1、免疫細(xì)胞研究 westernblotwesternblotWesternBlotWesternBlot 常見(jiàn)問(wèn)題及處理總結(jié)阿木1 1、westernblotwesternblot 的優(yōu)點(diǎn)答：靈敏，可達(dá) ngng 級(jí)，用 EclEcl 顯色法理論上可達(dá) pgpg 級(jí)。方便，特異性高。2 2、為什么我的細(xì)胞提取液中沒(méi)有目標(biāo)蛋白？答：原因有很多：a a）你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；b b）你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了， 你必需加入 PMSF,PMSF,抑制蛋白酶活性；c c）你的抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白，多看看說(shuō)明，看是否有問(wèn)題。3 3、 我的細(xì)胞提取液有的有沉淀， 有的很清亮，為什么呢？答

2、： a a） 有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻](méi)有變性完全，可以適當(dāng)提高 SDSSDS 濃度，同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長(zhǎng)，b b）也不排除你的抗原濃度過(guò)高，這時(shí)再加入適量上樣緩沖液即可。4 4、我做的蛋白質(zhì)分子量很小（10KD10KD）, ,請(qǐng)問(wèn)怎么做 WB?WB?答：可以選擇 0.2m0.2m 的膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。5 5、我的目的帶很弱，怎么加強(qiáng)？答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時(shí)也可以將一抗稀釋比例降低。6 6、膠片背景很臟，有什么解決方法？答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛龋淖円豢狗跤龝r(shí)間，提高牛奶濃度7 7、目標(biāo)帶是空白，周圍有背景，是為什

3、么？答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上 HRPHRP 催化活力太強(qiáng)，同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn)，反應(yīng)時(shí)間不長(zhǎng)，將周圍底物催化完，形成了空白即反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档停蚋鼡Q新底物。、我的膠片是一片空白，是怎么回事?答：如果能夠排除下面的幾個(gè)問(wèn)題那么問(wèn)題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。a)a)二抗的 HRPHRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；b)ECMb)ECM 底物中 H2O2,H2O2,不穩(wěn)定，失活；c)ECLc)ECL 底物沒(méi)覆蓋到相應(yīng)位置；d)d)二抗失活。9 9、我在顯影液中顯影 1 1 分鐘和 5 5 分鐘后，底片漆黑一片，是什么原因呢？答：a a）可能是紅燈造成的，膠片本來(lái)就被曝光了

4、，可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善.；b b）顯影時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。1010、DABDAB 好還是 ECMECM 好？答：DABDAB 有毒，但是比較靈敏，是 HRPHRP 最敏感的底物；ECMECM 結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測(cè) pgpg 級(jí)抗原。要看你實(shí)驗(yàn)的情況。1111、抗原檢測(cè)出的分子量比資料上的大，是怎么回事？答：a a）抗原形成了二聚體。增多疏基乙醇量，煮沸變性時(shí)間延長(zhǎng)，可以打開(kāi)二聚體。b b）蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等1212、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時(shí)MarkerMarker 轉(zhuǎn)上去了，為什么？答：可能是：a a）樣品

5、濃度過(guò)低；b b）轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠，。1313、磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一定要加 NaFNaF 等？答：NaFNaF 是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。1414、要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無(wú)該蛋白的存在，需要做免疫組化和 westernblotwesternblot 試驗(yàn)嗎？做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎？答：免疫組化可以用來(lái)進(jìn)行定位，但是不能精確定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽(yáng)性，不易與背景區(qū)分；WesternblotWesternblot 可以特異性檢測(cè)某個(gè)蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定量，但是不能定位。兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說(shuō)明一般都會(huì)說(shuō)明可以進(jìn)行

6、什么實(shí)驗(yàn)，在免疫組化時(shí)，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。1515、做 WesternBlotWesternBlot 時(shí)，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開(kāi)始還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來(lái)越差，上樣量已加到 120120RgRg 換了個(gè) santaclozsantacloz 的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加 PMSFPMSF 行嗎？答：懷疑是樣品問(wèn)題，可能是：1,1,樣品不能反復(fù)凍融；2,2,樣品未加蛋白酶抑制劑。同時(shí)，建議檢查 WesternBlotWesternBlot 過(guò)程，提高一抗?jié)舛取?duì)于加蛋白酶抑制劑來(lái)說(shuō)，一般加 PMSFPMSF 就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶

7、抑制劑。1616、 細(xì)胞水平要做 westernblotwesternblot, ,多少細(xì)胞提的蛋白夠做 westernblotwesternblot? ?答：一般 5X10A5X10A 醐足夠了1717、同一樣品能同時(shí)提 RNARNA 又提蛋白么?這樣對(duì) westernblotwesternblot 有無(wú)影響？答：能，沒(méi)有問(wèn)題WesternBlotWesternBlot 檢測(cè)嗎?答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。1919、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時(shí)最好加上 NaFNaF

8、 去抑制磷酸化酶的活性。2020、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到 1 1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？答：你可以加大上樣量，沒(méi)有問(wèn)題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長(zhǎng)時(shí)間，加20%20%甲醇。2121、 想分離的蛋白是分子量 200k200kd d 的， SDS-PASDS-PAG G鹿泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作 WesternBlotWesternBlot 嗎？答：200kd200kd 的蛋白不好做，分離膠用 7%,7%,積層膠 3.5%3

9、.5%。2222、如果上樣量超載，要用什么方法來(lái)增加上樣量？答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載 30%30%是不會(huì)有問(wèn)題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試 1.5mm1.5mm 的 c c2323、蛋白變性后可以存放多久?條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉（也是被酶水解了）2424、 我所測(cè)定的蛋白分子量是 105KD,105KD,按理說(shuō)分離膠應(yīng)當(dāng)采用 7.5%,7.5%,但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用 11%11%的配方，不知為何？答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因答:0C,0C,一兩年沒(méi)有問(wèn)題。最

10、關(guān)鍵兩為 105KD105KD 的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。2525、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整， 能否再用 5%5%的脫脂奶粉呢？好像有資料說(shuō)脫脂奶粉會(huì)影響親和素生物素的生成，是嗎？解答：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻锼兀?BSABSA 代替應(yīng)該好一點(diǎn).2626、問(wèn)一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？答：WesternBlotWesternBlot 一般上樣 30-10030-100 微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。

11、開(kāi)始摸條件時(shí)，為了拿到陽(yáng)性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來(lái)了。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不適合WesternBlotWesternBlot 的怎樣做也不行。2727、做組織樣品的 westernwestern 的時(shí)候，怎樣處理樣品？答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提（超速離心）。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入 PMSFPMSF）。要注意什么呢?答：做 200kd200kd 蛋白的 WesternB

12、lotWesternBlot 時(shí)要注意，分離膠最好選擇7%7%的；剝膠時(shí)要小心；轉(zhuǎn)移2828、問(wèn)大分子量蛋白200KD,200KD,在做 westernwestern時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng)；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。2929、有什么方法可以提高上樣量？答：a a）可以濃縮樣品；增大上樣體積來(lái)增大上樣量；b b）用 5 5 倍的上樣緩沖液來(lái)稀釋變性3030、蛋白的上樣量有沒(méi)有什么具體的要求？答：上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來(lái)定，如果要求是定量和半定量的 WesternBlotWesternBlot則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒(méi)有太大的關(guān)系，盡量多上就行了，但是不要超載.3131、一

13、抗，二抗的比例是否重要？答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。3232、要做磷酸化某因子 WesternBlot,WesternBlot,其二抗有何要求？答：對(duì)二抗無(wú)要求，要看你實(shí)驗(yàn)條件來(lái)選擇，一般推薦用 HRPHRP 標(biāo)記的二抗。3333、免疫組化和 WesternBlotWesternBlot 可以用同一種抗體嗎？答：免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，

14、也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和WesternWestern, ,而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。3434、WesternBlotWesternBlot 中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？答：抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用 2 23 3 次。稀釋后應(yīng)在 2 23 3 天內(nèi)使用，4 4 度保存，避免反復(fù)凍融。3535、在做 WesternBlotWesternBlot 時(shí)，PVDFPVDF 膜用甲醇浸泡的目的？答：PVDFPVDF 膜用甲醇泡的目的是為了活化 PVDPVDF F膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白

15、轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。3636、檢測(cè)同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？答：可以。3737、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉(zhuǎn)膜好象不是很好,為什么？答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢,你延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流，大分子一端就會(huì)好的多，但是小分子的就有可能會(huì)變淡。3838、做 WesternBlotWesternBlot 時(shí)，同樣的抗體免疫組化能做出，而 WesternBlotWesternBlot 卻不能?答：這多半是抗體的問(wèn)題，要看抗體的說(shuō)明，是否能做 WesternBlotWesternBlot 和免疫組化,3939、 如果是6X8$6X8$專印膜，要

16、加多少一抗?答：一抗的稀釋度是有說(shuō)明的，根據(jù)你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般最少為 3 35ml5ml。4040、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到最佳效果。答：無(wú)特殊要求。但我們一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過(guò)一兩次的緩沖液4141、跑電泳的時(shí)候配的膠總是縮”是什么原因呢？是有的成分不對(duì)嗎？答：沒(méi)什么問(wèn)題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過(guò)夜時(shí)拿保鮮膜包起來(lái)，在里面加點(diǎn)水保持濕度就可以了；也可能母液（30%30%聚丙酰胺）有問(wèn)題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。4242、 蛋白質(zhì)的分子量跨度很大， 如要分離小21KD,21KD,中至

17、66KD,66KD,大至 170KD,170KD,可以一次做好嗎？答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd21kd 和 66kd66kd 可以一起轉(zhuǎn)，12%SDS-PAGE12%SDS-PAGE濕轉(zhuǎn) 120mA,45-60min120mA,45-60min 就可以了， 可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)；170kd170kd 用7%SDS-PAGE200mA90-120min7%SDS-PAGE200mA90-120min。4343、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入 20%20%甲醇（是指終濃度），因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)

18、和 NCNC 膜的結(jié)合能力， 甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度 0.1%SDS0.1%SDS 也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的 NCNC 膜（0.20.2 微米）. .4444、我用的是可視 marker,marker,但是電泳總跑不全條帶，請(qǐng)問(wèn)什么原因？怎樣改善?膠用過(guò)%,10%,12%,%,10%,12%,都是這樣。markermarker是新買的答：一般來(lái)說(shuō)，是小分子量 MarkerMarker 跑走了，增加膠濃度或減少電泳時(shí)間試試看。當(dāng)然梯度膠也是不錯(cuò)的選擇。4545、是否 WesternBlotWesternBlot

19、實(shí)驗(yàn)半定量一定要力口 ACTINACTIN 內(nèi)參？答：對(duì)于發(fā)表文章的實(shí)驗(yàn)最好加內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)。4646、核內(nèi)抗原 WesternBlotWesternBlot 內(nèi)參選擇什么合適？答：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。4747、做半定量 WesternBlot,WesternBlot,內(nèi)參伊actin,GAPDHactin,GAPDH 哪個(gè)好？答：選用 beta-actinbeta-actin 就可以。4848、想問(wèn)一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎？受不受組織來(lái)源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？答：一般來(lái)說(shuō)提取時(shí)加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時(shí)保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明用特殊的方法，一般來(lái)說(shuō)都沒(méi)有區(qū)別。4949、轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是 5%5%的TBSTTBST 脫脂奶粉”，其中 TBSTTBST 最后那個(gè) T T 是TweenTween 嗎，濃度多大？答：是 Tween,Tween,配方如下：Tris-BufferedTris-BufferedSalineTween-20(TBST),NaClSalineTween-20(TBST),NaClg g， TrisTrisbase:2.4