1、苦參中黃酮類化合物的超臨界提取及定性研究(一)    作者：張瑞菊張國英孫海波凌建亞王革【摘要】 目的超臨界提取苦參中黃酮類化合物，并對提取物進行初步的定性分析。方法通過正交實驗探索超臨界提取苦參中黃酮類化合物的最佳工藝條件，在此基礎上對苦參中黃酮類化合物進行分離提取，并進行定性研究。結果苦參黃酮類化合物提取工藝的最佳參數組合為:溫度40，壓力30 MPa，乙醇流速0.4 ml/min，時間60 min，最高得率為5.82%。結論苦參中總黃酮超臨界提取最佳工藝數據可靠，具有良好的重復性，定性研究方法簡便易行。為進一步開發研究苦參總黃酮提供理論、實踐依據。

2、 【關鍵詞】 苦參；黃酮類化合物；超臨界提取Abstract:ObjectiveTo study the best extraction condition of flavonoids in Sophora flavescens supercritical fluid extraction（SFE），and to determine the quality of these flavones.MethodsOrthogonal design was conducted to investigate the extraction conditions of flavonoids in Radix

3、 sophorae. On this basis, flavonoids in the Radix Sophorae were separated and their qualities were researched.ResultsThe best extraction conditions were : extraction temperature 40；extraction pressure 30 MPa, Ethanol velocity 0.4 ml/min,and extraction time 60min. According to the conditions, the ext

4、raction efficiency of the flavoniods might reach 5.82%.ConclusionThe optimal craftwork of the SFE is acquired, and this way is suitable for flavone extraction in lab because of its simple craftwork，good repeatition and low consumption. The study provides theoretical and practical basis for the devel

5、opment of Radix Sophorae flavonoids.Key words: Sophora flavescens； Flavonoids; Supercritical fluid extraction苦參別名野槐根、山槐根、干人參、苦骨，生于向陽山坡灌叢、草地中，全國均產。中藥苦參為豆科槐屬植物苦參的干燥根,具有清熱燥濕、殺蟲、利尿等功能1，已用作苦味健胃劑、利尿劑、消炎藥、止瀉藥和驅蟲藥2。苦參中的化學成分主要分為生物堿和黃酮兩大類3,早期的研究主要側重在苦參生物堿類方面,自20世紀70年代開始,國內外對苦參黃酮類化合物的化學成分及藥理作用的研究漸多,并取得了大量研究成果4

6、,5，研究結果發現苦參中黃酮類化合物具有廣泛的生理作用和藥用價值6。超臨界流體萃取(Supercritical Fluid Extraction,SFE)是近年來發展起來的新型提取技術，它同經典的樣品處理方法(如索氏抽取，液液萃取等)相比具有快速、高效，選擇性好，污染小、耗樣品量少，可與其它分析技術聯用等優點，已廣泛應用于中藥、食品、香料等有效成分的提取和研究等方面711。本研究利用乙醇做夾帶劑12，采用正交設計法對苦參中黃酮類物質的提取工藝進行了優選, 并對提取物進行初步的定性分析，旨在為進一步開發苦參總黃酮提供理論、實踐依據。1 材料與儀器1.1 儀器DGF-100高速萬能粉碎機（黃驊市綜

7、合電器廠）;賽多利斯 BS124S電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；SFE-2超臨界流體萃取儀（美國應用分離公司）；UV2000 型紫外可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有有限公司)；RE- 52A 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）； UV- 240 全波長掃描儀（日本島津）。1.2 試劑苦參（產自內蒙，由河北安國市昌達中藥材有限公司提供）；蘆丁（購自上海試劑廠，含量不低于98.5%），其它試劑均為國產分析純。2 方法2.1 黃酮類化合物提取工藝研究2.1.1 樣品的處理苦參自然風干，用高速萬能粉碎機粉碎, 過4060目篩。2.1.2 標準曲線繪制精密稱取蘆丁對照品160.000 mg置于10

8、0 ml容量瓶中，加60%乙醇溶解，定溶。精密吸取0，0.5，1，1.5，2，2.5（ml）分別置于25 ml的容量瓶中，加60%乙醇溶液至12.5 ml，混勻。加5%的亞硝酸鈉0.75 ml,放置6 min，再加10%的硝酸鋁0.75 ml,放置6 min。加4%的氫氧化鈉10 ml，最后加水至刻度線，放置10 min后，以空白作參比，510 nm處測其光吸收值，以吸光值為縱坐標，蘆丁重量為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=0.395 9X+0.010 4，相關系數R2=0.999 6。2.1.3 總黃酮的測定精密稱取一定量苦參粉末，裝入萃取釜，調節至設定的參數（萃取壓力，萃取溫度、夾帶

9、劑的流速和萃取時間）進行超臨界萃取，收集萃取物，減壓濃縮得總黃酮樣品溶液,取1 ml樣液按“2.2”項步驟依次加入其它試劑，定容至25 ml容量瓶中測其光吸收值，根據回歸方程計算總黃酮的得率。總黃酮得率(%)=提取物中總黃酮質量原料質量× 100%2.1.4 正交實驗工藝設計通過單因子實驗結合正交實驗的方法探索超臨界流體提取苦參中黃酮類化合物最佳工藝條件，在單因素實驗的基礎上，選擇對提取得率影響較大的4個因素萃取的溫度，萃取的壓力，作用的時間和乙醇的流速，3個水平進行優化研究，其正交實驗工藝設計詳見表1。表1 正交實驗工藝設計（略）2.1.5 夾帶劑的選擇苦參中除含有黃酮類化合物外，

10、還含有苦參堿、可溶性淀粉、多糖等。提取苦參黃酮常用的溶劑有水、醇等，可溶性的淀粉、多糖等易溶于水中，使得苦參提取物雜質太多，造成后續純化困難。常用甲醇、乙醇做萃取液，由于弱極性的苦參黃酮較易溶于弱極性的有機溶劑中而水溶性淀粉、多糖在該相中溶解度低從而提高了純度，考慮到甲醇的毒性及食用安全性，本實驗選用無水乙醇做夾帶劑進行萃取。2.1.6 乙醇的流速對黃酮提取的影響固定其它條件不變，考察乙醇的流速不同對苦參中黃酮類化合物提取率的影響。乙醇流速在0.2 ml/min時有一轉折點，加大乙醇流速總黃酮得率有所增加。生產上考慮到設備和成本的因素，乙醇流速不宜大于0.4 ml/min。2.1.7 萃取溫度

11、對苦參黃酮類化合物提取量的影響固定其它條件不變，考察溫度的變化對苦參中黃酮類化合物提取率的影響。超臨界萃取的溫度對提取率的影響較為復雜，因為其受到超臨界流體密度與乙醇飽和蒸氣壓的影響。當壓力較低時，溫度對超臨界流體密度的影響要比對乙醇飽和蒸氣壓的影響大，溫度升高使流體密度減小，從而乙醇的溶解度也隨之減小；當壓力較高時，溫度對乙醇飽和蒸氣壓的影響要比對流體密度的影響大，乙醇的飽和蒸氣壓隨溫度升高而增高的量要比流體密度隨溫度升高而減小的量大 11。在所取的這段區間內苦參中黃酮提取量隨溫度的升高先增后減，在40時萃取量最大。2.1.8 萃取壓力對苦參中黃酮類化合物提取的影響固定其它條件不變，考察萃取

12、壓力的變化對苦參中黃酮類化合物提取率的影響。萃取壓力在小于30 MPa時，提取率雖壓力的增大而增大，高于30 MPa時提取率反而降低。2.1.9 萃取時間對黃酮提取的影響固定其它條件不變，考察萃取時間的不同對苦參中黃酮類化合物提取率的影響。在萃取時間達到80min后，萃取結果達到最大。2.1.10 正交實驗結果正交實驗結果及極差分析如表2所示。由極差分析結果得出，對苦參中總黃酮提取得率影響的主次因素為：乙醇的流速提取的溫度作用的壓力提取的時間。超臨界CO2流體萃取苦參中黃酮類化合物最佳因素的水平組合：A1B2C2D3。即最佳試驗組合為溫度30，壓力30 MPa，乙醇流速0.4 ml/min，時

13、間60 min。經超臨界CO2萃取的苦參黃酮類化合物，色澤金黃，純度高，無異味，無溶劑殘留。2.2 黃酮類化合物定性分析132.2.1 顏色反應取最佳條件下的苦參提取液10 ml分別置于5只試管中，依次加入FeCl3、鹽酸鋅粉、硼酸-檸檬酸、NaOH、H2SO4(濃)，反應劇烈，且反應后出現明顯的顏色變化。結果見表3。表2 正交實驗結果及極差分析（略）表3 苦參中黃酮類化合物的顏色反應（略）根據相關文獻報道14，用黃酮類化合物標準品分別與上述化學試劑在不同pH條件下反應從而得到各反應產物對應的表觀顏色作為黃酮類化合物初步定性研究的依據。本實驗據此原理分析，實驗過程中各試管出現的顏色變化，與黃酮

14、類化合物標準品反應現象相符。顏色反應結果顯示，從苦參中所提化合物為黃酮類化合物。2.2.2 熱穩定性取最佳條件黃酮類化合物提取液5份，每份3 ml分別置于10 ml離心管中，分別在30，50，70，90，100水浴中加熱1 h，冷卻后于UV-240全波長掃描儀在190700 nm范圍內進行掃描。經過不同溫度處理過的黃酮類化合物其掃描曲線無明顯變化，其最大吸收峰均在320 nm附近，符合文獻報道的黃酮類化合物（C6-C3-C6）最大吸收峰對應的波長區域，進一步驗證了提取物為黃酮類化合物，且具有很好的熱穩定性。2.2.3 光穩定性分別取最佳條件去黃酮類化合物的提取液3份，每份3 ml，其中一份用紫

15、外光照射4 h，紫外光的功率為40W，照射距離0.6 m；另外兩份其中一份在室內光照，另一份放在暗處保存4 h后于UV-240全波長掃描儀在190700 nm范圍內進行掃描。不同光照處理的黃酮提取液全波長掃描曲線基本無變化，苦參中黃酮類化合物具有很好的光穩定性物。3 結論超臨界CO2流體萃取法從苦參中提取黃酮類化合物操作簡單、活性成分保存好、提取物純度高, 安全無毒,不存在溶劑殘留問題。通過單因子實驗和正交實驗結合的方式較準確地探索出了苦參中黃酮類化合物的最佳提取工藝，數據可靠，具有良好的重復性。本實驗采取文獻13中報道黃酮類化合物定性研究的3 種方法，通過對不同溫度和光照強度處理過的苦參提取

16、物進行190700 nm 波長段的掃描曲線研究，表明其具有較強的光穩定性和熱穩定性，且最大光吸收值位于320 nm左右。顏色反應表明該提取物與各種試劑，在不同pH 條件下具有明顯反應特征，3種定性實驗結果與文獻報道完全相符合，確定所提取物為黃酮類化合物，為定性研究提供簡便易行的研究方法。本實驗為進一步開發研究苦參中總黃酮提供理論、實踐依據。【參考文獻】1國家藥典委員會.中國藥典，部S.北京:化學工業出版社, 2000161.2肖培根.新編中藥志，第1卷M.北京:化學工業出版社，2002：555.3趙慧娟，孫文基. 苦參中黃酮類化合物的化學成分及藥理研究進展J.中藥材，2005，28（3）：24

17、7.4Guan Ye, Hai-Yan Zhu, Zhi-Xiong Li, et al.LC-MS characterization of efficacy substances in serum of experimental animals treated with Sophora flavescens extractsJ.Biomedical Chromatography，2007，21: 655.5陳仲新，羅敏.苦參的藥學研究評價J.中醫藥學刊，2003，21(11)： 1982.6王靜妮，侯華新.苦參中黃酮成分的藥理研究進展J.海峽藥學，2006，18（1）：14.7李志平，尹篤林，胡江宇，等.超臨界二氧化碳萃取茵陳蒿黃酮類化合物的研究J.林產化學與工業，2006，26（3）：66.8劉江鄒,周榮琪. 竹葉提取物總黃酮含量測定方法的改進J.食品科技, 2005,7:76.9陳嵐，滿瑞林.超臨界萃取技術及其應用研究J