1、附件 1食品中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測定BJS 2017051 范圍本方法規定了食品中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的高效液相色譜- 串聯質譜的測定方法。本方法適用于液體乳、稀奶油、嬰幼兒配方乳粉（不包括特殊醫學用途的嬰幼兒配方乳粉）、嬰幼兒谷類輔助食品、谷物碾磨加工品、植物油脂等食品中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測定。2原理樣品經乙腈提取后，再以正己烷除脂凈化，高效液相色譜- 串聯質譜儀進行檢測，外標法定量。3 試劑和材料除另有規定外，所有試劑均為分析純，水為GB/T6682 規定的一級水。3.1試劑甲醇（ CH4O）：色譜純。乙腈（ C2H3N）：色譜純。甲酸（ CH2O2）

2、：色譜純。正己烷（ C6H14）：色譜純。氯化鈉（ NaCl）：在 550灼燒 4h后備用。%甲酸水溶液：量取10mL甲酸并加入水定容至1000mL。3.2標準品香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素標準品純度%，中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質量和結構式等信息詳見附錄A 表。3.3標準溶液配制標準儲備液（mL）：分別稱取香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素（精確至）標準物質于100mL容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度。避光于- 18下保存，保存期為 6個月。3.3.2混合標準儲備溶液：分別吸取上述三種標準儲備液于同一100mL容量瓶中，用乙腈稀釋到刻度配制成濃度為 10g/mL的混合

3、標準儲備溶液，避光于-18保存，保存期為 1個月。3.3.3空白基質溶液：按照規定的前處理方法操作制備空白基質溶液。3.3.4基質混合標準系列工作液： 分別準確吸取香蘭素、 甲基香蘭素和乙基香蘭素混合標準儲備液適量，用空白基質提取液 （）將其稀釋為 5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL 、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL標準系列工作溶液，臨用時配制。4 儀器和設備4.1液相色譜 - 串聯質譜儀：配有電噴霧離子源。4.2渦旋混合器。4.3超聲波清洗器。4.4離心機：轉速5000r/min 。4.5分析天平：感量和。5 試樣制備嬰幼兒谷類輔助食品、谷物碾磨加工品需粉碎混勻，

4、使其全部可以通過425m的標準網篩；其它樣品無需特殊制備。6 分析步驟6.1樣品的制備與提取嬰幼兒配方乳粉、嬰幼兒谷類輔助食品：稱取1g 樣品（精確至），置于 50mL聚丙烯離心管中，加入 3mL水，渦旋振蕩30s，加入 7mL乙腈（），渦旋振蕩30s ，超聲處理25min，10000r/min離心 5min 后，取上層清液2mL于 10mL玻璃離心管中， 加入 1mL正己烷（），渦旋混合 30s，5000r/min離心 3min 后，取下層清液，過濾膜（m，有機相），待分析。液體乳（巴氏殺菌乳、滅菌乳、發酵乳等）、稀奶油：稱取2g 樣品（精確至），置于 50mL聚丙烯離心管中， 加入 20m

5、L乙腈（），渦旋振蕩30s，超聲處理25min，加入 1g 氯化鈉（），10000r/min離心 5min 后，取上層清液2mL于 10mL玻璃離心管中， 加入 1mL正己烷（），渦旋混合 30s，5000r/min離心 3min 后，取下層清液，過濾膜（m，有機相），待分析。谷物碾磨加工品（大米等）：稱取 1g 樣品（精確至） ，置于 50mL聚丙烯離心管中，加入3mL水，渦旋振蕩30s ，加入 7mL乙腈（），渦旋振蕩30s ，超聲處理25min ，10000r/min離心 5min后，取上層清液過m濾膜（），待分析。植物油脂：稱取1g 樣品（精確至） ，置于腈（），渦旋振蕩30s ，超聲

6、處理25min，加入 1g50mL聚丙烯離心管中，加入氯化鈉（）， 10000r/min離心1mL水和 10mL乙5min 后，取上層清液 2mL于 10mL玻璃離心管中，加入1mL正己烷（），渦旋混合30s， 5000r/min離心3min后，取下層清液，過濾膜（m，有機相） ，待分析。6.2儀器參考條件色譜條件a) 色譜柱： XDBC18柱，× 50mm， m，或性能相當者。b) 流動相： A： %甲酸水溶液， B：甲醇，梯度洗脫條件見表 1。c) 流速： min。d) 柱溫： 30o C。e) 進樣量： 2 L。表 1 梯度洗脫條件時間（ min）A 相（ %）B 相（ %）0

7、7525752525050650507109091090127525質譜條件f) 離子源：電噴霧離子源。g) 掃描方式：正離子掃描 (ESI+) 。h) 檢測方式：多反應監測 (MRM)。i) 離子化電壓、霧化氣、輔助氣、氣簾氣壓力、霧化溫度應優化至最佳靈敏度，監測離子對和定量離子對及其他質譜參數見附錄B 中表。6.3測定標準曲線的制作用混合標準系列工作溶液分別按儀器參考條件（）進行測定，得到相應的標準溶液的色譜峰面積，以混合標準工作液的濃度為橫坐標，以色譜峰的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。定性測定在相同試驗條件下測定樣品和基質混合標準工作溶液，記錄樣品和標準工作溶液中目標物的保留時間。若樣品

8、中檢出與基質混合標準溶液（）中待測物保留時間一致的色譜峰，且其定性離子與濃度相當的標準溶液中相應的定性離子的相對豐度相比偏差不超過表2規定的范圍， 則可以確定樣品中檢出相應的待測物。表 2 定性確定時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度 /% 5020 5010 2010允許的相對偏差 /%±20±25±30±50定量測定將樣品溶液（）按儀器參考條件（）進行測定，得到相應的樣品溶液的色譜峰面積，根據標準曲線查得待測液中各組分的濃度。樣品中各待測組分的響應值應在標準曲線的線性響應范圍內，如果含量超出線性范圍，則重新取樣分析，用乙腈稀釋到適當濃度后測定。混

9、合標準工作溶液的高效液相色譜- 串聯質譜MRM色譜圖參見圖。7 結果計算按下式（ 1）計算樣品中單種目標化合物的含量：XcV1000 (1)m 1000式中：X樣品中待測組分的含量，單位為微克每千克（g/kg ）；c從標準曲線中讀出的測定液中各待測組分的濃度，單位為微克每升（g/L ）；m樣品稱取的質量，單位為克（g）；V樣品溶液定容體積，單位為毫升（mL）。計算結果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留至小數點后一位。8 檢測方法的靈敏度、準確度、精密度8.1靈敏度當液體乳稱樣量為2g，植物油脂、稀奶油、谷物碾磨加工品、嬰幼兒配方乳粉、嬰幼兒谷類輔助食品稱樣量1g時，

10、香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的檢出限為g/kg ，定量限為 g/kg 。8.2準確度本方法嬰幼兒配方乳粉、液體乳、植物油脂、稀奶油、谷物碾磨加工品、嬰幼兒谷類輔助食品在 g/kg 添加濃度范圍內回收率為%。8.3精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差不得超過算數平均值的10%。附錄 A香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素三種化合物相關信息表中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質量和結構式名稱英文名CAS分子式相對分子質量結構式HO香蘭素Vanillin121-33-5C8H8O3OHOH甲基香蘭OMethylvanillin120-14-9C9H10O3素OOH乙基香蘭O

11、Ethylvanillin121-32-4C9H10O3OH素OCH 3附錄 B參考質譜條件質譜參數：a) 離子源：電噴霧離子源；b) 掃描方式：正離子掃描 (ESI+) ；c) 檢測方式：多反應監測 (MRM)；d) 離子化電壓 (IS) ：5500V；e) 霧化氣 (Gas1):50psif) 輔助氣 (Gas2):50psig) 氣簾氣壓力 (CUR)： 35psi ；h) 霧化溫度 (TEM)： 500；i) 定性離子對、定量離子對及其他質譜參數見表。表 三種化合物的定性離子對、定量離子對和質譜分析參數離子對去簇電壓碰撞能量入口電壓出口電壓序號分析物m/zVeVVV香蘭素*901910

12、131901410132甲基香蘭素*100171013100251013*90171013乙基香蘭素390231013* ：定量離子注：附錄 B 所列參考質譜條件僅供參考，當采用不同質譜儀器時，儀器參數可能存在差異，測定前應將質譜參數優化到最佳。附錄 C香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的標準色譜圖5.985.98100100香蘭素定量離子對153.1/93.1%000246810120246香蘭素定性離子對153.1/125.0810126.90100 甲基香蘭素定量離子對167.2/139.1%0024687.41100乙基香蘭素定量離子對167.2/111.0%002468Time （min ）100甲基香蘭素定性離子對167.2/124.1%010120246Time (min)100乙基香蘭素定性離子對167.2/93.0%010120246Time (min)Time (min)