, 11(4 :45253.5 Not om i T, Okaya ma H, Masubuchi H, et al . Loop 2mediated is other 2mal a mp lificati on of DNA J .Nucleic Acids Research, 2000, 28(12 :63.6 Naga m ine K, W atanage K, Ohtsuka K .et al